Name: 電気生理学的実験のための人工二重層の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ人工二重層の準備法。神経科学・バイオ物理学・電気生理学の研究に用いる平面脂質二重層の作製、電極のセットアップ、クリーニング手順を詳しく解説。イオンチャネルの単一チャネル測定に適した実験環境を構築する方法を紹介する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

をご覧ください<a href="http://springerprotocols.com/index.vm">シュプリンガープロトコルを</a>人工脂質二重層を作製し、膜の弾力性をプロービングするためのグラミシジンのチャンネルを使用する方法の詳細については。

著者に開示すべき事項はありません。

電気生理学的実験のための人工二重層の準備

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

また、人工脂質二重層と呼ばれる平面脂質二重膜を使用すると、イオン伝導性、明確に定義された環境でのチャネルを調べることができます。これらの脂質二重層は、膜活性ペプチド、脂質二重層の特性の変化は、二重層貫通チャネルの機能を変化させる方法上のイオンチャネルまたは調査の再構成の特性評価など、さまざまな研究、に使用することができます。ここでは、平面二重層を形成する方法および二重層から小さなパッチを分離する方法、および2番目のビデオでも、脂質二重層弾性特性の変化を決定するグラミシジンのチャンネルを使用するための手順をデモンストレーションを示しています。我々はまた、二重層のチャンバーの準備に必要な個々のステップ、電極とどのように二重層がシングルチャネルの測定に適していることをテストすることを示しています。

また、人工脂質二重層と呼ばれる平面脂質二重膜を使用すると、イオン伝導性、明確に定義された環境でのチャネルを調べることができます。ここで、我々は、電極の二重層室を準備するために必要な個々のステップを示し、どのように二重層がシングルチャネルの測定に適していることをテストする。

平面脂質二重層（人工脂質二重層とも呼ばれる）を用いることで、十分に定義された環境下でイオン伝導チャネルを研究することが可能です。これらの二重層は...

こんにちは。ニューヨーク市のウェイルコーネル医科大学、生理学・生物物理学部のオラフ・アンダーソンです。こんにちは。オラフ・アンダーソン博士の研究室でMD PhD課程に在籍しているルチ・カウルです。こんにちは。ジョン・キムです。私はリサーチテクニシャンです。今日は、平面脂質二重膜を用いたシングルチャネル実験の準備方法について解説します。チャンバーの準備方法と、Bilayer Punch電極の準備方法について説明します。測定を行う膜の微小領域を分離させて使用しました。それでは、始めていきましょう。我々の電気生理学的セットアップは、機械的振動を最小限に抑えるための空気懸浮式防振台、電気的ノイズ、音、および振動を遮断するためのファラデーケージ、そしてスタンドで構成されています。バイレイヤーチャンバーには、温度制御のためにチャンバーを設置するための循環水ジャケットと、パッチクランプアンプのヘッドステージを装着するためのマイクロマニピュレーターを使用します。パッチクランプアンプからの出力をさらに500 hertzでフィルタリングするために、電子フィルタユニットを使用します。電流遷移を可視化するため、パッチクランプアンプおよび電子フィルタの両方からの電流信号を表示するオシロスコープを使用します。最後になりますが、パッチクランプ信号をデジタル化するデータ収集システムを搭載したコンピューターが必要です。サンプリングレート20 kilohertzにおいて、データ記録および解析には自社開発のソフトウェアを使用します。すべての機器は、開始の20分前に電源を入れておきます。次に、実験を行うチャンバーを準備します。チャンバーは、厚さ約100ミクロンの薄いテフロンシートで作られたセプタムによって2つの領域に分割されており、内部には電解質溶液が満たされています。セプタムにある穴を介してバイレイヤーを形成することで、電解質溶液同士を接続します。穴の直径は1〜1.5 mmにする必要があります。石油ゼリーをシーリング材として使用し、テフロンチャンバーの前半分にガラス窓を配置します。1つの金属製ブレースと後方チャンバー半分の4つの穴にステンレス製ネジを通します。石油ゼリーをシーリング材として使用し、組み立てられたチャンバーの両半分に挟まれるように円形のテフロン製パーティションを配置します。仕切り板の穴が中心にあることを確認します。電解質コンパートメントの水密性と電気的な絶縁性を確保するため、仕切り板の両側にワセリンを塗布します。続いて、チャンバーの前半分と前面の金属製ブレースにネジを通します。アセンブリを締め付けてすべてのコンポーネントをしっかりと固定しますが、チャンバーの洗浄および पेट्रोलियमジェリーの除去ができるよう、締めすぎないようにしてください。パストゥールピペットを火で熱し、先端を研磨して直角に曲げます。ピペットを研磨して先端を滑らかにすることで、ガラスやテフロンへの傷を防ぐことができます。次に、クロロホルムとメタノールの2:1混合液またはfch溶液を用いてチャンバーを洗浄します。ピペットを使用し、テフロンやガラス全体に塗り広げないように注意しながら、fch溶液で余分な पेट्रोलियमジェリーを除去してください。fch溶液は少なくとも10倍量使用してください。これが完了したら、各チャンバーにマグネチックスターラーバーを加えます。次に、95% ethanolでチャンバーを洗浄します。最後に、蒸留水、超純水、またはそれに相当する高純度水で洗浄します。これまでと同様に、火炎滅菌したパステスを用い、ピペットで液体を吸引します。最後に、エタノールと水で洗浄を繰り返します。その後、水、エタノール、およびfolで洗浄します。次に、チャンバーの後部コンパートメントへの電気的接続として機能するガラス電極マイクロピペットを作製します。Sutter Instruments社のP-97 フレーミングブラウン・マイクロピペット・プラーを用いて、ガラスキャピラリーを延伸し、鋭く短いテーパーを持つマイクロピペットを2本作製します。外径0.8 mm、内径0.5 mmのホウケイ酸ガラス製キャピラリーを使用します。ガラスキャピラリーをプラーにセットし、フィラメントを引き込む準備のために固定します。白金で十分な成果が得られなかったため、電極極は白金で作成する必要があります。タングステンフィラメントを用いて電極極にピペットを引いた後、次の数ステップを白金フィラメントを備えたマイクロフォージで実行します。マイクロフォージを使用する前に、フィラメントがガラスで十分にコーティングされていることを確認してください。ソフトソーダライムガラスまたはハードホウケイ酸ガラスのいずれかを使用できます。マイクロフォージの熱を調整し、ガラスがスムーズに流れ、フィラメントを薄い層で均一に覆うようにしてください。次に、マイクロピペットをマイクロフォージに取り付け、チップを破断させます。比較的低い熱を加えてフィラメント上のガラス被覆を緩やかに軟化させます。次に、マイクロピペットのチップをフィラメント上のガラス被覆に向けてゆっくりと移動させ、2つが融着するようにします。フィラメントの加熱を停止すると、フィラメントが収縮し、ピペットが破断します。これにより、直径約30 micronsの鋭く均一な開口部が形成されます。再びマイクロフォージを使用し、マイクロピペットの先端から3～4 mmの箇所に直角の曲げ加工を施します。ピペットをフィラメントの数百μm上に配置し、加熱してフィラメントが赤くなるまで待ちます。熱膨張によりフィラメントが移動します。その後、ピペットをゆっくりとフィラメント上に下ろすと、フィラメントが曲がります。フィラメントの加熱温度によって曲げ量を調節します。曲がりが約80度になったところで、ピペットを素早く上方向および前方へ移動させます。これにはある程度の協調動作が必要です。同じ設定を使用して、最終的に90度の曲げを形成します。マイクロピペットチップを火炎研磨し、フィラメントがガラスでコーティングされた状態を維持します。次に、ベンゼンに溶解させた10%トリオクチルシラン溶液を用いて、ピペットチップをシリル化します。これによりピペット表面が疎水性となり、メンブレンと良好に相互作用します。毛細管現象によって、溶液をピペット内に数ミリメートル吸い上げます。マイクロフォージを用いて弱熱で溶液を蒸発させれば完了です。それでは、銀電極の作製方法を説明します。直径約1 mmの5 cmの銀線を準備します。これを内径2〜3 mmになるように3〜4回巻いてコイル状にします。残りの部分は、ヘリックスに対して直角に曲がるようにテールとして残します。このテール部分と、銀線の隣接する5〜10 mmを溶融塩化銀でコーティングします。次に、二層形成溶液を調製します。本研究では、デカンの中の脂質ダイアルホスファチジルコリンを用いました。この脂質は、脂質とクロロホルムの混合液150 µLとして、ガラスチューブに入れ-40 °Cで保存されています。冷凍庫からガラスチューブを取り出し、室温に戻した後、乾燥窒素気流下でクロロホルムを蒸発させます。化学フード内で、50 µLのエンドデカンを加え、ボルテックスします。バイレイヤー形成溶液と、バイレイヤーを形成させる穴の周囲のテフロンとの密着性を高めるため、穴の周囲のテフロン製パーティションを塗り直します。まず、火炎研磨したパストゥールピペットをfchで洗浄します。次に、洗浄したピペットを2.5%phospholipid in end decaneに浸し、脂質がピペット内に約1mm上昇するようにします。テフロン製パーティションの穴の上に、脂質を一滴滴下して膜を作ります。脂質を約10〜15分間乾燥させ、この操作を繰り返します。こんにちは。本日は、シングルチャネル実験用の脂質二重層の調製方法をご紹介しました。付随するビデオでは、膜の小さなパッチの分離方法、シングルチャネル活性の記録方法、低分子による活性の修飾方法、および結果の解析方法について説明します。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

preparation-of-artificial-bilayers-for-electrophysiology-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。ここで、我々は、脂質のbilyerの上部のリーフレットにシナプス形成を調節し、全反射顕微鏡を用いてシナプス形成を可視化するために知られている細胞接着タンパク質を固定するための方法を示しています。...

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

膜タンパク質の機能は、細胞膜の脂質組成によって調節されている。どのように二重層パッチ電極を使用してパッチを形成するだけでなく、改変された膜特性の記者としてグラミシジンのチャンネルを使用する方法をこのビデオ -...

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。...

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

細菌機械受容チャネル​​は、生体分子デバイスでmechanoelectricalトランスデューサとして使用することができます。そのようなデバイスへの液滴のインタフェース二重層（DIBを）、セル風のビルディングブロックは、機械受容チャネル​​を組み込むと刺激する新しいプラットフォームを表します。ここでは、機械的な刺激の下で機械受容チャネル​​の研究を可能にする、のDIBを形成する新しいマイクロピペットベースの方法を示しています。...

液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

私たちは、保存可能な、可搬型の脂質二重層形成システムを実証します。凍結した膜前駆体を周囲温度にしたときに脂質二重膜は、80％以上の成功率で1時間以内に形成することができます。このシステムは、イオンチャンネルに関連した面倒なプロセスと専門知識を軽減します。...

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

ここでは、連絡先バブル膜法を用いた脂質膜の形成のためのプロトコルを提案する.有機溶媒、油水界面単分子層を形成するという水のバブルが吹かれます。2...

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

ソフト、低消費電力、生体分子 memristors は活用と同様の組成、構造、およびスイッチング バイオ シナプス機構です。ここで紹介を組み立てるし、生体分子 memristors を特徴付けるプロトコルは絶縁油中水滴間に形成される脂質二重層から取得します。メムリスティブ イオン伝導膜の電圧作動したアラメチシン...

アセンブリおよびイオン チャネルをドープした脂質膜から成る分子 Memristors のキャラクタリゼーション

このプロトコルは、溶融温度の上昇を伴う脂質の脂質単層アセンブリおよび液滴界面二重層形成を促進するためのフィードバック温度制御加熱システムの使用、および膜の温度駆動変化を特徴付ける容量測定の詳細を示す。...

液滴界面二層の温度制御アセンブリと特性

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。...

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

グラミキシジンAドープされた液滴界面二重層を組み立て、電気刺激し、解析する実験プロトコルを提示します。脂質-タンパク質の構造-機能関係は、膜面積、イオンフラックス、単一チャネル伝導の変化を測定し、これらの応答を電気シナプスに着想を得た膜モデルにおける可塑性様のイオン伝導変化と関連付けることで定量化されます。...

液滴界面二重層を用いた脂質-タンパク質膜構造-機能の特徴解析

学ぶ人工二重層の準備法。神経科学・バイオ物理学・電気生理学の研究に用いる平面脂質二重層の作製、電極のセットアップ、クリーニング手順を詳しく解説。イオンチャネルの単一チャネル測定に適した実験環境を構築する方法を紹介する。

電気生理学的実験のための人工二重層の準備

さらに動画を探す