5.2: 磁気活性化細胞選別(MACS):胸腺Tリンパ球の単離

1. 準備

1. 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
2. すべての解剖ツールを洗剤で洗い、次に70%のエタノールで洗い、清潔なペーパータオルで乾かします。
3. 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の200 mLを調調します。

2. 解剖

1. スピーヌ位置の解剖プレートに安楽死マウスをピン留めします。
2. はさみと鉗子を使用して、胸腔にアクセスするために縦腹腔切り目を行います。
3. 心臓の上に位置する胸腺へのアクセスを得るために心臓を削除します。次に、2つの白い葉で構成され、心臓の上の胸腔に位置する胸腺を識別します。
4. 鉗子を使用して慎重に胸腺を取り外し、HBSS 2%FCSの5 mLでペトリ皿の上に置きます。

3. 免疫細胞分離

1. 同じペトリ皿の上に40 μmセルストレーナーに胸腺を置きます。同じ皿でそれを解離するためにプランジャーで胸腺をつぶします。
2. 解離した胸腺と流体を15 mL遠心管に移します。
3. 5 mLのHBSS 2%FCSでペトリ皿を洗浄し、洗浄した媒体も同じ遠心管に移します。
4. チューブを20°Cで7分間370 x gで遠心し、ペレットを避けて上清を捨てます。
5. 赤血球をlyseseにアセテートカリウムの2mLで再濁させる。2 分間待ってから、HBSS 2% FCS を使用して最大 14 mL の音量を構成します。
6. 20°Cで7分間370 x gでチューブを再度遠心分離します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの5 mLでペレットを再懸濁します。
7. トリパンブルー染色アッセイを用いて細胞濃度を推定し、HBSS 2%FCSの適切な体積を用いて最終細胞濃度を10⁷細胞/mLに調整する。

4. 免疫細胞の磁気標識

1. FACSチューブを2本取ります。1つのチューブに「非濃縮T細胞」、および他のチューブを「濃縮T細胞」と標識し、磁気標識を用いて分離する。
2. 2つのFACSチューブのそれぞれに細胞溶液を分配する。
3. 20°Cで3分間370 x gで「濃縮T細胞」チューブを遠心分離し、ペレットを避けて上清を廃棄します。
4. 抗CD3ビオチン化抗体ミックスの250μLでペレットを再ステースする(表1、ミックス1)。

表1:抗体混合組成物。ミックス1と2は磁気分離に使用されます。ミックス3は、磁気分離後の細胞濃縮を評価するために使用される。

5. 細胞懸濁抗体混合物を暗闇の4°Cで15分間インキュベートする。
6. 両方のチューブにHBSS 2%FCSの3 mLを追加し、20°Cで3分間370 x gで再度遠心分離します。
7. 上清を廃棄し、250 μL連鎖アビジン結合ビーズでペレットを再懸濁します(表1、ミックス2)。
8. 細胞混合物とビーズを氷の上で20分間インキュベートします。
9. 次に、HBSS 2%FCSの3 mLを追加し、20°Cで3分間370 x gで再びよく混ぜて遠心分離機を混ぜます。
10. HBSS 2% FCSの2 mLでペレットを再中断します。

5. CD3陽性細胞の磁気分離

1. 磁石の上にカラムを置き、HBSS 2%FCSの3 mLを加えてシステムを加湿させます。5分間待ちます。
2. 次に、ラベル付きセルを柱にピペトします。
3. セルサスペンションがカラムを通過した後、HBSS 2%FCSの3 mLでカラムX3を洗浄します。
4. 次に、磁石からカラムを取り出し、15 mLの回収管に入れます。
5. 標的細胞を溶出させるには、HBSS 2%FCSの5 mLをカラムに追加し、カラムをプランジャーで洗い流します。
6. HBSS 2% FCSの別の5 mLで溶出ステップを繰り返します。

6. フローサイトメトリーによる標的細胞濃縮の評価

1. 「濃縮T細胞」と標識されたFACSチューブに500μLのeluted細胞懸濁液を移す。「非濃縮T細胞」懸濁液の200μLを第2のFACSに移す。
2. 次いで、20°Cで7分間370 x gで両方のチューブを遠心分離します。
3. 上清を廃棄し、次に100μLの蛍光抗体ミックス3(表1参照)を両管に添加する。
4. 暗闇の中で4°Cで20分間両方のチューブをインキュベートします。
5. 次に、チューブにHBSS 2%FCSの3 mLを追加し、20°Cで3分間370 x gで遠心分離します。
6. 上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの250 μLで各チューブを再懸濁します。
7. ここで、フローサイトメトリーによるCD3陽性細胞濃縮率を評価する。

7. データ分析

1. 「FlowJo」アイコンを開き、「すべてのサンプル」ウィンドウで各チューブのファイルをドラッグします。
2. 「エンリッチされたTセル」ファイルをダブルクリックすると、X軸上に前方散布図(FSC-A)を表示するドットプロットとY軸上のサイドスキャッタ(SSC-A)が表示されます。
3. リンパ球集団を囲む「ポリゴン」をクリックします。
4. 次に、円で囲まれた人口をダブルクリックして新しいウィンドウを作成します。
5. Y 軸の"FSC-W"と X 軸の"FSC-A"を選択し、FSA-W 負のセルを丸で囲みます。「亜集団識別」ウィンドウで、セル母集団に「単一細胞」という名前を付けます。
6. 円で囲まれた人口をダブルクリックして、新しいウィンドウを作成します。Y 軸で「CD3」を選択し、CD3 陽性セルを丸で囲みます。「サブ人口識別」ウィンドウで、セル母集団に「T セル」という名前を付けます。
7. 「非濃縮T細胞」で繰り返します。
8. セルの人口を視覚化するには、[レイアウトエディタ]をクリックし、"Tセル"母集団を "エンリッチト T セル" ファイルと "非エンリッチト T セル" ファイルからタブにドラッグします。
9. CD3+リンパ球を表すドットプロットが表示されます。CD3+ 細胞は、CD3+ 濃縮チューブの対象の集団にのみ現れる必要があります。
10. ソートされた細胞におけるCD3+リンパ球の濃縮を評価するには、「テーブルエディタ」をクリックし、「濃縮T細胞」および「非濃縮T細胞」ファイルから「T細胞」母集団をテーブルにドラッグします。
11. 「統計」メニューで、[リンパ球の頻度]細胞を選択して、すべてのリンパ球の CD3+ 細胞の割合を確認し、[テーブルを作成]をクリックします。
12. パラメータ値が新しいテーブルに表示されます。「濃縮T細胞」の場合、CD3+細胞の周波数は約80%である必要があります。

磁気活性化セルソーティング(MACS)は、研究者が表面に発現する特定のエピトープに基づいて細胞を分離することを可能にする技術です。

このプロセスは通常、胸腺などの臓器や組織の抽出から始まります。次に、組織が単一の細胞に解離するまで、通常は粉砕によって細胞を機械的に分離します。この段階では、化学物質を添加することで不要な細胞を除去できます。例えば、塩化アンモニウム-カリウム、またはACK緩衝液は、不要な赤血球を溶解するために使用できます。

次に、ビオチンという分子に結合した抗体を懸濁液に加えると、これらの複合体が標的細胞の表面のエピトープに結合します。ビオチンは、ストレプトアビジンという別の分子に対して高い親和性を持っています。次のステップでは、磁気ビーズに融合したストレプトアビジン分子を抗体標識細胞に添加します。ビオチンとストレプトアビジンが接触すると、それらはしっかりと結合します。その結果、目的の細胞は磁気ビーズでコーティングされます。この複合体は、サンドイッチと呼ばれることもあります。この場合、底部の細胞膜にCD3を、次に抗CD3をビオチンに結合させ、最後にストレプトアビジンを磁気ビーズに結合させます。

これらの標識された細胞は、重力の助けを借りて細胞が磁石によってゆっくりと通過することを可能にするマトリックスを含むカラムに配置することができます。その際、磁気ビーズで標識された細胞は磁石に最も近いチューブの端にくっつき、標識されていない細胞は下の採取チューブに続きます。次に、磁石を取り外し、溶離液を追加し、プランジャーで穏やかな圧力を加えてカラムから取り出し、新しい収集チューブにフラッシュすることで、標識された細胞をカラムから取り外すことができます。最終的に、このプロセスにより、目的の細胞の60〜98%の回収が可能になります。

この手順では、マウスから胸腺白血球を単離し、MACSを用いてCD3陽性T細胞を選別した後、FACSを用いた選別の有効性を確認します。

まず、白衣や手袋など、適切な保護具を着用します。次に、解剖ハサミと鉗子を70%エタノールで洗い、清潔なペーパータオルで乾かします。次に、4ミリリットルのFCSと196ミリリットルのHBSSを混合して、200ミリリットルのHBSS 2%子牛胎児血清(FCS)を調製します。

安楽死させたマウスを仰臥位で解剖プレートに固定します。はさみと鉗子を使用して、縦方向の開腹術を行い、胸腔にアクセスします。まず、心臓を取り外して、心臓の上にある胸腺にアクセスします。次に、2つの白い葉で構成されている胸腺を特定します。鉗子を使用して、胸腺を慎重に取り外し、5ミリリットルのHBSS 2%FCSを入れたペトリ皿の上に置きます。

免疫細胞を単離するには、まず胸腺をペトリ皿の40マイクロメートルの細胞ストレーナーに置きます。ティッシュをプランジャーで粉砕して、皿に解離させます。この後、プランジャーとストレーナーをHBSS 2% FCSですすいで、付着した細胞を回収します。次に、解離した胸腺細胞と液体をペトリ皿から15ミリリットルの遠心チューブにピペットで移します。ペトリ皿を5ミリリットルのHBSS 2%FCSで洗浄し、この洗浄液を15ミリリットルの遠心分離管にも移します。

次に、チューブを370倍gで摂氏20度で7分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを2ミリリットルのACK溶解緩衝液に再懸濁して赤血球を溶解します。ベンチトップで室温で2分間インキュベートします。次に、HBSS 2%FCSで容量を14ミリリットルにします。チューブを370倍gで20°Cで7分間遠心分離します。次に、上清を捨て、細胞を5ミリリットルのHBSS 2%FCSに再懸濁します。

Bリンパ球のFACS単離のためのプロトコルで示されているようにMalassezスライドを使用して細胞濃度を推定し、HBSS 2%FCSで細胞濃度を10〜7細胞/ミリリットルに調整します。

500マイクロリットルの細胞溶液を2本のFACSチューブに移します。一方のチューブに非濃縮T細胞を標識し、もう一方のチューブに濃縮されたT細胞を標識し、磁気標識を使用して分離します。

濃縮T細胞チューブを370 g gで20°Cで3分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットをHBSS 2% FCSで400分の1に希釈した250マイクロリットルのビオチン共役抗CD3抗体に再懸濁します。細胞を氷上および暗闇で20分間インキュベートします。チューブにHBSS 2%FCSを3ミリリットル加え、再度370gで20°Cで3分間遠心分離します。上清を捨て、HBSS 2% FCSで5分の1に希釈した250マイクロリットルのストレプトアビジン結合ビーズにペレットを再懸濁します。細胞とビーズの混合物を氷上で20分間インキュベートします。次に、チューブにHBSS 2% FCSを3ミリリットル加え、ピペットで上下させて混合し、再度370gで20°Cで3分間遠心分離します。ペレットを2ミリリットルのHBSS 2%FCSに再懸濁します。

カラムを磁石の上に置き、3ミリリットルのHBSS 2%FCSを追加してシステムを加湿します。次に、染色した細胞をカラムにピペットで移します。細胞懸濁液がカラムを通過した後、カラムを3ミリリットルのHBSS 2%FCSで3回洗浄します。次に、マグネットからカラムを取り外し、15ミリリットルのチューブに入れます。ターゲット細胞を溶出するには、5 mL の HBSS 2% FCS をカラムに加え、プランジャーでカラムをフラッシュします。さらに5ミリリットルのHBSS 2%FCSでこの手順を繰り返します。

標的細胞単離の有効性を評価するには、まず溶出した細胞懸濁液500マイクロリットルをFACSチューブに移し、濃縮T細胞を標識します。次に、濃縮チューブと非濃縮チューブの両方を370 gで摂氏20度で7分間遠心分離します。上清を捨て、HBSS 2% FCSで200分の1に希釈した蛍光抗体100マイクロリットルを両方のチューブに加えます。細胞を氷上および暗闇で20分間インキュベートします。次に、チューブにHBSS 2%FCSを3ミリリットル加え、摂氏20度で370倍gで3分間遠心分離します。上清を捨ててから、ペレットを250マイクロリットルのHBSS 2%FCSに再懸濁します。次に、FACSプロトコルに示されているように、フローサイトメトリーを使用してCD3陽性細胞の濃縮速度を評価します。

次に、マウスの胸腺から単離されたすべての胸腺細胞のうち、CD3陽性リンパ球の頻度を決定します。開始するには、FlowJoアイコンをダブルクリックし、すべてのサンプルウィンドウで各チューブのファイルをドラッグします。次に、エンリッチされたT細胞ファイルをダブルクリックすると、そのサンプルから記録された細胞が、x軸に前方散乱光FSCA、y軸に側散乱光SSCAが表示されるドットプロットに表示されます。

ポリゴンをクリックして、リンパ球集団を丸で囲みます。次に、丸で囲まれた母集団をダブルクリックして、新しいウィンドウを作成します。y軸でFSC-Wを選択し、x軸でFSC-Aを選択し、FSA-Wのネガティブセルを丸で囲みます。サブポピュレーション識別ウィンドウで、セルポピュレーションにSingle Cellsという名前を付けます。次に、サブポピュレーション識別ウィンドウで[OK]をクリックし、丸で囲まれたポピュレーションをダブルクリックして新しいウィンドウを作成します。y軸でCD3を選択し、CD3陽性細胞を丸で囲みます。サブポピュレーション識別ウィンドウで、細胞ポピュレーションにT-cellsという名前を付けます。非濃縮T細胞ファイルで繰り返します。細胞集団を視覚化するには、レイアウトエディターをクリックし、濃縮T細胞ファイルと非濃縮T細胞ファイルからT細胞集団をタブにドラッグします。

CD3陽性リンパ球を表すドットプロットが表示されます。CD3陽性細胞は、CD3陽性濃縮チューブ内の目的の集団にのみ現れるべきです。選別した細胞におけるCD3陽性リンパ球の濃縮を評価するには、Table Editorをクリックし、濃縮T細胞ファイルと非濃縮T細胞ファイルからT細胞集団を表にドラッグします。統計メニューで、[リンパ球細胞の頻度]を選択して、すべてのリンパ球のCD3陽性細胞の割合を確認します。次に、[テーブルの作成] をクリックします。パラメータ値は新しいテーブルに表示されます。濃縮T細胞の場合、CD3陽性細胞の頻度は約80%以上である必要があります。