ELISAアッセイ:間接、サンドイッチ、競争力

1. 間接エリサ

間接ELISAは、一次抗原特異的抗体が二次共役抗体によって認識されるものです。以下のプロトコルは、インフルエンザAウイルス(IAV)感染マウスの血清サンプルがIAV特異的IgG抗体の存在について試験される間接ELISA法の一例である。この実施例の1つの強みは、すべての抗体アイソタイプまたは特異的アイソタイプ(例えば、IgG)を認識する異なる二次抗体を使用することができることです。

マイクロプレートへのコーティング抗原

1. 精製抗原の50μL(精製A/PR/8インフルエンザA型ウイルスの2mg/mL)を0.05Mトリス-HClバッファー(pH 9.5))でプレートの各ウェルに配管することにより、精製抗原を精製した96ウェルELISAプレートのウェルをコーティングします。
2. 粘着カバーでプレートを覆い、4°Cで一晩インキュベートし、抗原がプレートに結合できるようにします。
3. インキュベーション完了時に、プレートをシンクの上にフリックしてコーティング溶液を取り除きます。

ブロック

4. 200 μLブロッキングバッファーを添加して被覆ウェル内の残りのタンパク質結合部位を遮断し、1X PBSで5%のロバ血清がここで使用され、ウェル当たりである。代替ブロッキング試薬は、二次抗体が生成された動物からのPBSまたは正常血清中の5%非脂肪ドライミルクまたはBSAを含む。
5. 室温で少なくとも2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
6. インキュベーションに続いて、プレートをフリックしてブロッキングバッファを取り出し、1%Tween-20を含むPBSでプレートを洗浄する。

一次抗体を用いたインキュベーション

7. 一次抗体を含む血清試料の連続希釈を調べ、1X PBSを用いて1~204,800の希釈範囲を得た。これを行うには、まず血清1:12.5を希釈し、次に4X希釈(希釈範囲 - 1:12.5〜1:204,800)を実行します。
8. 連続希釈血清サンプルの100 μLをウェルに追加します。
9. 接着剤カバー付きカバープレート、室温で1-2時間インキュベート。
10. インキュベーションに続いて、シンクの上にプレートをフリックし、1%のTween-20を含むPBSでプレートを洗浄します。

二次抗体を用いたインキュベーション

11. 酵素共役二次抗体の100μLを加え、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、HRP結合ロバ抗マウス二次二次を各ウェルに添加する。
12. プレートを室温で1時間インキュベートします。
13. インキュベーションに続いて、シンクの上にプレートをフリックし、1%のTween-20を含むPBSでプレートを洗浄します。

検出

14. 各ウェルに1mg/mLの濃度で指標基板(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB))の100 μLを追加します。
15. 室温で5〜10分間基板でプレートをインキュベートします。
16. 10分後、100 μL 2N硫酸(H2_SO4)を加えて酵素反応を停止する。
    停止溶液を添加してから30分以内に、405nmのマイクロプレートリーダーを使用してプレートを読み取り、ウェルの吸光度を決定します。

2. サンドイッチエリサ

このELISAバージョンでは、実験サンプルは、非共役捕捉抗体と共役検出抗体の間に「挟まれる」もので、どちらも同じタンパク質に特異的であるが、異なるエピトープで行われる。以下のサンドイッチELISAの例では、ヒトTNFαの濃度は、既知の標準の2.5倍のシリアル希釈から生成された標準曲線を用いて未知の試料中で決定した、組換えヒトTNFα(75pg/mLの濃度で記載)。

マイクロプレートへのコーティングキャプチャ抗体

1. 96ウェルELISAプレートのウェルを精製捕捉抗体でコーティングし、100 μLの捕捉抗体(1-10 μg/mL範囲)をプレートの各ウェルに加えます。
2. 粘着板カバーでプレートをカバーし、4°Cで一晩インキュベートします。
3. インキュベーション後、プレートをシンクの上にフリックして、プレートからコーティング溶液を取り出します。

ブロック

4. 200 μL遮断溶液、PBSを含む5%の非脂肪ドライミルクをウェルに添加することにより、抗体被覆ウェル内の残りのタンパク質結合部位をブロックする。
5. 室温で少なくとも2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
6. インキュベーションに続いて、プレートをフリックしてブロッキングバッファを取り出し、1%Tween-20を含むPBSでプレートを洗浄する。

試験サンプルを含む抗原を追加する

7. 試験サンプルの100 μLをウェルに追加します。粘着カバーでプレートを密封します。
8. 室温で1~2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
9. インキュベーション後、シンクの上にプレートをフリックしてサンプルを取り出し、1%のTween-20を含む200 μL 1X PBSでウェルを洗浄します。

酵素共役検出抗体を追加

10. あらかじめ最適化された濃度でウェルに100 μLの酵素共役検出抗体を追加します。
11. 粘着カバーでプレートを密封し、室温で2時間インキュベートします。
12. プレートをシンクの上にフリックして非結合検出抗体を取り外し、1% Tween-20を含む200 μL 1X PBSでウェルを洗浄します。

検出

13. 1 mg/mL の濃度でインジケーター基板の 100 μL を追加します。結合酵素共役検出抗体は、基板を検出可能なシグナルに変換します。
14. 室温で5〜10分間プレートをインキュベートします。
15. 5-10分後、ウェルに100 μL 2N 2N H₂SO₄を加えて酵素反応を停止します。停止溶液を添加してから30分以内に、マイクロプレートリーダーを使用してプレートを読み取り、ウェルの吸光度を決定します。

3. 競争力のあるエリサ

競争力のあるELISAのステップは、間接的およびサンドイッチELISAで使用されるものとは異なり、主な違いは、サンプル抗原と「アドイン」抗原との間の競合結合ステップです。試料抗原は、標識されていない一次抗体でインキュベートされる。これらの抗体抗原複合体は、次いで、同じ抗原で事前にコーティングされたELISAプレートに添加されます。インキュベーション期間の後、任意の結合されていない抗体が洗い流されます。ウェル内の抗原に結合するために利用可能な自由抗体の量と元のサンプル中の抗原の量との間には逆相関があります。例えば、豊富な抗原を有するサンプルは、より多くの抗原一次抗体複合体を有し、ELISAプレートに結合する非結合抗体をほとんど残さずにする。一次抗体に特異的な酵素共役二次抗体をウェルに添加し、その後基板を続ける。

マイクロプレートへのコーティング抗原

1. 96ウェルELISAプレートのウェルを1-10 μg/mLの濃度で精製抗原の100 μLでコーティングします。
2. 粘着板カバーでプレートをカバーし、4°Cで一晩プレートをインキュベートします。
3. インキュベーションの後、プレートをシンクの上にフリックして、ウェルから結合されていない抗原溶液を取り除きます。

ブロック

4. 各ウェルに200 μLのブロッキングバッファーを追加して被覆ウェル内の残りのタンパク質結合部位をブロックします。
5. プレートを室温で少なくとも2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。

一次抗体を用いたインキュベーションサンプル(抗原)

6. ウェルを遮断しながら、アッセイ中の各ウェルに対して150μLサンプル抗原及び150μLの一次抗体を混合して抗原抗体混合物を調製する。
7. この混合物を37°Cで1時間インキュベートします。

抗原抗体混合物をウェルに添加する

8. 次に、プレートをシンクの上にフリックして、ウェルからブロッキング バッファを取り外します。
9. 次に、Tween-20を含む1X PBSで井戸を洗浄します。
10. 試料抗原一次抗体混合物の100μLを添加する。
11. プレートを37°Cで1時間インキュベートします。
12. プレートをシンクの上にフリックして、サンプル混合物を取り除きます。
13. 次に、1%のTween-20を含む1X PBSでウェルを洗浄し、任意の非結合抗体を除去する。

二次抗体を追加する

14. この場合、AP結合抗体である酵素共役二次抗体の100 μLを各ウェルに添加する。
15. プレートを37°Cで1時間インキュベートします。
16. インキュベーションに続いて、1%のTween-20を含む1X PBSでプレートを洗浄します。

検出

17. 基板溶液の100 μLを各ウェルに追加します。
18. 5~10分待ちます。
19. 10分後、井戸に100μL 2N硫酸を加えて酵素反応を停止します。次いで、停止液を添加してから30分以内にマイクロプレートリーダー内の吸光度を測定する