免疫組織化学と免疫細胞化学:光顕微鏡による組織イメージング

1. 免疫細胞化学用細胞の調製

1. チャンバ付きスライドまたはチャンバ付きカバーに関心のある種子細胞は、24ウェル培養プレートのウェルに0.5 mLの細胞懸濁液を加えることによってスリップする。
   注:一部の細胞は、ポリリジンで処理されたカバースリップなど、治療されたカバースリップに成長を必要とする場合があります。最適な治療条件は、使用する細胞の種類に応じてユーザーによって決定されるべきである。
2. プレートを加湿したCO₂インキュベーターに入れ、細胞を37°Cで50~70%コンフルエントになるまで成長させます。
3. 細胞が最適な合流に達したら、各ウェルから培養培地を取り出し、0.5mLの4%PFA(1X PBSで希釈)で細胞を固定し、室温で20分間インキュベートします。
4. 固定液を取り外し、1X PBSの1 mLでウェルを3回洗います。
5. 次に、各ウェルに0.1%トリトンX-100の0.5mLを1X PBSに加えて細胞を透過化し、室温で15分間インキュベートする。
6. 透過性バッファーを吸引し、1X PBSの1 mLでウェルを3回洗浄します。
7. カバースリップ上の細胞は固定され、透過化されるようになりました。次の免疫組織化学の例について実証された染色手順に進みます- インキュベーションは、組織セクションスライド上で直接ではなく、24ウェルプレートのウェル内で行われるべきである場合を除きます。

2. 染色のためのホルマリン固定、パラフィン埋め込みセクションの調製

1. ホルマリン固定、パラフィン埋め込み組織切片を得る。

デパラフィン化

2. スライドを100%キシレンに2回、それぞれ5分間浸します。

水分 補給

3. スライドを100%エタノールに2回ずつ3分間浸します。
4. スライドを95%エタノールで3分間浸します。
5. スライドを70%エタノールで3分間浸します。
6. スライドを50%エタノールに3分間浸します。

内因性ペルオキシダーゼ活性の遮断

7. 室温で30分間、0.3%H2_O2の100mLでスライドをインキュベートします。
8. スライドを1X PBSで2回5分間洗います。

抗原検索

9. スライドをIHCク硝酸バッファー(pH6)に浸し、20分間沸騰させます。
10. ティッシュスライドは今染色の準備ができている。

3. 染色のための新鮮な冷凍、OTC埋め込みセクションの準備

1. 5mmの新鮮な分離された組織を金型に入れ、セクションが完全に覆われるまでOCTを加えます。
2. 完全に凍結するまで、ゆっくりと組織ブロックを液体窒素に沈めます。サンプルは今1年まで-80°Cで貯えることができる。
3. 断面の準備ができたら、凍結組織ブロックをクライオスタットに移し、セットアップ全体を-20°Cにします。
4. クライオスタットを使用して5〜10 μmの厚い組織切片を切断し、ブラシを使用してIHC互換ガラススライドに直接セクションを配置します。
5. スライドを室温で一晩乾燥させます。スライドはまた-80°Cで貯えることができる。
6. 室温で15分間、4%PFAの250 mLでスライドを浸し、染色前にスライドを固定します。最適な固定方法は、ユーザーが決定する必要があります。
7. スライドを1X PBSの250 mLで2回、それぞれ5分間浸します。
8. 内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、室温で30分間、0.3%H2_O2の250 mLにスライドを浸します。
9. スライドを1X PBSの250 mLで2回、それぞれ5分間浸します。
10. これで、スライドを染色する準備が整いました。

4. 染色

1. バリアペンを使用して疎水性バリアで組織を円形にします。

ブロック

2. ピペットを使用して、100 μLのブロッキングバッファー(1X PBSで希釈された馬血清)を室温で1時間にわたってセクション上に置きます。
3. ピペットを使用してブロッキングバッファを削除します。

一次抗体インキュベーション

4. 100 μL希釈一次抗体溶液(マウス抗ヒトサイクリンD1希釈1:100をブロッキングバッファーで1:100)で包まれた組織を室温で30分間インキュベートする。
5. 各スライドから一次抗体を排出し、1X PBSでスライドを5分間5分間洗浄します。

二次抗体インキュベーション

6. 希釈されたビオチン化二次抗体(ビオチン化された馬抗マウスIgG希釈1:200)を室温で30分間100μLでインキュベートします。
7. 切片を排出して二次抗体を取り出し、それぞれ5分間1X PBSで2回洗浄します。

色の開発

8. HRPを用いた可視化:アビジンビオチン複合体(ABC)試薬の100 μLを追加し、室温で30分間暗闇の中でセクションをインキュベート
   注:蛍光タグ付き抗体は、適切な顕微鏡を用いて使用および可視化することもできる。
9. スライドを1X PBSで2回5分間洗います。
10. DABの100 μLの断面を最大5分間インキュベートしてスライドを開発します。
11. 蒸留水(dH2 O)を室温で5分間加えて開発を中止します。

カウンターステイン(必要に応じて)

12. ハリス・ヘマトキシリン溶液(または0.1M酢酸ナトリウム(pH 4.2)で0.5%メチルグリーン)に10分間スライドを簡単に浸します。
13. dH₂Oでスライドを2回5分間洗い流し、カウンターステインを洗い流します。

脱水

14. スライドを95%エタノールに2回ずつ5分間浸します。
15. スライドを100%エタノールに2回ずつ5分間浸します。
16. スライドを100%キシレンに2回、それぞれ5分間浸します。
17. スライドをペーパータオルで拭きます。

取り付けおよびカバースリップアプリケーション

18. オルガノ・リモネン・マウントなどの取り付けメディアをスライドに1滴追加し、セクションの上にカバースリップを配置します。

顕微鏡分析

19. 分析のために適切な顕微鏡下で染色されたセクションを観察します。ここでは、観察に標準的な光顕微鏡を使用し、イメージングには取り付けられたデジタルカメラを使用しました。