5.6: 抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

注:無菌細胞培養技術は、抗体精製工程まで(例えば、バイオセーフティキャビネット内)無菌方法でハイブリドーマ細胞および培方を取り扱う場合に維持されるべきである。

1. 凍結ハイブリドーマ細胞の解凍

1. 凍結したハイブリドーマ細胞を含むバイアルを37°Cの水浴で解凍するまでインキュベートします(約2分)。
2. 完全なRPMIの10 mLを含む15 mL円錐管に解凍細胞を加える(RPMIは10%の胎児牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、1M mMピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、50μM 2-Mercapeを補充した)。
3. 1200 RPMで5分間遠心分離機を使用して、汚染された凍結媒体を洗い流します。
4. 遠心分離後、液体上清を廃棄し、5mLフレッシュコンプリートRPMIで細胞ペレットを再懸濁する。次いで、15mL完全RPMIを含むT75組織培養フラスコに細胞を添加する(RPMIの最終体積は20mLである)。
5. 5%CO₂で37°Cで標準的なインキュベーターで細胞を成長させます。培養中の細胞は非付着性である。

2. ハイブリドーマ拡張

1. フラスコが~80%コンフルエントになるまで、約3日間細胞を膨張させます。
   注:この時間は、細胞の開始数と、異なる細胞の増殖速度の固有の違いに基づいて異なる場合があります。細胞が指数関数的な成長段階にあることは重要です。
2. 最初のフラスコが約80%の合流に達したら、この最初のT75フラスコから細胞を取り出し、円錐遠心管に入れ、細胞をペレットにスピン(5分間1200 RPM)する。
3. 完全なRPMIの6 mLで細胞を再懸濁し、次いで3つの新しいT75フラスコ(18 mL RPMIを含む2 mL/フラスコ)に細胞懸濁液を分配する。これら3つのT75フラスコを37°Cで37°Cでインキュベートし、5%CO₂で約80%のコンフルエントになるまでインキュベートします(これは約3日かかります)。

3. 無血液中の抗体産生

注:この時点で、細胞は、ハイブリドーマ細胞株の増殖のために設計された無血清培地で成長を継続する準備ができています。このプロトコルでは、HB101サプリメント製品を含む市販のHB Basal液体媒体を使用しています。

1. 3つのT75フラスコ(約80%合流)のそれぞれからの細胞を収集し、遠心分離(5分間1200 RPM)を行います。
2. 各T75フラスコからの細胞ペレットを10mL補充HB101無血清培地に再懸濁し、次いでHB101無血清を補充した2つのT225フラスコに添加した(すなわち、各フラスコに~220-240 mL HB101を含む6つのフラスコのそれぞれに5mL細胞懸濁液)。
3. T225フラスコおよびHB101培養中の細胞を37°Cで37°Cで5%CO2で3週間、または細胞が死に始めるまで増殖し続ける。細胞は、これらの3週間の間にmAbを産生し、培養培地に分泌している。細胞が死に始めると、彼らはもはやmAbを産生していません。

4. 抗体精製 - 1日目

注:この時点で、無菌性を維持する必要はないので、無菌的な方法でメディアを取り扱う(例えば、バイオセーフティキャビネット内)必要はない。さらに、ハイブリドーマは「BSL2レベル」の薬剤とは見なされない。

1. フラスコから固定角度ローター用のチューブにメディアを注ぎます。10,000 RPMで固定角度ローターで遠心分離機でチューブを8分間回転させます。このステップは、培養上清から細胞破片を除去するように設計されている。
   注:チューブのサイズは、使用するローターによって異なります。覚えておくべき重要なことは、遠心分離の前にローターが適切にバランスをとっていることを確認するために、チューブ内で同じボリュームを持つことです。メディアのボリューム全体が一度に遠心分離機に収まらない可能性があります。残りのメディアは、後で同じチューブを使用して遠心分離されます(ステップ4.5)。
2. 氷に囲まれたバケツに攪拌バー付きの2Lプラスチックビーカーを準備します。かき混ぜるプレートの上に置きます。
3. 1Lボトルに500mLフィルタートップを取り付けます。適切なチューブを介して真空にボトルトップフィルターユニットを取り付けます。
4. ステップ4.1(まだハイブリドーマ細胞によって産生されるmAbを含む)から上清をフィルタートップに注ぎます。
5. メディアからセルデブリをペレットするために同じチューブセットを使用し続けます(ペレットは構築し続けます)。フィルタートップがいっぱいになり、上清の別のバッチが注ぐ準備ができるまで、真空を実行するのを待ちます。フィルターを乾かしたり、フィルタリングが非常に遅くなることをしないでください。
6. 1Lボトルが満杯に近づいたら、フィルタートップを取り外し、ステップ4.2で調製した2Lビーカーに上清を注ぎます。フィルタトップを再接続します。ボリュームを追跡します。
7. すべてのメディアが処理されるまで、遠心分離とろ過の手順を繰り返します。
8. 濾過された上清を1L当たり硫酸アンモニウム295gを測定する。攪拌しながら、次の数時間(15分ごとに〜25g)にわたって上清に硫酸アンモニウムをゆっくりと加え、望ましくないタンパク質を沈殿させる可能性のある高濃度の硫酸アンモニウム塩を防ぎます。
9. 硫酸アンモニウムをすべて加えたら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌プレートで4°C(例えば、ウォークイン冷蔵庫または冷蔵庫)に移動します。一晩かき混ぜる。溶液の一定の撹拌は、塩を可溶化するために必要であるが、長時間の撹拌は、表面/空気界面で溶液中のタンパク質の変性につながることができます。
10. 固定角度ローターを使用してチューブを洗浄します。

5. 抗体精製 - 2日目

1. 2Lビーカーから上清を含む硫酸アンモニウムをチューブに注ぎ、固定角度ローターを使用します。ブレーキなしで20分間6500 RPMの固定角度ローターで遠心分離機で回転します。
2. 真空は上清を吸引し、ペレットが柔らかくなるように吸い上げないように注意してください。同じチューブセットを使用して、上清を含む硫酸アンモニウムからペレットを収集し続けます。
3. 最後の吸引の後、各ペレット(抗体を含む)を~1 mlのPBSで再中断する。
4. 大量のPBSに対する透析により、沈殿したmAb溶液から硫酸アンモニウムを除去する。これを行うには、まずmAb溶液の各mLについて約1インチの透析チューブ(例えば、Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000ダルトンカットオフセルロース透析チューブ)を切断します。dH₂O. チューブの一方の端に結び目を結び、dH₂O で塗りつぶして、ノットが漏れていないことを確認します。チューブから空_のdH2O。
5. チューブにピペットPBS/抗体溶液。チューブを追加の0.25 ml PBSですすいで、チューブに移します。
6. オレンジ色の透析クリップで、チューブの上部を可能な限り溶液の近くに固定します。
7. チューブの上部を4Lビーカーの外側の上部にテープで留めします。チューブの充填部分をビーカーに掛けます。ビーカーにPBSを充填し、攪拌バーを追加します。
8. 4°Cで約8時間かき混ぜる。
9. ビーカー内のPBSを新鮮なPBSに交換し、さらに2回約8時間かき混ぜます。
10. 抗体をチューブから15mlまたは50mlの円錐管に移します。1200 RPMで5分間遠心分離機を形成した可能性のある沈殿物を除去する。上清を新鮮なチューブに移します。
11. 抗体1:20のアリコートをPBS(5 μl抗体+95 μl PBS)で希釈する。280 nmで分光光度計(PBSでブランク)で抗体濃度を定量します。消滅係数 (ε) 1.43 を使用します。濃度は次のように計算されます。
    
    
12. 抗体をスクリューキャップバイアルにアリコートし、-80°Cで保存します。

抗体は研究や診断のための強力なツールであるため、抗体を大量に生産する必要がしばしばあります。

抗体を作製するための最初のステップは、目的の抗原を宿主動物に注入することです。抗原は宿主のB細胞を活性化し、B細胞はその抗原に特異的な抗体を産生および放出します。次に、ELISAまたは別の検出方法を使用して、宿主動物の抗血清の標的抗体の存在について定期的にスクリーニングします。検出されると、B細胞を含む宿主動物の脾臓が取り除かれます。脾臓からすべてのB細胞が単離された場合、これには目的の抗原に対する抗体を分泌している集団が含まれるはずです。この集団をポリクローナルと呼んでいますが、これは、各細胞が抗原の異なるエピトープに結合している可能性が高いため、独自の抗体を産生していたからです。

モノクローナル抗体を作製するには、1つの特定のエピトープを認識するために産生された抗体、目的の抗体を産生する個々のB細胞をまず単離し、培養する必要があります。残念ながら、B細胞は培養ではうまく生き残れません。したがって、このハードルを克服するために、科学者はB細胞を不死の骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを生み出します。次に、これらの細胞は、ハイブリドーマが増殖して抗体を放出することのみを可能にする選択培地で増殖されます。ここでも、目的の抗体についてELISAなどの方法を使用して培地をスクリーニングします。検出されると、ハイブリドーマは、親培養物の段階希釈である限界希釈と呼ばれるプロセスを介してクローニングされ、その結果、単一細胞がスクリーニングプレートのウェルに播種されるはずです。これにより、単一の親細胞からのハイブリドーマの増殖が可能になり、目的の抗体のみを放出するモノクローナル細胞株が得られます。これらのモノクローナルラインは、組織培養フラスコで拡張して、大量のモノクローナル抗体を産生することができます。この後、細胞が死滅し始めると、抗体は硫酸アンモニウムと共に培地から沈殿することができます。通常、溶液中で抗体は親水性の相互作用を通じて水と相互作用します。しかし、アンモニウムと硫酸塩は、抗体から水分子を分離する高荷電イオンであり、抗体の溶解度を低下させ、抗体を沈殿させます。

まず、材料のリストを確認し、プロトコル用のすべてのメディア、消耗品、および作業面を準備します。

次に、ウォーターバスをオンにして、摂氏37度に設定します。次に、10ミリリットルの完全RPMIを15ミリリットルのコニカルチューブに加え、15ミリリットルの完全RPMIをT75細胞培養フラスコに追加して脇に置きます。注意を払い、適切な個人用保護具を着用して、ハイブリドーマ細胞を含む凍結バイアルを液体窒素貯蔵庫から取り出します。バイアル内の圧力を解放するには、キャップを少し緩めます。次に、バイアルをウォーターバスで慎重にインキュベートし、キャップが水面より上に留まることを確認して、汚染の可能性を最小限に抑えます。細胞がほぼ融解したら(通常は約2分かかります)、バイアルを組織培養フードに移します。

次に、キャップを取り外す前に、バイアルの外側を70%エタノールで拭きます。滅菌ピペットを使用して、10ミリリットルの完全RPMI培地が入った円錐管に細胞を移します。次に、チューブを1200RPMで5分間遠心分離します。遠心分離後、チューブを組織フードに戻し、チューブの外側をエタノールで拭きます。ペレットを乱さずに、上清を捨ててから、5ミリリットルの新鮮な完全なRPMI培地を追加し、静かに上下にピペットで再懸濁します。次に、細胞をT75細胞培養フラスコに移し、フラスコを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーター内に置きます。細胞が約80%のコンフルエントに達するまで待ちますが、これには通常約3日かかります。ハイブリドーマ細胞は非接着性であり、培地中で懸濁して増殖することに注意してください。十分なコンフルエントに達するまでの時間は、生細胞の開始数と使用するハイブリドーマ細胞の種類によって異なります。

細胞が十分にコンフルエントになったら、滅菌済みの25ミリリットルピペットを使用して、培養フラスコから円錐形の遠心チューブに細胞を移します。1200 RPMで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。細胞を遠心分離機に入れている間に、3つの新しいT75細胞培養フラスコのそれぞれに18ミリリットルの完全なRPMIを加え、これらを脇に置きます。遠心分離後、上清を取り除き、細胞ペレットを6ミリリットルの完全RPMIに穏やかに再懸濁します。次に、2ミリリットルの細胞懸濁液を3つの新しい細胞培養フラスコのそれぞれに加えます。最後に、フラスコを二酸化炭素5%、摂氏37度に設定されたインキュベーターに入れ、フラスコが約80%コンフルエントになるまで約3日間インキュベートします。

この時点で、細胞は、HB101サプリメントを含む市販のHB基礎液培地など、ハイブリドーマ細胞株用に設計された無血清培地で増殖を続ける準備ができています。各細胞培養フラスコから細胞を円錐形の遠心分離チューブに移し、1200 RPMで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。次に、225cm四方の細胞培養フラスコ6個にそれぞれ230ミリリットルのHB101無血清培地を加え、脇に置きます。遠心分離が完了したら、上清を取り除き、各ペレットを10ミリリットルの補充されたHB101培地に再懸濁します。次に、各細胞培養フラスコに、細胞懸濁液を5ミリリットル加えます。フラスコを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れ、約3週間細胞を増殖させ続けます。この間、細胞は目的のモノクローナル抗体を産生して培地に放出し、細胞が死滅し始めたときに抗体を精製する準備が整います。

抗体を含む培養培地から細胞の破片を除去するには、培養フラスコの内容物を固定角度ローターのチューブに注ぎます。チューブをローターにセットし、遠心分離の前にチューブが適切にバランスしていることを確認してください。チューブを10,000 RPMで8分間回転させます。サンプルを遠心分離している間に、攪拌棒付きの2リットルのプラスチックビーカーを氷のバケツに入れ、次に氷のバケツを攪拌板の上に置きます。

次に、1リットルのボトルに500ミリリットルのフィルタートップを取り付けます。このボトルトップフィルターユニットを適切なチューブを使用して家庭用掃除機に取り付けます。次に、抗体を含む上清をフィルタートップに注ぎます。残りの培地を遠心分離して、抗体含有上清から細胞破片を分離します。フィルターの上部が上澄み物でいっぱいになったら、掃除機をかけ始めます。次に、1リットルの収集ボトルがいっぱいに近づいたら、フィルタートップを取り外し、ろ過した上清を氷の上の2リットルのビーカーに注ぎます。すべての上清が処理されるまで、ろ過手順を繰り返します。

すべてのサンプルを処理したら、ろ過した上清1リットルあたり295グラムの硫酸アンモニウムを秤量します。攪拌板を開始し、次の数時間で硫酸アンモニウムを上清にゆっくりと加えます。これにより、不要なタンパク質の沈殿を引き起こす可能性のある局所的な高濃度の硫酸アンモニウム塩が防止されます。硫酸アンモニウムを全て添加したら、ビーカーをホイルで覆い、攪拌板と一緒に4°Cの冷蔵室に移し、抗体溶液を一晩攪拌するようにセットします。

翌朝、2リットルのビーカーから硫酸アンモニウム含有抗体溶液を固定角ローター用のきれいなチューブに注ぎます。チューブを6500 RPMで20分間中断せずに遠心分離し、チューブの底で抗体をペレット化します。次に、柔らかいペレットを吸い上げないように注意しながら、上澄みを真空吸引します。同じチューブセットを引き続き使用して、残りの硫酸アンモニウム含有上清からペレット化された抗体を回収します。最後の吸引後、各抗体ペレットを約1ミリリットルのPBSに再懸濁します。

抗体溶液から硫酸アンモニウムを除去するには、まず、抗体溶液1ミリリットルごとに約1インチの透析チューブを切断します。次に、チューブを蒸留水で拭き、チューブの一方の端に結び目を作ります。チューブに蒸留水を入れて、結び目から漏れがないか確認します。数分経っても漏れがない場合は、チューブから水を空にします。

次に、抗体溶液をチューブにピペットで入れます。できるだけ多くの抗体を回収するには、さらに0.25ミリリットルのPBSでチューブをすすぎ、これもチューブに移します。チューブの上部を透析クリップでできるだけ溶液に近づけて固定します。次に、チューブの上部を4リットルのビーカーの外側の上部にテープで固定し、チューブの充填部分をビーカーにぶら下げます。次に、ビーカーを摂氏4度の冷蔵室に持って行き、攪拌機の上に置きます。ビーカーの上部にPBSを入れ、攪拌棒を追加します。チューブと溶液を一晩約8時間攪拌します。翌朝、ビーカーのPBSを新しいPBSと交換し、ビーカーを再び約8時間攪拌したままにします。その夜遅くに、最後にもう一度このプロセスを繰り返します。午前中に透析チューブを開き、チューブから抗体溶液を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。透析中に形成された可能性のある沈殿物を除去するには、チューブを1200RPMで5分間遠心分離します。最後に、上清を新しいチューブに移します。

抗体濃度を定量するには、まず、抗体アリコートから5マイクロリットルを95マイクロリットルのPBSに加えて、20倍に希釈します。次に、希釈した抗体をキュベットにピペットで移し、分光光度計を使用して280ナノメートルの濃度を記録します。次に、示されている式を使用して抗体濃度を計算します。最後に、スクリューキャップバイアルに抗体名、濃度、調製日、および該当する場合はバッチ番号と実験者名をラベルし、抗体を標識したスクリューキャップバイアルに分注します。これらは、必要になるまで摂氏マイナス80度で保管できます。

120G8抗マウスCD317またはPDCA-1ハイブリドーマ系統を用いた例の収量は、44〜99.6ミリグラムの範囲であり、通常、平均して67.3ミリグラムの量が得られます。同じハイブリドーマ細胞株での各生産では、最後に利用可能なモノクローナル抗体の量がわずかに異なる可能性があることに注意することが重要です。