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ソース: ドミニク・R・ボリノ1, エリック・A・レゲンゾフ2, トーニャ・J・ウェッブ1
1メリーランド大学医学部微生物学・免疫学科、マーリーン・スチュワート・グリーンバウム総合癌センター、ボルチモア、メリーランド州 21201
2メリーランド大学医学部生体医工学技術センター、ボルチモア、メリーランド州 21201
共焦点蛍光顕微鏡は、従来の「広視野」上蛍光顕微鏡と比較して光学分解能の向上を可能にするイメージング技術である。共焦点顕微鏡は、一度に試料の各ピクセルにレーザー照明を指示する一連の電圧制御ミラー(ガルバノメーターまたは「ガルボミラー」)を使用して、x-y光学分解能の向上を達成することができます。さらに重要なのは、ピンホールを使用して、スキャンするZ面にない場所から発信されるフォーカス光を除去することで、優れたZ軸分解能を実現し、検出器が指定されたZ平面からデータを収集できるようにすることです。共焦点顕微鏡ではZ解像度が高いため、一連のZプレーン(Zスタックとも呼ばれる)から画像を収集し、ソフトウェアを介して3D画像を構築することが可能です。
共焦点顕微鏡のメカニズムを議論する前に、サンプルが光とどのように相互作用するかを考慮することが重要です。光は、光子、電磁エネルギーのパケットで構成されています。生物学的サンプルに衝突するフォトンは、4つの方法のいずれかでサンプルを含む分子と相互作用することができます:1)フォトンは相互作用せず、サンプルを通過します。2)フォトンが反射/散乱されます。3)光子は分子によって吸収され、吸収されたエネルギーは、総称して非放射性崩壊として知られているプロセスを通じて熱として放出されます。そして4)光子が吸収され、エネルギーが蛍光と呼ばれるプロセスを通じて二次光子として急速に放出される。蛍光発光を可能にする構造を持つ分子を蛍光素子と呼んでいます。ほとんどの生物学的サンプルには、ごくわずかな内因性蛍束蛍が含まれています。したがって、外因性蛍光体は、サンプル内の関心のある特徴を強調するために使用する必要があります。蛍光顕微鏡検査の間、サンプルは蛍光色素による吸収のための適切な波長の光で照らされる。光子を吸収すると、蛍光素は「励起」と言われ、吸収の過程は「励起」と呼ばれます。蛍光色素が光子の形でエネルギーを放出すると、プロセスは「発光」と呼ばれ、放出された光子は蛍光と呼ばれます。
蛍光色素を励起するために使用される光線は、顕微鏡の対物レンズによって焦点を合わせ、最大に焦点を合わせている「焦点」に収束します。焦点を超えて、光は再び発散します。入り口と出るビームは、焦点に触れる円錐のペアとして視覚化できます(図 1、左パネルを参照)。回折の現象は、光線をどれだけしっかりと集めることができるかに制限を課します - ビームは実際に有限サイズのスポットに焦点を合わせます。焦点点の大きさを決定する2つの要因:1)光の波長、および2)対物レンズの集光能力は、その数値絞り(NA)によって特徴付けされる。焦点「スポット」は、x-y平面だけでなく、z方向にも広がり、実際には焦点ボリュームです。この焦点容積の次元は光学イメージ投射によって達成可能な最高の決断を定義する。フォトンの数は焦点ボリューム内で最も多くなりますが、焦点の上下の円錐形の光パスには、フォトンの密度も低くなります。光路の蛍光色素は、このように興奮することができます。従来の(広視野)上蛍光顕微鏡では、焦点面の上下の蛍光が焦点外蛍光(「かすんだ背景」)に寄与し、画像の解像度とコントラストを低下させます。焦点面(赤い星)の上の蛍光を表す赤い立方体は、焦点の外の蛍光(右上)をもたらします。この問題は、ピンホールの利用のために、共焦点顕微鏡で改善される。(図2、右下)を参照してください。図3に示すように、ピンホールは、焦点の場所から検出器(左)に到達するために発生する放出を可能にし、焦点外の蛍光(右)が検出器に到達するのを妨げ、したがって、解像度とコントラストの両方を向上させます。
図 1.エピ蛍光と共焦点顕微鏡の光学分解能。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
蛍光色素を励起するために使用される光線は、顕微鏡の対物レンズによって焦点を合わせ、焦点量で収束し、発散する(左)。赤い星はイメージされているサンプルの焦点面を表し、赤い正方形は焦点面の上の蛍光色素放出を表します。エピ蛍光顕微鏡を使用してこのサンプルの画像を撮影すると、焦点が合っていない赤い正方形からの放出が見え、「曇った背景」(右上)に寄与します。共焦点顕微鏡は、焦点面の外側に放出される光の検出を防止するピンホールを備えており、「曇った背景」(右下)を排除します。
図 2.共焦点顕微鏡におけるピンホール効果この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
励起光の最高強度はレンズの焦点(左、赤楕円形)にありますが、焦点にないサンプルの他の部分(右、赤い星)は光と蛍光を得ます。これらの焦点外領域から放出される光が検出器に到達するのを防ぐために、ピンホールを持つ画面が検出器の前に存在する。焦点面から放射されるインフォーカスライト(左)のみがピンホールを通過し、検出器に到達できます。ピンホールでピンホールでピンホールでピンホールがブロックされ、検出器に到達できないピンフォーカスライト(右)。
図 3.共焦点レーザー走査顕微鏡の主成分。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
簡潔にするために、共焦点顕微鏡の機械的記述はニコンエクリプスTi A1Rの機械的記述に限定されます。異なる共焦点顕微鏡間にわずかな技術的な違いがあるかもしれませんが、A1Rは共焦点顕微鏡機能を記述するための良いモデルとして役立ちます。ダイオードレーザーの配列によって生成される励起光線は、画像化される標本に光を集中させる目的に一次ダイクロイックミラーによって反射される。一次ダイクロイックミラーは、他の波長の光が通過できるようにしながら、励起光を選択的に反射します。次に、光は、X-yの方法で標本全体の光ビームをスイープする走査ミラーに遭遇し、一度に 1 つの(x,y)ピクセルを照らします。照らされたピクセルで蛍光が放出される蛍光は、対物レンズによって収集され、一次二色鏡を通過して光増倍管(PMT)の配列に到達する。二次二次二色ミラーは、放出光を適切なPMTに向ける。ライト パスと PMT に到達します(図 3 を参照)。これにより、比較的弱い蛍光を励起光線から散乱する光によって汚染されることなく定量化することができ、これは通常、蛍光よりも大きさの大きさである。ピンホールは焦点ボリュームの外側から光をブロックするため、検出器に到着する光は、選択された狭いZ面から来ます。したがって、画像は一連の隣接するz-平面から収集できます。この一連の画像は、多くの場合「Z スタック」と呼ばれます。適切なソフトウェアを使用することにより、z-stackを処理して、試料の3D画像を生成することができます。共焦点顕微鏡検査の特に利点は、染色の細胞内局在を区別する能力である。例えば、細胞内染色からの膜染色との分化は、従来のエピ蛍光顕微鏡(1,2,3)では非常に困難である。
サンプル調製は、共焦点イメージングの重要なファセットです。光学顕微鏡検査技術の強みは、生細胞または固定細胞を画像化する柔軟性です。3D画像を生成しようとすると、Zスタックのために取得する必要がある画像の数、細胞の健康維持の難しさ、および生細胞とその小器官の動きのために、固定細胞の使用が典型的です。共焦点蛍光のための細胞を固定および染色するための手順は、免疫蛍光において従来使用されているものと同様である。チャンバースライドまたはカバースリップで培養した後、細胞は細胞形態を維持するためにパラホルムアルデヒドを使用して固定される。非特異的抗体結合は、ウシ血清アルブミン、ミルク、または正常血清を用いて遮断される。二次抗体の特異性を維持するために、使用される溶液は、一次抗体が生成されたのと同じ種に由来してはならない。細胞は、目的の抗原を結合する一次抗体でインキュベートされる。複数の細胞標的を標識する場合、一次抗体はそれぞれ異なる種から誘導されなければならない。抗原をタグ付けする抗体は、フッ素結合二次抗体によって結合される。蛍光結合二次抗体は、共焦点顕微鏡で利用可能なレーザー励起の波長と互換性があるように選択する必要があります。複数の抗原を可視化する場合、蛍光体の励起/放出スペクトルは、その信号が顕微鏡分析によって判別できるように十分に異なる必要があります。染色された標本はイメージ投射のためのスライドに取付けられる。取り付け媒体は、光漂白や試料の脱水を防ぐために使用されます。必要に応じて、核カウンターステインを含む取り付け媒体(例えばDAPIまたはホエヒト)を使用することができる(4)。
以下のプロトコルでは、CD1d(LCD1)を発現するためにトランスフェクトされたマウス線維芽細胞を、CD1dおよびCD107a(LAMP-1)を認識する抗体で染色した。CD1dは、脂質抗原を提示する抗原提示細胞の表面に存在する主要組織適合性複合体1(MHC1)様受容体である。LAMP-1(リソソーム関連膜タンパク質-1)は、主にリソソーム膜に存在する膜タンパク質である。適切な抗原の提示のために、CD1dは低pHリソソームコンパートメントを通して入稿されるので、LAMP-1はこのプロトコルのリソソームコンパートメントのマーカーとして使用されている。異なる種で産生された抗CD1dおよび抗LAMP-1を用いてLCD1細胞を調べることによって、ユニークな蛍動管を持つ二次抗体を使用して、細胞内の各タンパク質の局在化およびCD1dがLAMP-1陽性に存在するかどうかを決定することができる。リソソームコンパートメント。
1. 材料
バッファー
機器
材料・試薬
アッセイ特異的試薬
2. プロトコル
抗体染色の準備
シードセル
固定
パーミア化
ブロック
一次抗体インキュベーション
注: 複数の標的を調べている場合は、一次抗体が異なるアイソタイプであることを確認してください。推奨抗体濃度はメーカーによって異なり、使用前に定量する必要があります。
二次抗体インキュベーション
注: 推奨抗体濃度はメーカーによって異なるため、使用前に計算する必要があります。複数の標的を調べた場合、二次抗体は、独特の励起/発光スペクトルを持つ異なる蛍光色素に結合する必要があります。また、蛍光色素を選択しながら、核カウンターステイン(すなわちDAPI)の励起/放出を心に留めておいてください。蛍光色素選択は、使用される共焦点顕微鏡のレーザー構成によって影響を受ける可能性がある。機械のレーザー構成は実験に適した蛍光色素を決定する。
3. 取り付けカバースリップ
4. 共焦点イメージング
共焦点レーザー走査顕微鏡上の画像サンプル。図2に示すデータについては、ニコンエクリプスTi A1RをNISエレメンツ先端研究ソフトウェアで使用しました。次のセクションでは、前述のソフトウェアを使用してイメージをキャプチャする手順について詳しく説明します。
共焦点蛍光顕微鏡は、抗体共役蛍光色素で抗原を標識し、蛍光シグナルを検出することにより、細胞または組織サンプルに関心のあるタンパク質または抗原の局在化のための特殊なイメージング技術です。広視野蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を提供し、対物レンズの焦点面に配置された2つのピンホールの助けを借りて、その名前を共焦点に与えます。細胞内染色からの表面膜染色の分化など、細胞内レベルで染色を可視化できます。
共焦点顕微鏡は、古典的な蛍光顕微鏡と同様の基本原理に従います。光源からのビーム(通常は共焦点用レーザー)は、ダイクロイックミラーによって反射され、サンプル上の対物レンズによって焦点を当てます。この光は、カメラやアイピースに対して対物レンズとダイクロイックミラーを通って戻って移動する異なる波長を放出するために蛍光を励ます。
共焦点顕微鏡の高められた決断は主に励起および放出の光の道を通る光のための非常に小さい穴である2つのピンホールの存在によるものである。ピンホールは、対物レンズの焦点面に戦略的に配置されます。次に、顕微鏡配置の側面図回路図に切り替えて、光路を確認してみましょう。励起ピンホールを通過した後、励起光ビームは焦点から発信する効果を有し、対物レンズがサンプル上の点にも光を集中させます。この焦点からの放出ビームは、通過することを可能にする発光ピンホールに収束します。今、励起の間に、光経路内の蛍光体は、焦点の上下に、わずかに興奮している。焦点から発生する発光光がピンホールを通過する間、焦点外のポイントからの放出は、放出ピンホールの前後に収束し、したがってブロックされ、バックグラウンド蛍光が減少します。
励起放出検出サイクルは、いくつかの異なる方法で行うことができる、対象領域の各イメージングポイントに対して繰り返される必要があります。例えば、レーザー走査共焦点は、異なる角度で励起光をそらすガルバノメーター走査ミラーを使用します。したがって、XY平面内の試料を横切って光線を掃引する。スピニングディスクコンフォーカルは、ピンホールの配列を持つディスクを使用し、ピンホールの配置をシフトするために回転します。これにより、ユーザーはサンプル内の複数の小さなイメージングポイントを毎回照らし、ディスクが回転するにつれて領域全体を徐々にカバーできます。ピンホールの結果として、検出器のXY画像は狭いZ平面を表します。したがって、画像は、多くの場合、Z スタックと呼ばれる一連の連続した Z 平面から収集できます。これらの画像から、適切なソフトウェアは、サンプル中の蛍光シグナルパターンの3D描写を生成することができる。
このプロトコルでは、マウス線維芽細胞の免疫染色を観察し、続いて共焦点顕微鏡でイメージングを行い、細胞表面タンパク質とリソソームタンパク質を可視化します。
始めめるために、無菌技術を使用して、ウェル当たり500マイクロリットルの成長培地に目的の細胞を再懸濁し、次に4ウェルチャンバースライドの井戸にそれらを播種する。ここでは、抗原提示分子CD1dを発現するためにトランスフェクトしたマウス線維芽細胞を用いている。細胞がガラスに付着できるように、チャンバースライドを37°Cの5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、一晩インキュベートします。午前中に、各井戸から培布を吸引し、その後、数秒間PBSの500マイクロリットルで一度細胞を洗浄します。
細胞を固定するには、各ウェルに1%のパラホルムアルデヒド溶液の500マイクロリットルを追加し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの後、適切な有害な液体廃棄物容器にパラホルムアルデヒドを収集し、数秒間PBSで細胞を3回洗浄することにより、固定剤の残骸を除去します。
細胞への抗体の浸透を可能にするために、各ウェルに500マイクロリットルの透過性バッファーを追加し、室温で15分間ベンチでインキュベートする。パーメビリゼーション後、500マイクロリットルのPBSで細胞を3回短時間洗浄します。次に、各ウェルに500マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、非特異的抗体結合を防ぐために摂氏4度で1時間インキュベートする。
一次抗体、抗CD1dおよび抗LAMP-1を、適切な作業濃度で調製する。次いで、ウェルからバッファーを吸引し、希釈された一次抗体溶液の500マイクロリットルで各ウェルの細胞を覆い、その後、4°Cで平らな表面に一晩スライドをインキュベートします。翌朝、二次抗体を希釈し、この場合、明確な蛍光タグを有する抗マウスおよび抗ラット抗体を、適切な作業濃度に対する遮断バッファー内で。次に、一次抗体溶液をウェルから吸引し、500マイクロリットルのPBSで細胞を4回洗浄する。次いで、希釈した二次抗体溶液の500マイクロリットルを各ウェルに添加し、暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引し、500マイクロリットルのPBSでウェルを4回洗浄し、結合のない二次抗体を除去する。
最終洗浄後にサンプルを取り付けるには、慎重に取り外し、スライドからチャンバーを取り外します。残留PBSを除去するには、繊細なタスクワイプの上にスライドを持ち、セルに触れることなくエッジから流体を取り除きます。余分なPBSが除去されたら、核染色DAPIを含むアンチフェード取り付け媒体を1滴、細胞の各セクションに加えます。次に、20×60ミリメートルのカバースリップを取り、指先だけを使用して、細胞上の気泡の形成を避けるために、いずれかのエッジでゆっくりとカバースリップを下げ始めます。デリケートなタスクワイプでスライド上の余分な取り付け媒体を拭き取り、1週間まで室温で暗い状態でスライドを保管します。
セルのイメージングを開始するには、まずデスクトップの NIS ソフトウェア アイコンをクリックします。コントロールウィンドウで上部のTiPadタブをクリックし、画像化の目的を選択します。次に、スライドをセルをステージにロードし、レンズの下に中央に置きます。次に、TiPad タブの横にある A1plus コンパクト GUI タブで、使用する蛍光色素に適したレーザーを設定します。歯車記号をクリックして、色素とスペクトル設定メニューを開きます。色素とスペクトル設定メニューが開いたら、必要なチャンネルを選択し、各チャンネルにレーザーを設定します。次に、最初のダイクロイックミラーの下にあるドロップダウンメニューで適切な排出量を選択します。次に、A1plusコンパクトGUIウィンドウの下で、Ch.Seriesをクリックしてラインチャンネルシリーズを設定し、使用するレーザーがサンプルに同時に発射されるか、順番に発射するかを設定します。
その後、上部の矢印先端アイコンをクリックしてスキャンを開始します。この時点で、イメージングがライブである間、A1plus Compact GUI ウィンドウの下で、スライドスケールをクリックし、ピンホールサイズを変更してピンホールサイズを変更して、ピンホールサイズを変更して、焦点外の光を制限します。次に、スライドスケールを使用して各レーザーの高電圧とオフセットの設定を適切なレベルに調整し、潜在的な背景染色を制限しながら特定の染色を検出できるようにします。正の染色サンプルが利用可能な場合は、レーザー設定が最適な信号対雑音比を得られるように、各チャンネルに対してこのサンプルをイメージングから開始します。各レーザーに最適なHVとオフセット値を設定した後、ND取得タブをクリックし、Zアイコンを選択してZシリーズのパラメータを設定します。
次に、サンプルのライブ画像を取得しながら、まず画像の下部を見つけて下ボタンをクリックして下部を設定します。次に、サンプルの一番上の位置を見つけ、上部ボタンをクリックします。ステップ サイズを、各ステップごとに優先ステップ サイズをミクロンで入力するか、必要な合計ステップ数を指定して、ステップ サイズを設定します。画像の目的のサイズ/ピクセル解像度を選択するには、[Aiplus コンパクト GUI] ウィンドウをクリックし、サイズアイコンの下で目的の解像度を選択します。
画像のノイズを減らすには、theta シンボルの横にあるドロップダウン メニューを選択して、選択した画像数を平均化します。この後、ND 取得メニューの [今すぐ実行] タブをクリックして、サンプルのイメージングを開始します。イメージングが完了したら、ファイルをクリックしてイメージを保存し、次のように保存し、拡張子 dot-nd2 でイメージ ファイルをエクスポートします。最後に、他の各サンプルのプロセスを繰り返します。
この実験では、表面糖タンパク質遺伝子CD1dを発現するマウス線維芽細胞を固定し、免疫染色し、共焦点顕微鏡上で画像化した。この画像は、CD1dが赤で染色された40倍の倍率でZスタックの単一のセクションを示しています。試料を、リソソームマーカーであるLAMP-1を緑色で受け取った。核染色DAPIは、細胞の核を示すために使用された。
3 つの異なるチャネルがマージされる複合イメージでは、赤チャネルと緑チャネルの重なりから黄色の外観が生じ、CD1d と LAMP-1 がリソソームで共局在する領域を示します。1 色のみ存在する領域は、共ローカライズなしで CD1d または LAMP-1 が存在することを示します。この画像は、Z スタックでキャプチャされたイメージから構築されたセルの 3D レンダリングを示しており、このメソッドを使用すると、このセル グループのサイド ビューの構築が可能になります。次の図は、100倍の倍率でZスタックからスライスを示し、これら2つのタンパク質の発現パターンをより詳細に示しています。イメージの右側にあるピンクの輪郭を描いたボックスには、イメージ内のピンクの線で指定された X 座標の断面が表示され、ピンクの線の側面図が表示されます。同様に、イメージの下部にある青い輪郭を描いたボックスは、青い線の正面図を表す青い線で指定された y 座標の断面を示しています。Z スタック イメージの 3D レンダリングにより、ユーザーは 3D でイメージを表示し、X、y、および z 平面をすべて視覚化できます。これは、細胞内の異なる領域における異なる汚れの共局在を研究するために使用することができる。
共焦点蛍光顕微鏡法は、抗体標識蛍光色素で抗原を標識し、蛍光シグナルを検出することにより、細胞または組織サンプル中の目的のタンパク質または抗原を局在化するための特殊なイメージング技術です。これは、対物レンズの焦点面に配置された2つのピンホールの助けを借りて、広視野蛍光顕微鏡よりも高い空間分解能を提供し、共焦点という名前が付けられました。これにより、ユーザーは、表面膜染色と細胞内染色の区別など、細胞内レベルでの染色を視覚化できます。
共焦点顕微鏡は、従来の蛍光顕微鏡と同様の基本原理に従います。光源(通常は共焦点レーザー)からのビームは、ダイクロイックミラーで反射され、対物レンズによってサンプルに集束されます。この光は蛍光色素を励起して異なる波長を放出し、対物レンズとダイクロイックミラーを通ってカメラまたは接眼レンズに戻ります。
共焦点顕微鏡の分解能の向上は、主に、光が励起光路と発光光路を通過するための非常に小さな穴である2つのピンホールの存在によるものです。ピンホールは、対物レンズの焦点面に戦略的に配置されています。次に、顕微鏡の配置の側面図に切り替えて、光路を確認しましょう。励起ピンホールを通過した後、励起光ビームは焦点から発せられる効果があり、対物レンズは光をサンプル上の点にも焦点を合わせることができます。この焦点からの放射ビームは、放出ピンホールに収束し、通過することができます。ここで、励起中、焦点の上下の光路内の蛍光色素もわずかに励起されます。焦点から発せられた発光光はピンホールを通過する一方で、ピントが合っていない点からの発光は発光ピンホールの前後に収束するため、遮蔽され、バックグラウンド蛍光が減少します。
励起-発光-検出サイクルは、関心領域内のイメージングポイントごとに繰り返す必要がありますが、これはいくつかの異なる方法で行うことができます。例えば、レーザー走査型共焦点は、ガルバノメーター走査ミラーを使用し、励起光をさまざまな角度で偏向させます。したがって、XY平面で試料全体に光ビームをスイープします。スピニングディスク共焦点は、ピンホールが配列されたディスクを使用し、ピンホールが回転してピンホールの配置をシフトします。これにより、ユーザーは毎回サンプル内の複数の小さなイメージングポイントを照らし、ディスクが回転するにつれて領域全体を徐々にカバーすることができます。ピンホールの結果として、検出器のXY像は狭いZ平面を表します。したがって、画像は、多くの場合、Z スタックと呼ばれる一連の連続した Z 平面から収集できます。これらの画像から、適切なソフトウェアを使用して、サンプル内の蛍光シグナルパターンの3D描写を生成できます。
このプロトコールでは、マウス線維芽細胞の免疫染色を観察し、続いて共焦点顕微鏡でイメージングして、細胞表面タンパク質とリソソームタンパク質を鑑別的に視覚化します。
まず、滅菌技術を使用して、目的の細胞をウェルあたり500マイクロリットルの成長培地に再懸濁し、次にそれらを4ウェルチャンバースライドのウェルに播種します。ここでは、抗原提示分子であるCD1dを発現させるためにトランスフェクションしたマウス線維芽細胞を用いています。細胞をガラスに接着させるには、チャンバースライドを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れ、一晩インキュベートします。午前中に、各ウェルから培地を吸引し、次に細胞を500マイクロリットルのPBSで数秒間一度洗浄します。
細胞を固定するには、500マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒド溶液を各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、パラホルムアルデヒドを適切な有害廃液容器に集め、PBSで細胞を数秒間3回洗浄して、固定液の残りを取り除きます。
抗体が細胞に浸透するように、各ウェルに500マイクロリットルの透過化バッファーを加え、室温で15分間ベンチでインキュベートします。透過処理後、500マイクロリットルのPBSで細胞を3回短時間洗浄します。次に、各ウェルに500μLのブロッキングバッファーを加え、4°Cで1時間インキュベートして、非特異的抗体の結合を防ぎます。
一次抗体である抗CD1dおよび抗LAMP-1を適切な使用濃度で調製します。次に、ウェルからバッファーを吸引し、各ウェルの細胞を500マイクロリットルの希釈一次抗体溶液で覆い、スライドを平坦な表面で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、二次抗体(この場合は異なる蛍光タグを持つ抗マウス抗体および抗ラット抗体)を、ブロッキングバッファーで適切な使用濃度に希釈します。次に、ウェルから一次抗体溶液を吸引し、500マイクロリットルのPBSで細胞を4回洗浄します。次に、希釈した二次抗体溶液500μLを各ウェルに加え、室温で暗所で1時間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引し、500マイクロリットルのPBSでウェルを4回洗浄して、結合していない二次抗体を除去します。
最終洗浄後にサンプルをマウントするには、チャンバーをスライドから慎重に取り外して取り外します。残留PBSを除去するには、スライドを繊細なタスクワイプの上で斜めに保持し、セルに触れずに端から液体を取り除きます。余分なPBSが除去されたら、核染色剤DAPIを含む退色防止封入剤を細胞の各セクションに1滴加えます。次に、20 x 60ミリメートルのカバースリップを取り、指先だけで、細胞上に気泡が形成されないように注意しながら、どちらかの端でカバースリップをゆっくりと下げ始めます。スライドに付着した余分な封入剤は、デリケートなタスクワイプで拭き取り、スライドは室温の暗闇で最大1週間保管します。
細胞のイメージングを開始するには、まずデスクトップ上のNISソフトウェアアイコンをクリックします。コントロールウィンドウで、上部の[TiPad]タブをクリックし、イメージングに必要な対物レンズを選択します。次に、セルが入ったスライドをステージにセットし、レンズの下の中央に配置します。次に、TiPadタブの横にあるA1plus Compact GUIタブで、使用する蛍光色素に適したレーザーを設定します。歯車の記号をクリックして、色素とスペクトルの設定メニューを開きます。色素とスペクトルの設定メニューが開いたら、必要なチャンネルを選択し、各チャンネルのレーザーを設定します。次に、最初のダイクロイックミラーの下のドロップダウンメニューで適切な放射を選択します。次に、A1plus Compact GUIウィンドウで「Ch.Series」をクリックし、使用するレーザーがサンプルに同時に発射するか、順次発射するかを設定するラインチャネルシリーズを設定します。
その後、上部の矢印アイコンをクリックしてスキャンを開始します。この時点で、イメージングがライブである間に、A1plus Compact GUIウィンドウでスライディングスケールをクリックし、ピンホールのサイズを変更して、焦点が合っていない光を制限するようにします。次に、スライディングスケールを使用して各レーザーの高電圧とオフセット設定を適切なレベルに調整し、潜在的なバックグラウンド染色を制限しながら特定の染色を検出できるようにします。ポジティブ染色サンプルが利用可能な場合は、まずこのサンプルを各チャンネルでイメージングし、レーザー設定が最適なS/N比をもたらすことを確認します。各レーザーの最適なHV値とオフセット値を設定したら、[NDアクイジション]タブをクリックし、[Z]アイコンを選択してzシリーズのパラメータを設定します。
次に、サンプルのライブ画像を取得しながら、まず画像の下部を見つけて下部のボタンをクリックして下部を設定します。次に、サンプルの上部の位置を見つけて、上部のボタンをクリックします。ステップ サイズを設定するには、各ステップの優先ステップ サイズをミクロン単位で具体的に入力するか、必要な合計ステップ数を指定します。画像の希望のサイズ/ピクセル解像度を選択するには、Aiplus Compact GUIウィンドウをクリックし、サイズアイコンの下で希望の解像度を選択します。
画像のノイズを減らすには、シータ記号の横にあるドロップダウンメニューを選択して、選択した画像の数を平均化します。その後、ND AcquisitionメニューのRun Nowタブをクリックして、サンプルのイメージングを開始します。イメージングが完了したら、[ファイル]をクリックして画像を保存し、[名前を付けて保存]をクリックすると、拡張子がdot-nd2の画像ファイルがエクスポートされます。最後に、他の各サンプルに対してこのプロセスを繰り返します。
この実験では、表面糖タンパク質遺伝子CD1dを発現するマウス線維芽細胞を固定し、免疫染色し、共焦点顕微鏡でイメージングしました。この画像は、40倍の倍率でZスタックの1つのセクションを示しており、CD1dは赤く染色されています。サンプルは、リソソームマーカーであるLAMP-1を緑色の緑色で共播種しました。核染色DAPIを使用して、細胞の核を示しました。
3つの異なるチャネルが結合した合成画像では、黄色の外観は赤と緑のチャネルの重なりから生じ、CD1dとLAMP-1がリソソームに共局在する領域を示します。1色のみが存在する領域は、共局在化のないCD1dまたはLAMP-1の存在を示しています。この画像は、zスタックでキャプチャされた画像から構築されたセルの3Dレンダリングを示しており、この方法により、このセルグループの側面図の構築が可能になりました。次の画像は、100倍の倍率でzスタックのスライスを示しており、これら2つのタンパク質の発現パターンをより詳細に示しています。画像の右側にあるピンク色の枠線ボックスは、画像内のピンク色の線で示された X 座標の断面を示しており、ピンク色の線の側面図を表しています。同様に、画像の下部にある青い枠線で囲まれたボックスは、画像内の青い線で示された Y 座標の断面を示しており、青い線の正面図を表しています。zスタック画像の3Dレンダリングにより、ユーザーは画像を3Dで表示し、x、y、zのすべての平面を視覚化できます。これは、細胞内の異なる領域における異なる染色の共局在を研究するために使用できます。
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