共焦点蛍光顕微鏡:マウス線維芽細胞におけるタンパク質の局在を決定する技術

1. 材料

バッファー

1. 洗浄バッファー:カルシウムまたはマグネシウムを使用せずに1 X無菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を使用
2. 固定バッファー: PBS における 1% パラホルムアルデヒド
3. 透過性バッファー: 0.1% トリトン X-100 (PBS)
4. ブロッキングバッファー: PBSにおける1%ウシ血清アルブミン
5. 細胞増殖培地:10%の胎児ウシ血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを補充したDMEM

機器

6. ラミナーフローフード
7. 加湿インキュベーター (37°C, 5% CO₂)
8. 共焦点レーザー走査顕微鏡;ここでは、ニコンエクリプスTiレーザー

材料・試薬

9. チャンバリード細胞培養スライド
10. DAPIを用いるアンチフェード取り付けメディア(核染色用)
11. 顕微鏡カバーガラス
12. デリケートなタスクワイプ
13. ピペッタとヒント

アッセイ特異的試薬

14. 付着細胞(一次細胞または細胞株);。ここで、CD1dをトランスフェクトしたマウス線維芽細胞を用いた(LCD1)。
15. 細胞標的を検出する一次抗体;ここで、ラットアンチマウスCD107a(LAMP-1)およびマウス対マウスCD1dを用いた。
16. 一次抗体アイソタイプに特異的なフルオロフォア結合二次抗体;ここで、アレクサフルオール488に結合した抗ラットIgGと、Alexafluor 647に結合した抗マウスIgGが使用された。

2. プロトコル

抗体染色の準備

シードセル

1. 成長培地に関心のあるセルを再中断します。
2. 次に、細胞懸濁液/1当たりのシード500μLを4ウェルチャンバスライドのウェルに入れた。(ここで、LCD1細胞を2.5x10⁵細胞/チャンバで500μLの増殖培養培養物に播種した。播種密度は、細胞株によって異なる場合があります)。
3. 37°Cで5%_のCO2インキュベーターで一晩チャンバースライドをインキュベートし、細胞がガラスに付着できるようにします。
4. 翌日、各井戸から培った培体を吸引し、500 μL PBSで細胞1Xを洗浄します。

固定

5. 細胞を固定するには、各ウェルに500 μL 1%パラホルムアルデヒド溶液を加え、室温で15分間インキュベートします。
6. インキュベーション後、パラホルムアルデヒドを適切な有害な液体廃棄物容器に回収する。
7. 次に、500 μL PBSで細胞を3回洗浄し、固定剤の残骸を除去する。

パーミア化

8. 500 μL透過性バッファー/ウェルで室温で15分間インキュベートして細胞を透過化します。
9. 次に、500 μLのPBSで細胞を3回短時間洗浄します。

ブロック

10. 4°Cで1時間500μLブロッキングバッファーを用いて各ウェルの細胞をインキュベートし、非特異的抗体結合を遮断する。

一次抗体インキュベーション

11. スライドチャンバからブロッキングバッファを吸引します。
12. 次いで、希釈した一次抗体溶液の500μLを細胞に添加する。(ここで、抗CD107a(LAMP-1)を1:500希釈し、抗CD1dを未希釈して使用した(1H6モノクローナル抗体はランディ・ブルトキエヴィッチ博士によって親切に提供された)。
13. スライドを4°Cで一晩インキュベートします。

注: 複数の標的を調べている場合は、一次抗体が異なるアイソタイプであることを確認してください。推奨抗体濃度はメーカーによって異なり、使用前に定量する必要があります。

二次抗体インキュベーション

14. 一次抗体溶液をウェルから吸引する。
15. 500 μL PBSで井戸室を4回洗います。
16. 次に、希釈二次抗体溶液の500μLを各ウェルに添加する。(ここで、二次抗体-抗マウスIgG Alexafluor 647および抗ラットIgG Alexafluor 488のいずれも、ブロッキングバッファー内で1:2000を希釈した。
17. 暗闇の中で1時間室温でインキュベートする。
18. インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引する。
19. 500 μL PBSでチャンバーを4回洗浄し、非結合二次抗体を除去します。

注: 推奨抗体濃度はメーカーによって異なるため、使用前に計算する必要があります。複数の標的を調べた場合、二次抗体は、独特の励起/発光スペクトルを持つ異なる蛍光色素に結合する必要があります。また、蛍光色素を選択しながら、核カウンターステイン(すなわちDAPI)の励起/放出を心に留めておいてください。蛍光色素選択は、使用される共焦点顕微鏡のレーザー構成によって影響を受ける可能性がある。機械のレーザー構成は実験に適した蛍光色素を決定する。

3. 取り付けカバースリップ

1. まず、慎重にスライドからチャンバーを取り外します。
2. 次に、繊細なタスクワイプの上にスライドを斜めに保持し、セルに触れることなくエッジから流体を取り除きます。
3. 核染色DAPIを含むアンチフェード取り付け培地を1滴、細胞の各セクションに加えます。
4. 次に、指先を使用して端に保持して、スライドの上に20 mm x 60 mmのカバースリップを配置します。(細胞の上に泡が形成され、イメージングを妨げるため避けてください)。
5. 繊細なタスクワイプで側面の余分な取り付け媒体を拭き取り、1週間まで室温で暗闇の中でスライドを保存します。

4. 共焦点イメージング

共焦点レーザー走査顕微鏡上の画像サンプル。図2に示すデータについては、ニコンエクリプスTi A1RをNISエレメンツ先端研究ソフトウェアで使用しました。次のセクションでは、前述のソフトウェアを使用してイメージをキャプチャする手順について詳しく説明します。

1. 細胞のイメージングを開始するには、'NISソフトウェアアイコン'をクリックして'NIS要素高度な研究ソフトウェア'を開きます。
2. 次に、コントロールウィンドウで「TiPad」タブをクリックし、イメージングの目的を選択します。(ここでは、最初の40倍の目的が使用されました)。
3. ステージにセルを積み込み、レンズの下に中央にスライドをロードします。
4. さて、「A1plusコンパクトGUI」タブで、使用する蛍光色素に適したレーザーを設定します。ギアシンボルをクリックして色素とスペクトル設定メニューを開き、必要なチャンネルを選択し、各チャンネルのレーザーを設定します。
5. 次に、最初のダイクロイックミラーの下にあるドロップダウンメニューで適切な排出量を選択します。
6. 次に、「A1plusコンパクトGUI」ウィンドウの下で、'Ch.シリーズ'をクリックしてラインチャンネルシリーズを設定し、使用するレーザーがサンプルに同時に発射されるか、順番に発射するかを設定します。(ここでは、チャネル 1 から始まり、チャネル 2、次に 4 から順次パスを選択しました)。
7. その後、上部の矢印の先端アイコンをクリックしてスキャンを開始します。この時点で、イメージングがライブ中に'A1plus Compact GUI'ウィンドウの下で、スライドスケールをクリックし、ピンホールサイズを変更してピンホールサイズを変更して、ピンホールサイズを変更して、フォーカスライトの切り下げを保証します。(ここでは、使用可能な最小設定 (0.5) が使用されました)。
8. 次に、スライドスケールを使用して、潜在的な背景染色を制限しながら特定の染色を検出できるようにすることで、各レーザーの「高電圧」および「オフセット」設定を適切なレベルに調整します。正染色サンプルが利用可能な場合は、レーザー設定がノイズ比に最適な信号を得られるように、各チャンネルに対してこのサンプルをイメージングから開始します。
   注意:長期間のレーザー強度が高いと、光漂白の原因となります。
9. 各レーザーに最適なHVとオフセット値を設定した後、[ND取得]タブ'をクリックし、Zシリーズのパラメータを設定する'Z'アイコンを選択します。次に、サンプルのライブ画像を取得しながら、まず画像の下部を見つけて'下部'ボタンをクリックして下部を設定し、次にサンプルの上の位置を見つけ、'上'ボタンをクリックします。ステップ サイズを設定するには、各ステップごとに優先ステップ サイズを μm で入力するか、必要な合計ステップ数を指定します。
10. Z シリーズ パラメータを設定したら、画像の必要なサイズ/ピクセル解像度を選択します。これを行うには、'A1plusコンパクトGUI'ウィンドウをクリックし、'サイズ'アイコンの下に目的の解像度を選択します。画像のノイズを減らすには、'ø'記号の横にあるドロップダウンメニューを選択して、選択した画像数を平均化します。
11. サンプルのイメージングを開始するには、[ND取得] メニューの [今すぐ実行]タブをクリックします。
12. イメージングが完了したら、[ファイル'をクリックしてイメージを保存し、次に 'として保存'をクリックして、拡張子.nd2' を持つイメージ ファイルをエクスポートします。最後に、他の各サンプルのプロセスを繰り返します。