5.9: 免疫沈殿ベースの技術:アガロースビーズを用いた内因性タンパク質の精製

1. タンパク質A/G PLUSアガロースビーズを用した免疫沈殿

細胞リサート製剤

1. 遠心分離機10⁸チモシグネタを13,000rpmのマイクロ遠心分離機で3分間、上清を除去する。
   注:細胞数は、所望のタンパク質の発現レベルと選択した細胞タイプによって異なります。
2. PMSFを使用して500 μLリシスバッファRIPAで細胞を再中断します。
3. 渦でいくつかのクイックパルスを使用して細胞を破壊し、注射器に取り付けられた25G針で数回ライサートを吸引します。
   注:バブルの作成は避けてください。より大きなセルタイプには、21G針などの大きな針を使用します。
4. 細胞を氷上で10分間インキュベートします。
5. 4°Cで15分間13,000rpmでリザートを遠心分離します。
6. 上清を新鮮な標識マイクロ遠心管に移します。

事前清算

7. 20 μLタンパク質A/G PLUSアガロースビーズと1μgのアイソタイプコントロール抗体(ここでは、マウスIgG1アイソタイプコントロール抗体が使用される)をライサートに添加する。
   注:使用されるアイソタイプ抗体の選択は、プルダウン工程の後半で使用されるタンパク質特異的抗体に依存する。
8. 冷たい部屋(4°C)の遠心回転子でリザートミックスを30分間インキュベートします。
9. 4°Cで30sのための3200のrpmでサンプルを遠心分離する。
10. クリア済みの上清を、ラベル付きの1.5mLマイクロ遠心管に移します。ペレットを捨てます。

タンパク質濃度決定

11. ブラッドフォードアッセイを行うことにより、細胞のタンパク質濃度を決定します。
12. アリコート1000 μLブラッドフォード試薬を7マイクロ遠心管に入れます。
13. 次の量の BSA タンパク質標準 (2 mg/mL) をチューブの 6 本に加えます (表 1)。

表 1:BSAタンパク質標準量

14. ^第7管に、予クリアされたライサトの1μLを加える。
    注:サンプル濃度がアッセイ検出範囲内にあることを確認するには、1:2 または 1:5 のリサート希釈も準備して分析します。
15. 7つのチューブのそれぞれから200 μLを平底の個々のウェルに入れ、各サンプルを三つ編みで繰り返す96ウェルプレートに入れます。
16. 595 nmのプレートリーダーのプレートを読み取ります。
17. Excelで標準曲線を生成し、クリア済みリサートのタンパク質濃度を計算します。

プルダウン

18. 2つの新鮮な1.5 mLマイクロ遠心管チューブに「コントロール」、もう1本を「テスト」とラベル付けします。
19. これらのチューブのそれぞれに500 μgの事前にクリアされたライサートを置きます。
    注:ここで使用されるタンパク質の量は、精製を希望するタンパク質の量に依存する。
20. ライシスバッファーを使用して、各チューブの合計体積を最大 500 μL まで持ち上げます。
21. 試験群チューブに2μgの抗c-myc抗体を添加し、2μgマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体を対照群に添加する。
    注:抗体の量は、抗体の有効性と標的タンパク質の量に依存します。
22. 冷たい部屋(4°C)の回転子の管を2時間インキュベートする。
23. 各チューブに20μLタンパク質A/G PLUSアガロースビーズを追加します。
    注:ビーズの損傷を防ぐために、エンドカットでピペットの先端を使用することをお勧めします。
24. 冷たい部屋(4°C)で一晩回転子でインキュベートします。
    注:標的タンパク質および抗体の有効性に応じて、このステップは1時間から一晩に変化しうる。
25. 30 s 4°Cでチューブを遠心分離し、ビーズを引き下げてください。
26. 各チューブから上清を吸引します。
    注:標的タンパク質がビーズに結合するようになりました。
27. 500 μL 1X ダルベッコのPBSを使用してビーズを2回洗います。
28. 30 s 4°Cで3200のrpmで管を遠心分離する。
    注:より厳格な洗浄を行うには、RIPA などのより厳格なバッファを使用します。
29. 各チューブからバッファを吸引します。ゲルローディングの先端を使用して、ビーズから残りのバッファーを取り除き、ビーズを氷の上に保ち、タンパク質を溶出します。
    注:この例では、タンパク質は、ウェスタンブロット分析用にビーズを沸騰させることにより、SDS-PAGE実行バッファーにタンパク質をタンパク質にタンパク質でタンパク質にタンパク質でタンパク質にタンパク質でタンパク質を再生します。このアプローチは、IP結果を検証したり、タンパク質とタンパク質の相互作用を調べたりするのに適しています。構造または酵素解析のためのタンパク質の精製などの他の下流アプリケーションでは、エピトープタグ(フラグタグまたはmyc-tag)などのより洗練されたシステムが目的のタンパク質を有する抗体の溶出を避けるために使用される。

2. ウェスタンブロット解析を用いるIP検証

SDS-PAGE 電気泳動:

1. β-メルカプト-エトノールを含む20 μL SDS-PAGE負荷染料でビーズを再停止します。
2. サンプルを95°Cで5分間沸騰させます。
3. ビーズを室温で10sの13,000 rpmで遠心分離します。
4. ゲルローディングの先端を使用して、ビーズから得られたサンプルを慎重に配管し、4-15%の勾配SDS-PAGEゲルの井戸にロードします。
5. サンプルに加えて、タンパク質のはしごを持つレーンと、事前にクリアされたライサテを持つレーンをロードして、ローディングコントロールとして機能します。
6. 染料の前部がゲルの底に達するまで100Vで走る(~1h)。

ウェスタンブロット分析:

7. 西洋のブロットサンドイッチを作り、PVDF膜がゲルと赤陰極の間であることを確認します。
8. 100Vで1時間の転送。
9. 低設定のロッカー上で1時間の室温で5mLブロッキングバッファーに膜を置き、非特異的タンパク質結合部位を遮断する。
   注:ブロッキングバッファー、一次抗体、二次抗体、および洗後の体積は、より大きなサイズのブロットに対して増加する必要がある場合があります。
10. 低い設定でロッカーで4°Cで一晩ブロッキングバッファーに5 mL抗c-myc抗体でブロットをインキュベートします。
    注:ここで使用する抗体は、プルダウンステップで使用される抗体とは異なる必要があります。
11. 5 mL TBST を使用してブロットを 3~6 回洗浄し、各洗浄は低い設定でロッカーの室温で 5 分です。
12. HRPタグ付き抗ウサギ軽鎖二次抗体をブロッキングバッファーに入れ、低設定でロッカーの室温で1時間インキュベートします。
    注:二次抗体の選択は、ウェスタンブロットに使用される一次抗体に依存します。さらに、標的タンパク質が抗体の重鎖に分子量に近いため、軽鎖特異的二次二次がプロトコルで使用される。標的タンパク質が50kDaに近い場合は、軽鎖特異的二次を使用する。標的タンパク質が25kDaに近い場合は、重鎖特異的二次を使用する。
13. 5 mL TBST を使用してブロットを 3~6 回洗浄し、各洗浄は低い設定でロッカーの室温で 5 分です。
14. 余分な液体を除去するために実験室のワイプのブロットおよびダブエッジから液体を取り除く。
15. 1xケミルミネッセンス検出試薬でブロットをカバーし、1分間インキュベートします。
    注:検出試薬は軽く、時間に敏感であるので、次のステップは迅速に連続して行われるべきである。
16. 余分な検出試薬を除去するために実験室のワイプのブロットのダブ端。
17. イメージャートレイのイメージング面にブロットを配置します。
    注:ケミルミネッセンスブロットは、フィルムを使用して視覚化することもできます。
18. 「ケミルミネッセンスプログラム」を使用して、10~5分の複数のタイムポイントをキャプチャする画像。
    注:最適な時間は、タンパク質の量と抗体の質に基づいて変化する可能性があります。
19. 最適なバンドの可視性を持つ画像を選択し、そのイメージを書き出します。
20. ブロットを移動する前に、イメージャーを使用してブロットの写真を撮り、はしごの位置をキャプチャする。次に、そのイメージもエクスポートします。
21. スライド準備ソフトウェア (PowerPoint など) を使用して、バンドとラダー イメージを位置合わせして単一のイメージを形成します。

免疫沈降(IP)は、タンパク質の特性評価やタンパク質間相互作用の研究のために、細胞や組織の溶解物、または体液から目的のタンパク質を単離するために広く使用されている手法です。

このプロセスは、標的タンパク質に対して高い親和性と特異性を持つ抗体から始まります。この抗体をサンプルと混合することで、抗体-標的複合体を形成できます。標的タンパク質に結合したタンパク質は、その過程で間接的に抗体に結合します。次に、溶液をアガロースビーズとインキュベートし、抗体の定常領域に対して強い親和性を持つ細菌タンパク質に結合させます。細菌タンパク質は抗体に結合し、抗体-標的複合体をビーズに結合します。次に、溶液を遠心分離してビーズを沈殿させ、それにより、結合抗体、標的タンパク質、および相互作用するタンパク質を含む複合体全体を抽出します。最後に、結合したタンパク質はビーズから抽出され、互いに放出され、ウェスタンブロッティングなどの技術によるさらなる分析に使用されます。

この手法のさまざまな部分のいくつかのバリエーションが一般的に使用され、例えば、プレクリア、ペプチドタグや磁気ビーズの使用、他の非タンパク質結合パートナーの分析などがあります。IPの前には、サンプル中の非特異的な抗体結合タンパク質を除去し、バックグラウンドを最小限に抑えるためのプレクリアステップを設けることができます。これには、まずサンプルをアイソタイプコントロール抗体とインキュベートし、これらのタンパク質に結合させた後、アガロースビーズを使用して複合体を沈殿させることが含まれます。これで、サンプルは実際のIPに進む準備が整いました。

ペプチドタグは、特定の抗体がIPに利用できない場合に役立ちます。ここでは、標的タンパク質をペプチドエピトープタグを含むように遺伝子改変することができ、タグに対する抗体は目的のタンパク質を引き出すことができる。アガロースの代わりに磁気ビーズを使用してターゲットを沈殿させることがよくあります。抗体-標的複合体に結合した後、サンプルチューブを強い磁場の中に入れ、溶液からビーズを抽出します。これにより、遠心分離が不要になり、速度と利便性が向上します。

免疫沈降は、DNAまたはRNA結合タンパク質の研究にも使用され、それぞれクロマチン免疫沈降およびRNA免疫沈降として知られています。これらのバリエーションは、トラブルシューティングを行い、さまざまな実験アプリケーションへの分析法の適応に役立ちます。このビデオでは、細胞ライセートを事前にクリアし、免疫沈降を行って目的のタンパク質を抽出する方法、続いてウェスタンブロット分析を行って実験を検証する方法を観察します。

まず、事前に採取した細胞を微量遠心分離機に置き、13,000rpmで3分間回転させます。スピン後、上清を除去し、PMSFを含む500マイクロリットルの溶解バッファーRIPAに細胞を再懸濁します。次に、渦巻きでいくつかのクイックパルスを使用して細胞を破壊し、次にシリンジに取り付けられた25ゲージの針でライセートを数回吸引します。細胞を氷の上に15分間置きます。サンプルを氷上でインキュベートした後、ライセートを摂氏4度で15分間遠心分離します。

新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブにラベルを付けます。スピン後、上清を新たに標識したチューブに移し、ペレットを廃棄します。次に、アガロースビーズまたは一次抗体のいずれかに非特異的に結合する汚染物質のライセートを、20 μリットルのProtein A/G PLUS-アガロースビーズと1 μgのアイソタイプコントロール抗体をライセート(この例ではマウスIgG1アイソタイプコントロール)に添加して、事前に透明化します。チューブをローテーター上で冷蔵室で30分間インキュベートします。冷蔵室でライセートを30分間回転させた後、サンプルを3200rpmで摂氏4度で30秒間遠心分離します。遠心分離機からチューブを取り外し、事前に透明化した上清を新しい標識された1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。ペレットを捨てます。

次に、Bradfordアッセイを実行して、細胞溶解物のタンパク質濃度を決定します。ラベル 7 1.5ミリリットルの微量遠心チューブ1〜6本、およびブラッドフォード試薬の1000マイクロリットルを各チューブにサンプリングして分注します。6 本のチューブを使用して、既知の量の BSA をさまざまな量に各チューブに追加することにより、標準曲線を作成します。追加する金額は、この表に記載されています。7番目のサンプルチューブに、事前にクリアしたライセートを1マイクロリットル追加します。7本のチューブのそれぞれから200マイクロリットルを平底の96ウェルプレートの個々のウェルに入れ、各サンプルを3回繰り返して7つのサンプルの3列になるようにします。プレートリーダーで、595ナノメートルの波長を使用してプレートを読み取ります。Excelで標準曲線を作成した後、事前にクリアしたライセートのタンパク質濃度を計算します。

次に、2本の1.5ミリリットル微量遠心チューブ(1本はコントロール用、もう1本はテスト用)に標識します(この例では、c-myc抗体になります)。事前にクリアしたライセート500μgをこれらの各チューブに入れ、溶解バッファーを使用して各チューブの総容量を最大500マイクロリットルにします。次に、2マイクログラムの抗c-myc抗体を試験群チューブに加えます。コントロールには、マウスIgG1アイソタイプコントロール抗体を2マイクログラム追加します。抗体をチューブに加えたら、サンプルを低温室のローテーターに置き、2時間インキュベートします。次に、アガロースビーズを追加します。これを行うには、ピペットチップの端を切り取り、この改良されたチップを使用して、各チューブに200マイクロリットルのProtein A/G PLUS-agarose beadsを追加することをお勧めします。チューブをローテーターで冷蔵室で一晩インキュベートします。

インキュベーション後、ローテーターからチューブを取り外し、微量遠心分離機でライセートを回転させてビーズを引き下げます。スピンが完了したら、遠心分離機からチューブを取り外し、各チューブから上清を吸引します。次に、500マイクロリットルの1X Dulbecco's PBSを使用してビーズを洗浄します。チューブを微量遠心分離機に入れ、摂氏4度で30秒間回転ダウンします。これに続いて、上清を取り除きます。洗浄と遠心分離のステップをもう1回、合計2回繰り返します。マイクロ遠心分離機からチューブを取り外し、各チューブからバッファーを吸引します。ゲルローディングチップを使用して、ビーズから残ったバッファーをすべて取り除き、ビーズを氷上に保持して結合タンパク質を溶出させます。

この例では、タンパク質をウェスタンブロット解析のために沸騰させることにより、SDS-PAGEランニングバッファーに溶出します。これを行うには、β-メルカプトエタノールまたはBMEを含むSDS-PAGEローディング色素20マイクロリットルにビーズを再懸濁します。サンプルを摂氏95度で5分間煮沸し、免疫複合体をビーズから解離します。その後、ビーズを室温で最高速度で10秒間遠心分離します。チューブを微量遠心分離機から取り外し、室温でラックに保持します。ゲルローディングチップを使用して、ビーズからサンプルを慎重にピペットで取り出し、4〜15%グラジエントSDS-PAGEゲルのウェルにロードします。サンプルに加えて、タンパク質ラダーを備えたレーンと、ローディングコントロールとして機能するために事前にクリアされたライセートを備えたレーンをロードします。ゲルがロードされたら、ゲルを100ボルトで泳がせます。

染料の前面がゲルの底に到達した後(約1時間かかります)、ゲルを停止してウェスタンブロットサンドイッチを作成し、PVDFメンブレンがゲルとカソードの間にあることを確認します。ウェスタンブロットサンドイッチを転写装置に置き、ゲル上のタンパク質を100ボルトで1時間メンブレンに移します。転写が完了したら、抗体がメンブレンに非特異的に結合しないように、メンブレンを5ミリリットルのブロックに入れます。室温で1時間、低温で揺さぶる。タイマーが鳴ったら、ブロッキングバッファを取り外します。検出抗体を含むブロッキングバッファーを5ミリリットルをメンブレンに加えます。ここでは、プルダウンに用いるものとは異なる抗c-myc抗体を使用します。

ブロットを摂氏4度で、ロッカーの低温設定で一晩インキュベートします。インキュベーション後、抗体とブロッキングバッファーを取り出します。ブロットを5ミリリットルのTBSTを室温で5分間使用し、ロッカーの低温設定で洗浄します。この洗浄ステップは、洗浄ごとに新しいTBSTを使用して、合計3〜6回の洗浄で2〜5回繰り返す必要があります。1〜1000個の二次抗体とブロッキングバッファーを5ミリリットル加えます。この場合、二次抗体はHRPタグ付き抗ウサギ軽鎖です。ブロットをロッカーの低温設定でインキュベートします。次に、緩衝液を取り出し、5ミリリットルのTBSTでブロットを洗浄します。この洗浄液をロッカーの上で低温で5分間インキュベートします。この洗浄を合計6〜12回繰り返し、各洗浄に新しい5ミリリットルのTBSTを充填します。最初にブロットから液体を注いで、最終的な洗浄液を取り除きます。次に、ピンセットを使用して、ブロットの端を実験室用ワイプで軽くたたいて余分な液体を取り除き、ブロットを新しい容器に入れます。次に、ブロットを1X化学発光検出試薬で覆い、1分間インキュベートします。

素早く作業を進めながら、ラボ用ワイプでブロットの端を軽くたたいて余分な検出試薬を取り除き、ブロットをイメージャートレイのイメージング面に置きます。化学発光プログラムを使用して、10秒から30秒までの複数の時点を撮影した画像。ブロットのイメージング後、最適なバンド視認性の画像を選択し、その画像をエクスポートします。ブロットを移動する前に、イメージャーを使用してブロットの写真を撮り、ラダーの位置をキャプチャします。次に、その画像もエクスポートします。最後に、PowerPointなどのスライド作成ソフトウェアを使用して、バンドとラダー画像を位置合わせして1つの画像を形成します。

この画像は、胸腺細胞からのタンパク質c-mycの免疫沈降のウェスタンブロット結果を示しています。レーンは左から右に、アイソタイプコントロール、c-myc IP、および事前にクリアされたライセート入力を表しています。右端のレーンは、分子量ラダーのマージされた画像です。約25キロダルトンの強いバンドは軽鎖からのもので、50キロダルトンのバンドは結合抗体の重鎖からのもので、IPやサンプルに特異的ではありません。C-mycはウェスタンブロットで約67キロダルトンを実行し、通常は75キロダルトンのラダーバンドのすぐ下に見えます。このブロットでは、c-mycバンドは第2レーンに見えますが、第1レーンには存在せず、IP抗体がc-mycを首尾よく引き下げたことを示しています。事前にクリアされたライセートレーンには目に見えるバンドはなく、このタンパク質の内因性発現レベルが低いことが示唆されています。