免疫沈殿ベースの技術:アガロースビーズを用いた内因性タンパク質の精製

1. タンパク質A/G PLUSアガロースビーズを用した免疫沈殿

細胞リサート製剤

1. 遠心分離機10⁸チモシグネタを13,000rpmのマイクロ遠心分離機で3分間、上清を除去する。
   注:細胞数は、所望のタンパク質の発現レベルと選択した細胞タイプによって異なります。
2. PMSFを使用して500 μLリシスバッファRIPAで細胞を再中断します。
3. 渦でいくつかのクイックパルスを使用して細胞を破壊し、注射器に取り付けられた25G針で数回ライサートを吸引します。
   注:バブルの作成は避けてください。より大きなセルタイプには、21G針などの大きな針を使用します。
4. 細胞を氷上で10分間インキュベートします。
5. 4°Cで15分間13,000rpmでリザートを遠心分離します。
6. 上清を新鮮な標識マイクロ遠心管に移します。

事前清算

7. 20 μLタンパク質A/G PLUSアガロースビーズと1μgのアイソタイプコントロール抗体(ここでは、マウスIgG1アイソタイプコントロール抗体が使用される)をライサートに添加する。
   注:使用されるアイソタイプ抗体の選択は、プルダウン工程の後半で使用されるタンパク質特異的抗体に依存する。
8. 冷たい部屋(4°C)の遠心回転子でリザートミックスを30分間インキュベートします。
9. 4°Cで30sのための3200のrpmでサンプルを遠心分離する。
10. クリア済みの上清を、ラベル付きの1.5mLマイクロ遠心管に移します。ペレットを捨てます。

タンパク質濃度決定

11. ブラッドフォードアッセイを行うことにより、細胞のタンパク質濃度を決定します。
12. アリコート1000 μLブラッドフォード試薬を7マイクロ遠心管に入れます。
13. 次の量の BSA タンパク質標準 (2 mg/mL) をチューブの 6 本に加えます (表 1)。

チューブ番号	BSA 体積 (μL) (2 mg/mL)	タンパク質濃度(μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

表 1:BSAタンパク質標準量

14. ^第7管に、予クリアされたライサトの1μLを加える。
    注:サンプル濃度がアッセイ検出範囲内にあることを確認するには、1:2 または 1:5 のリサート希釈も準備して分析します。
15. 7つのチューブのそれぞれから200 μLを平底の個々のウェルに入れ、各サンプルを三つ編みで繰り返す96ウェルプレートに入れます。
16. 595 nmのプレートリーダーのプレートを読み取ります。
17. Excelで標準曲線を生成し、クリア済みリサートのタンパク質濃度を計算します。

プルダウン

18. 2つの新鮮な1.5 mLマイクロ遠心管チューブに「コントロール」、もう1本を「テスト」とラベル付けします。
19. これらのチューブのそれぞれに500 μgの事前にクリアされたライサートを置きます。
    注:ここで使用されるタンパク質の量は、精製を希望するタンパク質の量に依存する。
20. ライシスバッファーを使用して、各チューブの合計体積を最大 500 μL まで持ち上げます。
21. 試験群チューブに2μgの抗c-myc抗体を添加し、2μgマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体を対照群に添加する。
    注:抗体の量は、抗体の有効性と標的タンパク質の量に依存します。
22. 冷たい部屋(4°C)の回転子の管を2時間インキュベートする。
23. 各チューブに20μLタンパク質A/G PLUSアガロースビーズを追加します。
    注:ビーズの損傷を防ぐために、エンドカットでピペットの先端を使用することをお勧めします。
24. 冷たい部屋(4°C)で一晩回転子でインキュベートします。
    注:標的タンパク質および抗体の有効性に応じて、このステップは1時間から一晩に変化しうる。
25. 30 s 4°Cでチューブを遠心分離し、ビーズを引き下げてください。
26. 各チューブから上清を吸引します。
    注:標的タンパク質がビーズに結合するようになりました。
27. 500 μL 1X ダルベッコのPBSを使用してビーズを2回洗います。
28. 30 s 4°Cで3200のrpmで管を遠心分離する。
    注:より厳格な洗浄を行うには、RIPA などのより厳格なバッファを使用します。
29. 各チューブからバッファを吸引します。ゲルローディングの先端を使用して、ビーズから残りのバッファーを取り除き、ビーズを氷の上に保ち、タンパク質を溶出します。
    注:この例では、タンパク質は、ウェスタンブロット分析用にビーズを沸騰させることにより、SDS-PAGE実行バッファーにタンパク質をタンパク質にタンパク質でタンパク質にタンパク質でタンパク質にタンパク質でタンパク質を再生します。このアプローチは、IP結果を検証したり、タンパク質とタンパク質の相互作用を調べたりするのに適しています。構造または酵素解析のためのタンパク質の精製などの他の下流アプリケーションでは、エピトープタグ(フラグタグまたはmyc-tag)などのより洗練されたシステムが目的のタンパク質を有する抗体の溶出を避けるために使用される。

2. ウェスタンブロット解析を用いるIP検証

SDS-PAGE 電気泳動:

1. β-メルカプト-エトノールを含む20 μL SDS-PAGE負荷染料でビーズを再停止します。
2. サンプルを95°Cで5分間沸騰させます。
3. ビーズを室温で10sの13,000 rpmで遠心分離します。
4. ゲルローディングの先端を使用して、ビーズから得られたサンプルを慎重に配管し、4-15%の勾配SDS-PAGEゲルの井戸にロードします。
5. サンプルに加えて、タンパク質のはしごを持つレーンと、事前にクリアされたライサテを持つレーンをロードして、ローディングコントロールとして機能します。
6. 染料の前部がゲルの底に達するまで100Vで走る(~1h)。

ウェスタンブロット分析:

7. 西洋のブロットサンドイッチを作り、PVDF膜がゲルと赤陰極の間であることを確認します。
8. 100Vで1時間の転送。
9. 低設定のロッカー上で1時間の室温で5mLブロッキングバッファーに膜を置き、非特異的タンパク質結合部位を遮断する。
   注:ブロッキングバッファー、一次抗体、二次抗体、および洗後の体積は、より大きなサイズのブロットに対して増加する必要がある場合があります。
10. 低い設定でロッカーで4°Cで一晩ブロッキングバッファーに5 mL抗c-myc抗体でブロットをインキュベートします。
    注:ここで使用する抗体は、プルダウンステップで使用される抗体とは異なる必要があります。
11. 5 mL TBST を使用してブロットを 3~6 回洗浄し、各洗浄は低い設定でロッカーの室温で 5 分です。
12. HRPタグ付き抗ウサギ軽鎖二次抗体をブロッキングバッファーに入れ、低設定でロッカーの室温で1時間インキュベートします。
    注:二次抗体の選択は、ウェスタンブロットに使用される一次抗体に依存します。さらに、標的タンパク質が抗体の重鎖に分子量に近いため、軽鎖特異的二次二次がプロトコルで使用される。標的タンパク質が50kDaに近い場合は、軽鎖特異的二次を使用する。標的タンパク質が25kDaに近い場合は、重鎖特異的二次を使用する。
13. 5 mL TBST を使用してブロットを 3~6 回洗浄し、各洗浄は低い設定でロッカーの室温で 5 分です。
14. 余分な液体を除去するために実験室のワイプのブロットおよびダブエッジから液体を取り除く。
15. 1xケミルミネッセンス検出試薬でブロットをカバーし、1分間インキュベートします。
    注:検出試薬は軽く、時間に敏感であるので、次のステップは迅速に連続して行われるべきである。
16. 余分な検出試薬を除去するために実験室のワイプのブロットのダブ端。
17. イメージャートレイのイメージング面にブロットを配置します。
    注:ケミルミネッセンスブロットは、フィルムを使用して視覚化することもできます。
18. 「ケミルミネッセンスプログラム」を使用して、10~5分の複数のタイムポイントをキャプチャする画像。
    注:最適な時間は、タンパク質の量と抗体の質に基づいて変化する可能性があります。
19. 最適なバンドの可視性を持つ画像を選択し、そのイメージを書き出します。
20. ブロットを移動する前に、イメージャーを使用してブロットの写真を撮り、はしごの位置をキャプチャする。次に、そのイメージもエクスポートします。
21. スライド準備ソフトウェア (PowerPoint など) を使用して、バンドとラダー イメージを位置合わせして単一のイメージを形成します。