ウィノグラツキーカラムの作成:堆積物サンプル中の微生物種を濃縮する方法

1. セットアップ

1. Winogradsky 列を設定するには、基本的な消耗品が必要です。
   • シャベル、バケツ、ボトルを使用して、現場でサンプルを収集
   • ●約1Lの等級シリンダーやプラスチック製水筒などの縦透明容器
   • プラスチックラップとゴムバンド
   • 大きなミキシングボウルと大きなスプーンをかき混ぜる
   • 硫黄源(卵黄または硫酸カルシウム)
   • 有機炭素の供給源(セルロース、細断された新聞の形で)
   • 光源(日当たりの良い窓またはデスクランプ)
   • 湿地、湿地、池、または河川から採取された土壌または泥
   • 同じ生息地からの水
   • オプション このプロトコルで説明するオプションの実験の一部には、次のことが必要です。
     • テーブルソルト
     • 異なる色のセロファン
     • 鉄の供給源(釘やスチールウールなど)
     • 光源付き冷蔵庫
     • 光源の近くのラジエーター
2. プラスチック製の水筒を使用する場合は、柱が円筒形になるように首の領域を切り取ります。光がプラスチックを貫通できるように、ラッパーを取り外します。
3. 生卵にはサルモネラ菌が含まれている可能性があり、注意して取り扱う必要があります。適切な手洗い技術に従う必要があります。また、ゆで卵を用いることができる。また、泥や土砂が下水やその他の有害物質で汚染されているかどうかを確認する方法はありません。泥を混ぜてカラムを設定する際には、手袋を使用する必要があります。

2. ウィノグラツキーコラムの組み立て

1. シャベルを使用して、掘り起こし、バケツに泥を収集します。堆積物は水の端の近くにあり、完全に水で飽和する必要があります。各ウィノグラツキーの列を埋めるのに十分な泥が必要です。同じソースからサンプルボトルに水を取り込みます(カラムあたり約3000mLが必要です)。
2. ラボでは、1リットルのボリュームカラムの約75%を充填するために、最初の混合ボウルに十分な泥を転送します。次に、スプーンを使用して塊を分解しながら、大きな岩、小枝、または葉を取り除くためにふるみます。
3. 攪拌しながら、ミキシングボウルに集めた水の一部を追加します。水泥混合物の一貫性がミルクセーキのようなものになるまで追加します。引き続き、束がないことを確認します。
4. 水泥ミルクセーキの約1/3を第2のボウルに移します。卵黄と細断された新聞の一握りを追加し、ミックス。
5. カラムが約1/4になるまで、泥、卵黄、新聞の混合物を列に追加します。
6. 列が約3/4がいっぱいになるまで、通常の水泥混合物を列に追加します。
7. 柱に水を追加し、上部に空気の小さなスペース(約1/2インチ)を残します。
8. カラムをラップで覆い、ゴムバンドで固定します。
9. カラムを室温で光の中でインキュベートします。
10. 次の4~8週間は、表1に示すように、異なる色の層の発達と気泡の形成のためにウィノグラツキー列の変化を監視します。さらに、異なるレイヤーの開発にかかる時間を記録する必要があります。

3. 古典的なウィノグラツキー列へのオプションの変更

1. 水を加えて攪拌する前に、収集した泥に1Lウィノグラツキーカラムあたり25-50gの塩を加えます(ステップ2.3)。塩の添加は、ハロフィリック(塩を愛する)細菌のために選択します。
2. 鉄などの代替基板は、爪またはスチールウールの形で、卵黄と細断された新聞と一緒にカラムに追加することができます(ステップ2.4)。これは、ガルニオレラなどの鉄酸化細菌を濃縮し、錆色の層として表示されます。
3. 室温(ステップ2.9)の代わりに、カラムをラジエーターの近くでインキュベートして、熱性(熱好き)細菌を選択したり、発光性(冷たい)細菌を選択する光源を持つ冷蔵庫で選択することができます。
4. カラムがインキュベートする時に受け取る光の量(ステップ2.9)は、高光、低光、または暗い中に異なる柱を配置することによっても変化させることができる。
5. 入ってくる光の波長は、異なる細菌群に対して選択する色を決定するために、異なるシェードセロファンでカラムを覆うことによって制限することができます(ステップ2.9)。

4. データ分析

1. 1-3週間後、古典的なウィノグラツキー列の泥層の上にいくつかの緑色の着色が表示されるはずです(図2A)。これらは、シアノバクテリア層の成長の最初の兆候です。
2. 時間が経つにつれて、異なる層の外観と進化を監視し続け、それぞれ異なる細菌タイプを示します。ヒント:異なる層に寄与する細菌を理解するには、概念と表 1 を参照してください。

図 2A:室温で21日間インキュベートした古典的なウィノグラツキーカラムの写真。カラムの上部にシアノバクテリアを示す緑色の堆積物に注意してください。

3. 従来の Winogradsky 列の変更も準備されている場合は、各列の結果を比較します。
   1. 変更された各ウィノグラツキー列のレイヤーを観察します。次の点に注意してください。
      • 列は同じ数のレイヤーを示しますか?
      • レイヤーの色と厚さは同じですか?
      • レイヤーは同じ深さで発生しますか?
      • 各列の開発にはどのくらいの時間がかかりましたか。
      • 1つの列は他の列よりもゆっくりと発展しましたか?