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ソース: エリザベス・スーター1, クリストファー・コルボ1, ジョナサン・ブレイズ1
1ワーグナーカレッジ生物科学科、1キャンパスロード、スタテンアイランドニューヨーク、10301
ウィノグラツキーのコラムは、堆積物微生物群集、特に硫黄循環に関与する人々を豊かにするために使用される、小型で囲まれた生態系です。このカラムは1880年代にセルゲイ・ウィノグラツキーによって最初に使用され、以来、光合成器、硫黄酸化剤、硫酸還元剤、メタンゲン、鉄酸化剤、窒素などの生物地球化学に関与する多くの多様な微生物の研究に適用されています。サイクラー、およびより多く(1,2)。
地球上の微生物の大半は、試験管やペトリ皿(3)で単離できないことを意味し、培養不可能と考えられています。これは、微生物が特定の代謝産物のために他の人に依存することを含む多くの要因によるものです。ウィノグラツキーのカラムの条件は、他の生物との相互作用を含む微生物の自然生息地を密接に模倣し、実験室で成長することを可能にする。そのため、この技術は、科学者がこれらの生物を研究し、それらが単独で成長することなく、地球の生物地球化学サイクルにとってどのように重要であるかを理解することを可能にします。
地球の環境は、土壌、海水、雲、深海堆積物など、あらゆる種類の生息地で繁栄する微生物でいっぱいです。すべての生息地では、微生物はお互いに依存しています。微生物が成長するにつれて、糖などの炭素が豊富な燃料や栄養素、ビタミン、酸素などの気道ガスなど、特定の基質を消費します。これらの重要な資源がなくなったら、異なる代謝ニーズを持つ異なる微生物が咲き、繁栄することができます。たとえば、Winogradsky 列では、微生物はまずカラムの下層の酸素を枯渇させながら、追加された有機材料を消費します。酸素が使い切られると、嫌気性生物が引き継ぎ、異なる有機材料を消費することができます。時間の経過とともに異なる微生物群相のこの連続的な発達は、継承(4)と呼ばれる。微生物の継承は、微生物の活動が堆積物の化学を変化させ、他の微生物の活動などに影響を与えるウィノグラツキーカラムで重要です。土壌や堆積物の多くの微生物も、基板の濃度に基づいて2種類の生息地間の遷移ゾーンである勾配に沿って生息しています(5)。グラデーションの正しい場所で、微生物は異なる基板の最適な量を受け取ることができます。ウィノグラツキーカラムが発達するにつれて、特に酸素と硫化物において、これらの自然勾配を模倣し始める(図1)。
図 1:ウィノグラツキーカラムで発生する酸素(O2)および硫化物(H2S)勾配の表現。
ウィノグラツキーのカラムでは、池や湿地の泥と水が透明な柱に混入し、通常は光の中でインキュベートすることができます。追加の基板は、通常、セルロース、および硫黄の形で、炭素のコミュニティソースを与えるために列に追加されます。フォトシンセサイザーは、通常、堆積物の最上層で成長し始めます。これらの光合成微生物は、酸素を産生し、緑または赤褐色の層として現れるシアノバクテリアからなる(図2、表1)。光合成は酸素を生成しますが、酸素は水にあまり溶け込んでおらず、この層の下に減少します(図1)。これは、最上層の高濃度の酸素から下層のゼロ酸素に至るまで、酸素の勾配を作成します。酸素化層は好気性層と呼ばれ、酸素のない層は嫌気性層と呼ばれています。
嫌気性層では、利用可能な基板の種類と量、初期微生物の供給源、および堆積物の多孔性に応じて、多くの異なる微生物群集が増殖する可能性があります。コラムの下部には、嫌気的に有機物を分解する生物が繁栄します。微生物発酵は、セルロースの分解から有機酸を生成します。これらの有機酸は、硫酸塩を使用してそれらの有機物を酸化し、副産物として硫化物を生成する硫酸塩還元剤によって使用することができます。硫酸塩還元器の活性は、鉄と硫化物が黒い硫化物鉱物を形成するために反応するため、堆積物が黒くなる場合に示される(図2、表1)。また、硫化物も上向きに拡散し、カラムの下部に硫化物濃度が高く、カラムの上部が低い別の勾配を作成します(図1)。
カラムの中央付近では、硫黄酸化剤は、上からの酸素の供給と下からの硫化物を利用します。光の適切な量で、光合成硫黄酸化剤は、これらの層で開発することができます。これらの生物は、緑と紫の硫黄細菌として知られており、しばしば緑色、紫色、または紫色のフィラメントやしみとして現れます(図2、表1)。緑色の硫黄細菌は硫化物に対する耐性が高く、通常は紫色の硫黄細菌のすぐ下の層で発症する。紫色の硫黄細菌の上に、紫色の非硫黄細菌も発症する可能性があります。これらの生物は、硫化物の代わりに電子ドナーとして有機酸を使用して光合成し、しばしば赤、紫、オレンジ、または茶色の層として現れます。非光合成硫黄酸化剤は紫色の非硫黄細菌の上に発症する可能性があり、これらは通常白いフィラメントとして現れます(図2、表1)。さらに、ウィノグラツキー列にも気泡が形成される場合があります。好気性層の気泡は、シアノバクテリアによる酸素の産生を示す。嫌気性層の気泡は、嫌気的に有機物を分解し、副産物としてメタンを形成するメタノゲンの活性に起因する可能性が高い。
| 列内の位置 | 機能グループ | 生物の例 | ビジュアルインジケータ |
| ページのトップへ | フォトシンスサイザー | シアノ バクテリア | 緑または赤褐色の層。時々酸素の泡。 |
| 非光合成硫黄酸化剤 | ベッジアトア,ティオバシラス | 白い層。 | |
| 紫色の非硫黄細菌 | ロドミクロビウム、ロドスピリラム、ロドプスオドモナス | 赤、紫、オレンジ、または茶色のレイヤー。 | |
| 紫色の硫黄細菌 | クロマチウム | 紫、または紫赤のレイヤー。 | |
| 緑硫黄細菌 | クロロビウム | 緑のレイヤー。 | |
| 硫酸還元菌 | デスルフォビブリオ、デスルホトマキュラム、デスルフォバクター、デスルフロモナス | 黒い層。 | |
| 下部 | メタノゲン | メタノコッカス,メタノサルシナ | 時々メタンの泡。 |
表 1:古典的なウィノグラツキーの列に上から下に現れるかもしれない細菌の主なグループ。各グループの生物の例を示し、生物の各層の視覚的指標を列挙する。ペリーら(2002年)とローガンら(2005年)に基づく。
1. セットアップ
2. ウィノグラツキーコラムの組み立て
3. 古典的なウィノグラツキー列へのオプションの変更
4. データ分析
図 2A:室温で21日間インキュベートした古典的なウィノグラツキーカラムの写真。カラムの上部にシアノバクテリアを示す緑色の堆積物に注意してください。
地球の微生物のほとんどは、多くの場合、彼らのネイティブコミュニティ内の他の微生物に依存しているので、研究室で培養することはできません。発明者セルゲイ・ウィノグラツキーにちなんで名付けられたウィノグラツキーのコラムは、堆積物サンプル内の微生物群集を豊かにする小型で囲まれた生態系であり、科学者は地球で重要な役割を果たす微生物の多くを研究することを可能にする。バイオジオケミカルプロセスは、それらを個別に分離し、培養する必要はありません。
通常、池や湿地などの生態系の泥と水は混在します。任意実験として、塩は、様々なハロフィル種を豊かにするために、この混合物に添加することができる。次に、混合物の小さな部分は、通常、新聞からセルロースの形で、通常、卵黄から、炭素で補充される。別の任意実験のために、特定のガリオネラ種を豊かにするために、この混合物に釘を追加することができます。この新しい混合は透明な列に追加され、列が四半期で満杯になります。最後に、泥の混合物の残りの部分とより多くの水は、それが完全な方法のほとんどがいっぱいになるまで、列に追加されます。
連続は、時間の経過とともに異なる微生物群相の連続的な発達を指し、ウィノグラツキー列を使用してリアルタイムで観察することができる。微生物はカラム内で成長するにつれて、特定の基板を消費し、環境の化学を変化させます。基板が枯渇すると、元の微生物は消滅し、異なる代謝ニーズを持つ微生物は、変化した環境で繁栄することができます。時間が経つにつれて、目に見えて異なる層が形成され始め、それぞれが異なる微小環境ニーズを持つ細菌コミュニティの一部を含む。
例えば、光合成微生物は、主にシアノバクテリアから構成され、柱の上部付近に緑色または赤褐色の層を形成する。光合成は、カラムの上部に気泡としてよく見られる酸素を生成するため、勾配は上部付近の酸素濃度が最も高く、下部に向かって最も低い値で形成されます。利用可能な基板に応じて、異なる微生物群が嫌気性底層で成長し得る。この層の気泡は、発酵を介してメタンガスを作成するメタノゲンの存在を示すことができます。ここで、セルロースの微生物発酵は有機酸をもたらす。硫酸塩還元剤は、硫化物を生成するためにそれらの酸を酸化し、それらの活性は黒い堆積物によって示されます。硫化物は列内で上向きに拡散し、硫化物濃度が列の下部に向かって最も高く、上部付近で最も低いグラデーションを作成します。カラムの中央に向かって、硫黄酸化剤は、上から酸素を利用し、下から硫化物。十分な光で、緑や紫硫黄細菌などの光合成硫黄酸化剤が発生します。緑の硫黄細菌は、より高い硫化物濃度を許容します。したがって、それらは紫色の硫黄細菌の真下に成長する。この層の真上に、紫色の非硫黄細菌が赤オレンジ色の層を形成する。非光合成硫黄酸化剤は、白フィラメントの存在によって示される。
光や温度などの条件は、他のコミュニティを豊かにするためにも変化することができます。このビデオでは、Winogradsky列を構築する方法を学び、特定の微生物群を豊かにするために成長条件と基板を変化させます。
まず、池や湿地などの適切な水生生態系を見つけます。堆積物のサンプルは、水の端の近くの領域から来て、完全に水で飽和する必要があります。その後、シャベルとバケツを使用して、飽和泥の1〜2リットルを収集します。次に、同じ源から約3リットルの淡水を得て、現場サンプルを使用してラボに戻ります。
ラボでは、ラボコートや手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。さて、約750ミリリットルの泥を混合ボウルに移します。その後、大きな岩、小枝、または葉を除去するために泥をふるし、任意の塊を分解するためにスプーンを使用しています。次に、ミキシングボウルに淡水の一部を追加し、大きなスプーンでかき混ぜます。水泥混合物の一貫性がミルクセーキに似るまで水を追加します。引き続き、束がないことを確認します。
任意実験として、泥混合物に25~50ミリグラムの塩を加えて好気性細菌を選択する。
次いで、水泥混合物の約1/3を第2混合ボウルに移す。卵黄1個と細断された新聞をボウルに加えます。次に、この混合物を約1/4がいっぱいになるまでカラムに追加します。次に、卵と新聞を含まない水泥混合物を列に加え、約3/4になるまで満杯になるまで。次に、列に水を追加し、上部に 1/2 インチのスペースを残します。カラムをラップで覆い、ゴムバンドで固定します。
次の4〜8週間、室温で窓の近くの光でカラムをインキュベートします。インキュベーション期間を通じて、異なる色の層の発達と気泡の形成のために、少なくとも週に1回はウィノグラツキー列の変化を監視します。さらに、異なるレイヤーの開発にかかる時間を記録します。
行うことができる別の変更は、好温性細菌のために選択するラジエーターの近くにカラムをインキュベートするか、または精神好き細菌のために選択する冷蔵庫でです。高い光、低光、または暗闇に異なる柱を配置して、インキュベートすることで、光条件を変化させる。あるいは、セロファンの異なる色合いでカラムを覆って、異なる細菌群に対して選択する色を決定することによって、入ってくる光の波長を制限します。別の任意実験のために、鉄酸化細菌を濃縮するために、新聞と卵黄を添加する前に泥水混合物に釘を追加する。
1〜2週間後、シアノバクテリア層の増殖は、古典的なウィノグラツキー列の泥層の上に緑色または赤褐色のフィルムによって示される。時間が経つにつれて、異なる層の外観と進化が監視され、それぞれが存在する異なる種類の細菌を示す。暗闇で成長したカラムと伝統的なウィノグラツキーのコラムを比較すると、暗い処理によってカラムの下部に黒い層が生成され、硫酸塩を減少させる細菌が示されます。
暗いカラムはまた、他のインキュベーション条件に応じて、他の層を生み出し得る。さらに、暗い列は、緑色のシアノバクテリア層、また紫色の非硫黄、紫色の硫黄、および緑色の硫黄細菌を示す赤、紫、または緑の層をそれぞれ得ることはありません。これらのグループは、成長のための光に依存しています。
地球上の微生物のほとんどは、多くの場合、自生のコミュニティ内の他の微生物に依存しているため、実験室で培養することができません。発明者のセルゲイ・ウィノグラツキーにちなんで名付けられたWinogradskyの柱は、堆積物サンプル内の微生物群集を豊かにするミニチュアの閉鎖型生態系であり、科学者は地球の生物地球化学的プロセスで重要な役割を果たす多くの微生物を個別に分離して培養することなく研究することができます。
通常、池や沼地などの生態系からの泥と水は混合されます。オプションの実験として、この混合物に塩を添加して、さまざまな好塩性生物種を濃縮することができます。次に、混合物のごく一部に、通常は新聞紙由来のセルロースの形で炭素を、通常は卵黄から採取した硫黄を補給します。別のオプションの実験では、この混合物に釘を追加して、特定のガリオネラ種を強化できます。次に、この新しい混合物を透明なカラムに加え、カラムの4分の1が満たされます。最後に、残りの泥混合物とさらに水がカラムに追加され、ほぼいっぱいになるまでカラムが追加されます。
サクセションとは、異なる微生物群集が経時的に連続的に発展することを指し、Winogradskyカラムを用いてリアルタイムで観察することができます。微生物がカラム内で増殖すると、特定の基質を消費し、環境の化学的性質を変化させます。それらの基質が枯渇すると、元の微生物は死滅し、異なる代謝ニーズを持つ微生物が変化した環境で繁栄することができます。時間が経つにつれて、目に見えるように異なる層が形成され始め、それぞれに異なる微小環境ニーズを持つ細菌群集の一部が含まれています。
例えば、主にシアノバクテリアで構成される光合成微生物は、カラムの上部付近に緑色または赤茶色の層を形成します。光合成は酸素を生成するため、カラムの上部に気泡として見られることが多いため、上部付近に酸素濃度が最も高く、下部に向かって最も低い勾配が形成されます。利用可能な基質に応じて、嫌気性最下層で異なる微生物群集が増殖する可能性があります。この層の気泡は、発酵によってメタンガスを生成するメタン生成菌の存在を示している可能性があります。ここでは、セルロースの微生物発酵により有機酸が得られます。硫酸塩還元剤は、これらの酸を酸化して硫化物を生成し、その活性は黒い沈殿物によって示されます。硫化物はカラム内で上向きに拡散し、さらに別のグラジエントを作り出し、硫化物濃度はカラムの下部に向かって最も高く、上部近くで最も低くなります。カラムの中央に向かって、硫黄酸化剤は上からの酸素と下からの硫化物を利用します。適切な光が当たると、緑色や紫色の硫黄バクテリアなどの光合成硫黄酸化剤が発生します。緑色の硫黄バクテリアは、より高い硫化物濃度を許容します。したがって、それらは紫色の硫黄細菌の真下で成長します。この層の真上には、紫色の非硫黄バクテリアが赤オレンジ色の層を形成しています。非光合成硫黄酸化剤は、白いフィラメントの存在によって示されます。
光や温度などの条件も変えて、他のコミュニティを豊かにすることができます。このビデオでは、Winogradskyカラムの構築方法と、成長条件と基質を変化させて特定の微生物群集を濃縮する方法を学びます。
まず、池や沼地などの適切な水生生態系を見つけます。堆積物サンプルは、水辺近くの領域から採取され、水で完全に飽和している必要があります。次に、シャベルとバケツを使用して、飽和した泥を1〜2リットル収集します。次に、同じ水源から約3リットルの淡水を取得し、フィールドサンプルを持ってラボに戻ります。
ラボでは、白衣や手袋など、適切な個人用保護具を着用してください。次に、約750ミリリットルの泥をミキシングボウルに移します。次に、泥をふるいにかけ、大きな岩、小枝、または葉を取り除き、スプーンを使用して塊をバラバラにします。次に、ミキシングボウルに真水を加え、大きなスプーンでかき混ぜます。水と泥の混合物の粘稠度がミルクセーキに近くなるまで水を追加します。引き続き、塊がないことを確認します。
オプションの実験として、泥混合物に25〜50ミリグラムの塩を加えて好塩性細菌を選択します。
次に、水と泥の混合物の約1/3を2番目のミキシングボウルに移します。ボウルに卵黄1個と細かく刻んだ新聞紙を一握り加えます。次に、この混合物をカラムに約1/4いっぱいになるまで加えます。次に、卵と新聞紙を含まない水と泥の混合物を、約3/4がいっぱいになるまで列に加えます。次に、カラムに水を追加し、上部に1/2インチのスペースを残します。カラムをラップで覆い、輪ゴムで固定します。
カラムを窓の近くの光の下で室温で4〜8週間インキュベートします。インキュベーション期間中は、少なくとも週に1回、Winogradskyカラムの変化を監視して、さまざまな色の層の発達と気泡の形成を確認します。さらに、さまざまなレイヤーが開発されるのにかかる時間を記録します。
可能な別の変更は、ラジエーターの近くでカラムをインキュベートして好熱性細菌を選択するか、冷蔵庫で好熱性細菌を選択することです。インキュベートする光条件を変えるには、ハイライト、ローライト、または暗闇に異なるカラムを配置します。あるいは、カラムをさまざまな色合いのセロハンで覆うことで入射光の波長を制限し、さまざまな細菌群に対してどの色を選択するかを決定します。別のオプションの実験として、鉄酸化細菌を濃縮するために、新聞紙と卵黄を追加する前に、泥と水の混合物に釘を追加します。
1〜2週間後、シアノバクテリア層の成長は、古典的なWinogradsky柱の泥層の上にある緑色または赤茶色のフィルムによって示されます。時間の経過とともに、さまざまな層の外観と進化が監視され、それぞれが存在するさまざまな種類の細菌を示しています。暗所で成長させたカラムを従来のWinogradskyカラムと比較すると、暗所処理によりカラムの下部に黒い層が生成され、硫酸塩を減少させる細菌が示唆されます。
暗いカラムは、他のインキュベーション条件に応じて、他の層も生成する場合があります。さらに、暗いカラムでは、緑色のシアノバクテリア層も、紫色の非硫黄、紫色の硫黄、および緑色の硫黄バクテリアを示す赤色、紫色、または緑色の層も生成されません。これらのグループは、成長のために光に依存しています。
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