6.2: シリアル希釈とめっき:微生物列挙

1. セットアップ

1. すべての材料、段階的な実験プロトコル、および消耗品を廃棄する方法を記載したフローチャートは、実験室のノートブックに書かれ、実験用ワークスペースの近くに保管する必要があります。
2. ワークスペースは、適切な消毒剤(70%エタノール)で殺菌する必要があり、実験者はまた、暴露異常からそれらを保護するきれいな実験室の衣服を着用することにより、汚染リスクを軽減する必要があります。適切な衣服には、ラボコート、ラテックスまたはニトリル手袋、グーグル、人工呼吸器、クローズドシューズが含まれますが、これらに限定されません。常に無菌技術を維持することが重要です。
3. 0.45%生理生理の90 mLを調出します。きれいな段階的なシリンダーを使用して、無菌水の90 mLを測定し、0.45%の生理生理知とラベル付けされたきれいなアーレンマイヤーフラスコに移す。塩化ナトリウムの.405 g(シグマアルドリッヒNaCl S9888)の重量を量り、0.45%の生理食塩水を標識したフラスコに加えます。溶質が見えなくなるまで繰り返し旋回します。
4. 完了すると、実験者はすべての表面を再殺菌し、OSHAガイドラインに従って不要な生物、希釈株、ペトリ皿、または使い捨て接種ループを廃棄する必要があります。実験室の衣類は手を洗う前に取除くことができる。

2. メディアの準備

1. 所望の生物の栽培に適した培養媒体を選択します。ほとんどのシナリオでは、スープは十分な細菌の増殖を可能にします。ウィノグラツキープロトコルからの生物がここで望まれているので、炭酸カルシウム、硫黄、セルロース、泥からなるカラムを組み立て、7日間邪魔されずに残しました。前命名のカラムは、好気性、好好気性、嫌気性のセクションに分離されています。
2. 対象の生物をめっきするのにふさわしい媒体を選ぶ。微生物学グレードの寒天を用いる液体媒体の補充は、典型的には固化剤として用いられる。LB培地/寒天は、前名称のカラムの好気性、好好気性および嫌気性領域からのサンプルを収穫する場合に十分である。注:この手順では、マイクロエアロフィルリック領域からのサンプルは採取されなかった。しかし、これらの生物は、ろうそく瓶で栽培する必要があります。シール前にこの栽培室にろうそくを導入すると、マイクロ好気性増殖に適した低酸素環境を作成します。
3. 250 mLを用意したいので、オートクレーブ時のボイルオーバーを防ぐために500mL(またはそれ以上)のアーレンマイヤーフラスコを使用してください。1つは「ブロス」、もう1つは「寒天」とラベルを付けます。
4. 製造元の濃度に関する推奨事項に従って、各ソリューションの作成に必要なメディアの量を決定します。ここで使用されるLB寒天は、25g/Lと超純水を組み合わせて調製します。250 mLの私たちの容積は6.25 LB寒天/250 mLの水の解決を要求する。同様に、LBブロスと水の同じ比率を組み合わせて調製されます。固化剤で補わないため、冷却しても硬化しません。
5. メディアの重量を量り、メーカーの推奨事項と一致する割合で水と混合します。「寒天」と書かれたフラスコに6.25gのLB寒天を加え、LBブロスの6.25gを「ブロス」と書かれたフラスコに加えます。各フラスコに250mLの超純水を加えます。
6. 各フラスコにアルミホイルをラップし、オートクレーブを使用して、121°C、15 psiで最低15分間メディアを殺菌します。
7. 耐熱手袋またはパッドを使用して、サイクルが完了したらオートクレーブからフラスコを取り外し、40-50°Cの水浴に入れます。
8. 適切な温度に達したら、250 mLアーレンマイヤー、または丸底フラスコに「ブロス」とラベル付けされたフラスコの内容物を注ぎます。250 mLフラスコ「_溶液0」にラベルを付けます。
9. 10、100mm x 15 mmの滅菌ペトリ皿を取得し、日付、名前、使用されるメディアの種類、および生物が収穫されるウィノグラツキーカラムゾーンでラベルを付けます。
10. 水風呂から「寒天」と書かれたフラスコを取り出し、10個のペトリ皿に注ぎ始めます。各料理に15mL以下を追加する必要があります。これはまた、精度を向上させるためにピペットおよび25 mLの血清ピペットで行われてもよい。滅菌ピペットチップを使用して、存在する気泡を除去し、プレートの蓋で覆い、一晩固化するために残します。

3. 希釈剤の調製

1. ラックに20mL以上を収納できる試験管を10本用意し、T1-T10にラベルを付けます。各チューブ番号は、それが対応する希釈係数と一致しています(すなわち、T4 = 1x10^-4または0.0001またはストック濃度の1/10,000分の1)。
2. 10の試験管のそれぞれに0.45%の生理物のピペ9 mL。
3. 生理食生のブランクは今オートクレーブによって殺菌される準備ができている。アルミホイルを使用して10個の試験管をそれぞれカバーし、オートクレーブ互換試験管ラックに移します。121°C、15 psiで最低15分間殺菌します。
4. 耐熱手袋を使用してブランクを取り除き、冷却することができます。チューブが室温に達したとき、またはタッチに冷えるとき、必要になるまで4°Cでカバーして保管してください。

4. 対象生物の育成

1. 以前に縞が付いたプレートまたは凍結ストックの50 μLから単一のコロニーで「_溶液0」を接種する。接種された「_溶液0」を一晩振って37°Cのインキュベーターに入れて、標的生物に複製する時間を与えます(必要に応じて)。(注:フラスコは汚染を防ぐために覆われるべきです。対象生物が好気性の場合は、無菌ガーゼと綿栓を使用して汚染を防ぎます。ウィノグラツキーカラムの領域を評価する場合は、単に各所望のゾーンから1グラムを削除し(この研究の目的のために好気性と嫌気性)、ステップ5.3に進む前にT1で再中断します。

5. シリアル希釈

1. インキュベーターから「栄養スープ」と表示されたフラスコを入手し、激しく振ります。
2. 「_溶液0」のピペ状1mLをT1標識の試験管に入れた。渦 T1.ウィノグラツキーの移植を評価する場合は、所望のゾーンの1グラムの重量を量り、渦の前にT1に追加します。(注:1 mLは、単純化のために使用され、より小さい量の希釈剤も使用してもよい)。
3. 試験管T1から1 mLを取り出し、試験管T2に追加します。渦 T2.
4. 試験管T2から1 mLを取り出し、試験管T3に追加します。渦 T3.
5. 試験管T3から1 mLを取り出し、試験管T4に追加します。渦 T4.
6. 試験管T4から1 mLを取り出し、試験管T5に追加します。渦 T5.
7. 試験管T5から1 mLを取り出し、試験管T6に追加します。渦 T6.
8. 試験管T6から1 mLを取り出し、試験管T7に追加します。渦 T7.
9. 試験管T7から1 mLを取り出し、試験管T8に追加します。渦 T8.
10. 試験管T8から1 mLを取り出し、試験管T9に追加します。渦 T9.
11. 試験管T9から1 mLを取り出し、試験管T10に追加します。

6. スプレッドメッキ

1. T1からペトリ皿に直接希釈されたサンプルのピペ100 μL。このステップは、チューブごとに繰り返すことができますが、必要はありません。
2. 無菌の使い捨て拡散棒を得るか、または炎はガラス拡散棒を殺菌する。時計回り/反時計回りの動きで、広がるロッドの水平部分を滑空して、ペトリ皿内にサンプルを均等に分配します。
3. 評価する Winogradsky 列のゾーンごとに繰り返します。
4. 37°Cのインキュベーターでプレートを24時間インキュベートします。嫌気性生物の場合は、嫌気性チャンバーを使用してください。

7. ストリーキング

1. ターゲット生物の適切な希釈を選択します。例えば、_溶液4は、初期濃度の1/10,000分の1の希釈をもたらす。典型的には、1/1,000th(T3/solution)、1/1,000,000th(T6/Solution₆₎および1/1,000,000,000^{番目(T9/Solution} ₉₎の希釈が評価され、微生物を列挙する。
2. プラスチック無菌使い捨て接種ループまたは10秒以上の間火の下にあった再利用可能な金属接種ループを使用して、ステップ5から所望の溶液に浸漬する。キャリブレーションされた接種ループは0.01 mLを転送する必要があります。(注意:熱から取り除く直後に炎ループが細菌に接触しないようにする)
3. 片側のペトリ皿カバーを少し上げて、接種ループだけが寒天にアクセスできるようにします。寒天を危険にさらさないために注意しているジグザグの方法でメディアの上部を横切って接種ループを滑空します。ペトリ皿のふたを下ろします。
4. 新しい使い捨て可能な接種ループを使用するか、再利用可能なループを再殺菌します。
5. プレートを約1/3rd(〜118°)回転させ、ジグザグ運動の周波数を下げます。
6. 繰り返しますが、新しい使い捨てループを使用するか、最終時間を回転させる前に金属ループを再殺菌し、ジグザグ周波数をもう一度減らします。ペトリ皿のふたを下ろします。
7. 新しい使い捨てループを使用するか、再利用可能なループを再燃やすことによって、少なくとも3つのペトリ皿が3つの異なる希釈のために縞模様になるまで、手順7.2-7.6を繰り返します(図2)。
8. ストリークペトリ皿を一晩37°Cのインキュベーターに入れます。嫌気性生物の場合は、無気性チャンバーを使用します。

8. データ分析と結果

1. 培養物は、7日間のウィノグラツキー列の酸化ゾーンと無酸化ゾーンから採取した。これらのゾーンは、それぞれヘテロ栄養および鉄酸化性アナエロベに適しています。
2. カラムの移植は、LB寒天プレート上で縞または広がる前に連続的に希釈された。
3. ストリーキングは、評価されたウィノグラツキーゾーンのそれぞれから混合集団を明らかにしました。スプレッドプレートは同様の結果を生み出した。
4. CFU/mL または CFU/g を計算するには、3 つのプレートからカウントされたコロニーの数を平均します。コロニーの平均数に希釈係数を掛け、引用符で囲まれた量で除算します。例えば、_溶液6(T6)の0.1 mLを接種したプレート上で平均65のコロニーをカウントした場合、前述の式は650,000,000 CFU/mLに等しくなります。
5. 分離されたコロニーは、種のアイデンティティを決定するために濃縮アッセイで使用するために、各プレートから選択できるようになりました。

場合によっては、細菌を特定して研究するために、まずサンプルから細菌を分離して濃縮する必要があります。例えば、Winogradskyカラムから得られたサンプルは混合されており、複数の細菌種や菌株が含まれているため、個々の細菌を研究したり、存在する異なる種類を列挙したりすることは困難な場合があります。この目的のために、通常、段階希釈および播種技術を使用して、細菌負荷を確実に定量し、個々のコロニーを分離します。

段階希釈は、生物(この例では細菌)の濃度を、一定量の液体希釈剤に連続的に再懸濁することにより体系的に減少させるプロセスです。通常、希釈液の体積は、サンプル生物の対数的還元を容易にするために10の倍数です。例えば、1グラムの堆積物が最初に関心のあるWinogradskyゾーンから除去され、10ミリリットルの適切な液体媒体に加えられます。次に、この最初の希釈液の1ミリリットルを、9ミリリットルの培地を含む別のチューブに加えます。このプロセスは、いくつかの異なる濃度の細菌が調製されるまで繰り返すことができます。この例では、Winogradsky カラムからの混合サンプルには未知の、多くの場合多数の細菌が含まれているため、段階希釈が細菌の計数に重要です。

次に、ストリークプレーティングとスプレッドプレーティングにより、それぞれサンプル内の細菌の分離と計数が可能になります。ストリーキングは、栄養素を添加した固体培地の1つのセクションに希釈したサンプルを導入することによって達成されます。次に、この接種物は、プレートの各3分の1にジグザグパターンで広がります。プレートの異なる部分に縞模様が入り、前のサンプルと一度だけ交差すると、サンプルはより薄く広がります。これは、後のセクションで個々のコロニーを達成するために、1つの希釈からストリークするだけでよい場合があることを意味します。インキュベーション後、縞模様のプレートはコロニーの形態の観察を可能にし、異なる細菌種を区別するのに役立つ情報を得ることができます。

あるいは、サンプル中の細菌の列挙を主な目的とする場合、スプレッドプレーティングを使用してもよい。スプレッドプレーティングでは、1つのサンプルのアリコートが固体媒体の表面全体に均一に広がります。通常、混合サンプル中の細菌数がわからないため、希釈液またはそれらの代表的なサンプルごとにスプレッドプレートが作成されます。インキュベーション後、これらのスプレッドプレートを使用して列挙を行うことができます。コロニー数が30未満のプレートは、カウントが小さいと誤差が大きくなるため、廃棄する必要があります。同様に、300 を超えるカウントは、コロニーの混雑と重複がコロニー数の過小評価につながる可能性があるため、破棄する必要があります。これらの残りの各ディッシュのコロニー数を記録し、希釈係数を掛けてから、メッキされた体積で割ると、懸濁液のミリリットルあたりのコロニー形成単位(CFU)が得られます。このビデオでは、既知の細菌を含むサンプルと、Winogradsky カラムのさまざまな領域に含まれる微生物群集を、段階希釈、スプレッドプレーティング、ストリークプレーティングによって定性的および定量的に評価する方法を学びます。

まず、白衣、手袋、ゴーグルなど、適切な個人用保護具を着用します。次に、ワークスペースを70%エタノールで滅菌し、表面を拭き取ります。次に、500ミリリットルの三角フラスコを2つ集め、1つのブロスともう1つの寒天にラベルを付けます。LB寒天溶液を調製するには、約6.25グラムのLB寒天、3グラムの工業用寒天、および250ミリリットルの蒸留水を、ラベル付けされた寒天フラスコに混合します。

次に、2を組み合わせてLBブロスを準備します。5グラムのLB培地と100ミリリットルの蒸留水、フラスコにラベル付けされたブロス。フラスコをオートクレーブした後、耐熱手袋を使用してフラスコをオートクレーブから取り出し、摂氏40〜50度の水浴に入れます。フラスコが摂氏50度になったら、ブロス溶液の100ミリリットルのアリコートを3つ慎重に準備し、各アリコート溶液にゼロのラベルを付けます。次に、10個の滅菌ペトリ皿を集め、日付、名前、使用したメディアの種類、および生物が収穫されるWinogradskyカラムゾーンでラベルを付けます。寒天フラスコから15ミリリットルの寒天を各シャーレにピペットで入れます。次に、ピペットの先端を使用して気泡を取り除き、プレートの蓋を元に戻し、ベンチトップで一晩固化させます。

翌日、ベンチトップを70%エタノールで拭きます。次に、10本の20ミリリットル試験管T1からT10にラベルを付け、ラックに置きます。各チューブに9ミリリットルの.45%生理食塩水をピペットで入れます。次に、10本の試験管のそれぞれをキャップでゆるく覆い、オートクレーブ対応の試験管ラックに移します。サイクルが完了したら、耐熱手袋を使用して生理食塩水ブランクを取り外し、冷まします。チューブは、摂氏約22度に達するまで室温で保管します。

既知の標的生物(この例では大腸菌)を培養するために、100ミリリットルの溶液ゼロに、以前に縞模様のプレートから単一のコロニーを接種します。次に、チューブを覆い、摂氏37度で一晩インキュベートします。Winogradskyカラムの領域を評価するには、好気性ゾーンから約1グラムの材料をT1に加え、ボルテックスによって再懸濁します。次に、嫌気性ゾーンから1グラムの材料でこのプロセスを繰り返します。

大腸菌を接種した溶液ゼロの入ったチューブをインキュベーターから取り出し、振とうします。次に、溶液の1ミリリットルをT1試験管にピペットで入れ、ボルテックスで混合します。T1から1ミリリットルの溶液を取り出し、T2に移し、ボルテックスして混合します。チューブT10を介してこのプロセスを繰り返します。Winogradskyカラムの好気性ゾーンと嫌気性ゾーンを評価するには、以前に調製したT1チューブのそれぞれから1ミリリットルの溶液を取り出し、適切なT2チューブに移します。次に、前に示したように、T10チューブを通じて段階希釈を続けます。

プレートを広げるには、希釈したサンプルを各T3チューブから100マイクロリットルを対応するシャーレにピペットで移します。次に、滅菌拡散ロッドを使用してサンプルをペトリ皿に静かに分散させ、プレートの蓋を元に戻します。前に示したように、T6およびT9希釈液に対してこのプロセスを繰り返します。好気性生物を含むプレートを摂氏37度のインキュベーターで24時間インキュベートします。嫌気性生物を含むプレートを、摂氏37度に設定された嫌気性チャンバーで24時間インキュベートします。翌日、T3、T6、T9希釈プレートをインキュベーターと嫌気性チャンバーから取り出し、ベンチトップに移します。一度に1つのプレートで作業し、滅菌された接種ループをジグザグパターンで培地の上部を滑らせます。次に、ペトリ皿の蓋を元に戻します。次に、プレートを1/3回転させ、ループを滅菌して、以前に作成したジグザグパターンの頻度を減らします。再度、ループを滅菌した後、プレートを1/3回転させ、ジグザグパターンの頻度を最後にもう一度減らし、蓋を元に戻します。前に示すように、残りのプレートに対してこのストリーキング方法を繰り返します。次に、好気性生物を含む縞模様のプレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩置き、嫌気性生物を含む縞模様のプレートを摂氏37度に設定された嫌気性チャンバーに一晩置きます。

培養物は、7日間のWinogradskyコラムの好気性ゾーンと嫌気性ゾーンから収穫されました。次に、培養物を段階希釈してから、ストリーキングしてLB寒天プレート上に広げました。ストリーキングにより、評価された各ウィノグラードスキーゾーンから混合個体群が明らかになり、スプレッドプレートも同様の結果をもたらしました。混合集団から縞模様のプレートは、さまざまな形状、サイズ、テクスチャ、および色の細菌コロニーをもたらします。対照的に、既知の生物である大腸菌を含む縞模様のプレートと広がったプレートは、相同な集団を示しました。一般に、ミリリットルあたりのCFUは、同じサンプルと希釈係数で広げた3枚のプレートの平均コロニー数を使用して計算するのが最善です。平均コロニー数に希釈係数を掛け、アリコートされた量で割ります。最後に、各プレートから選択された単離されたコロニーは、種の同一性を決定するためのさらなる濃縮アッセイに使用することができます。