6.3: エンリッチメント培養:選択的および差動媒体における好気性微生物と嫌気性微生物の培養

1. 準備

1. 始め前に手をよく洗い、適切な大きさの手袋を着用してください。
2. 5%の次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤)で作業面を殺菌し、完全に乾燥させます。
3. 作業中にベンチトップに触れないように、空の120 mLエルレンマイヤーフラスコに接種ループを配置します。

2. 成長メディアと文化

1. 冷蔵庫からマンニトールソル寒天(MSA)、エオシンメチレンブルー寒天(EMB)、8種類の大豆寒天(TSA)の4枚を冷蔵庫から集めます(これらは市販で購入できます)。
2. 洗浄された作業領域にプレートを置きます。
3. 次のブロス培養物を収集する:大腸菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、およびプロテウス・ブルガリス。注意:これらは好気性生物であるので、チューブのキャップはわずかに緩んでいる必要があります。
4. すべてのカルチャを、清掃された作業面の試験管ラックに置きます。

3. 文化の移転とインキュベーション

1. 手の届くところですべての材料を持ってベンチに立つか、座ります。
2. 無菌技術を使用して細菌をプレートに移すには、まずループをオレンジ色に光るまで炎上させ、次に空気中で冷却できるようにします。
3. ループが冷却される間、大腸菌のスープ培養を取り、その後、あなたの小指を使用してキャップを開きます。
4. チューブの開口部を素早く燃やします。これは汚染を防ぐ。
5. ループをチューブに浸し、生物をEMBプレートの最初の象限に取り付けます。
6. 最初のストリークが実行された後、ループを炎上し、最初のストリークを1回または2回だけ横切る2番目のストリークを実行します。これにより、単一のコロニーの分離が可能になり、汚染があるかどうかを判断できます。
7. プレートの 4 つの象限がすべて縞模様になるまで、この手順を繰り返します。
8. 次に、残りの 4 つの生物を同じストリーク メッキ方で転送し、最終製品が 1 つの MSA プレート、1 つの EMB プレート、および 2 つの別々の TSA プレートが生物ごとに 1 つずつあるようにします。
9. すべての生物が転送されたら、ループを最後に1回燃やし、それを片付けます。
10. 各生物を入れたTSAプレートをガスパケットに入れ、ガス袋を振ってからプレートと並んでチャンバーに入れます。しっかりとシールします。
11. すべてのプレートを一晩37°Cでインキュベートします。
12. 作業面を5%漂白剤で最後の1回殺菌します。

4. 結果の読み取りと記録

1. インキュベーターからプレートを取り出し、クリーンなラボベンチに置きます
2. ラボ ノートブックの各プレートの生物の成長に注意してください。特に、次の事項に関する詳細なメモを取ります。
   1. 各プレート上のコロニーの数とサイズ(存在する場合)、各めっきされた歪み
   2. MSAプレート上に成長するコロニーを取り巻く寒天の外観
   3. EMBプレート上で成長するコロニーの外観
   4. ガスパッケージ内と外側に成長したTSAプレート間の成長の違い

バクテリアは、砂漠のツンドラ地帯から熱帯雨林まで、地球上のほぼすべての環境に生息することができます。このように、非常に異なるニッチにコロニーを形成する能力は、その適応性と膨大な代謝多様性によるものであり、これにより、エネルギー生成に多種多様な分子を利用することができます。この膨大な多様性が、地球上の細菌種の1%未満が培養可能と考えられているという現象を引き起こし、これらは特定の代謝および環境ニーズの理解によってのみ可能になります。

実験室で培地と環境の操作を行うことで、研究者は目的の種を培養するための最適な条件を見つけるための実験を行うだけでなく、混合培養から特定の種を選択するために条件を変更するプロセスである濃縮も可能にします。一部の微生物種はジェネラリストであり、さまざまな状態や環境に耐えることができます。このような生物は、実験室の条件下で容易に成長する可能性がありますが、極端な生息地が与えられると成長を防ぐこともできます-これは、目標がこの条件に耐性のある混合培養からの生物を豊かにすることである場合に役立ちます。

潔癖な生物は培養可能ですが、特定の条件が満たされた場合に限ります。例えば、ナイセリア種やヘモフィルス種は、部分的に分解された赤血球と高い二酸化炭素濃度を含む培地を必要とし、これも他の種の成長を妨げる可能性があります。極限環境微生物は、非常に低温または高温、低酸素または酸素欠如状態、または高塩分の存在下などの極端な条件を好むことから名付けられています。これらの状態は、他のほとんどの微生物にとって耐え難いものと思われます。

関心のある生物をさらに濃縮するために、一部の培地タイプには、生物の代謝に関する洞察を提供する指標が含まれています。マンニトール塩寒天は、高塩分に敏感な生物の成長を阻害します。グラム陰性菌は通常生き残ることができませんが、グラム陽性ブドウ球菌属は繁栄することができます。さらに、MSA寒天は、発酵の酸副産物が培地中のメチルレッドインジケーターを明るい黄色に変えるため、マンニトールを発酵できるコロニーを示しています。これにより、種をより具体的に選択することができます。

別の一般的な濃縮媒体であるエオシンメチレンブルーには、グラム陽性菌に有毒なエオシンとメチレンブルーの染料が含まれています。また、これらのプレートには乳糖とバクテリアが含まれており、発酵させると、pHを下げる酸が生成され、染料の吸収が促進されます。これらのコロニーは大量の顔料を吸収し、暗くて金属的に見えます。このラボでは、3つの異なる培地条件で4つの異なる試験生物を増殖させ、好気性条件と嫌気性条件下で成長させてから、その成長を観察します。

実験を開始する前に、手をよく洗って乾かしてから、適切なサイズの実験用手袋を着用してください。その後、作業面を5%漂白剤で除菌し、しっかりと拭き取ります。次に、滅菌された接種ループを取り、ベンチの表面に触れないようにハンドルを空の125ミリリットルフラスコに置きます。次に、冷蔵庫からマンニトール塩寒天(MSA)のプレート4枚、エオシンメチレンブルー寒天(EMB)のプレート4枚、およびトリプシン大豆寒天(TSA)プレート8枚を取り出します。TSA培地は、2つの異なる環境条件に使用される非選択的増殖培地です。最後に、興味のある文化をチューブラックに集めます。ここでは、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、尋常性プロテウスを栽培します。

まず、ツールの滅菌に使用されるブンゼンバーナーに火をつけます。次に、MSA プレート 1 枚、EMB プレート 1 枚、および TSA プレート 2 枚を手元に置きます。次に、細菌培養物の1つを選択します。これらの4つのプレートすべてに最初の培養物を接種します。空いている手で接種ループを手に取り、バーナーの炎で数秒間オレンジ色に光るまで滅菌します。ループを空気中で冷まします。次に、ブロス培養チューブを開き、開口部をすばやく炎上させます。ループを培養物に浸し、次に最初のプレートの最初の象限に生物を縞模様にします。次に、ループを再度炎で滅菌し、2番目の象限に縞模様を付けます。この火炎滅菌とストリーキングのアクションを繰り返して、第3象限と第4象限を完成させます。この方法でストリーキングを行うことで、孤立したコロニーが得られ、培養物が汚染されていないことを確認できます。

次に、蓋を元に戻し、プレートの底にバクテリアの名前、培地の種類、日付、およびイニシャルをラベル付けします。その後、残りの3つのプレートのそれぞれに同じ細菌培養物を使用してストリークプレーティングを繰り返し、毎回ラベルを付けるように注意します。最初の培養物に線条を打ったので、他の細菌に対してこれらの手順を繰り返して、各種ごとに1つの接種済みMSAプレート、1つのEMBプレート、および2つのTSAプレートを取得します。すべての生物が転送されたら、最後にもう一度ループを炎にかけます。

低酸素環境で増殖できる生物を決定するには、密閉されたガスチャンバーシステムを開き、内部に4つのTSAバクテリアプレートを1セット配置します。次に、嫌気性条件の小袋をチャンバーに入れ、しっかりと密封します。最後に、密閉されたガスチャンバーシステム内のプレートを含むすべてのプレートを、摂氏37度のインキュベーターに一晩入れます。今後は、24〜48時間ごとにプレートをチェックし、コロニーが成長して指示反応物を代謝する時間を確保します。

さまざまな細菌種が各成長条件にどの程度反応したかを評価するには、まずプレートの成長を調べ、各培地タイプで、嫌気性条件と好気性条件でコロニーを生成できた種を記録します。成長している生物の色と、コロニーのサイズと形状に注意してください。

マンニトール塩寒天培地は、6で生存できるグラム陽性生物に対して選択的です。5%塩化ナトリウム。この実験では、グラム陰性菌と尋常性菌は塩分濃度が高いために成長しなかったことを意味しました。しかし、表皮ブドウ球菌と黄色ブドウ球菌は成長することができ、グラム陽性であることが確認されました。さらに、黄色ブドウ球菌はマンニトールを発酵させ、発酵の酸副産物により培地中のメチルレッドインジケーターを明るい黄色に変えることができるため、2つの種の間には明確な違いがあります。これは表皮S.の場合には見られませんでした。

一方、EMB培地は、エオシンおよびメチレンブルー染料がグラム陽性細胞に対して毒性があるため、グラム陰性菌に対して選択的です。グラム陰性菌の外膜は、これらの有毒な色素が細胞に侵入するのを防ぎ、成長することができます。さらに、この培地は、存在する細菌種が乳糖を発酵させることができるかどうかを示します。ここでは、大腸菌のコロニーが濃い紫色に変わり、時には発酵を示す緑色の金属光沢を帯びます。P. vulgarisはこの培地で育ちますが、乳糖を発酵させないため、染料の存在下では淡いピンクがかった紫色に見えます。嫌気性条件下では、TSA培地上の細菌種はまだ増殖するはずですが、十分な酸素がある細菌種と比較して非常に増殖しない可能性があります。これは、試験種のいずれも必須の嫌気性菌ではないためです。

成長環境を豊かにするためのこのような実験は、混合サンプルから特定の種を支持し、分離するのに役立ちます。また、実験室でさまざまな細菌種の最適な増殖条件を決定するのにも役立ち、さらなる研究に役立ちます。