純粋な培養物と縞めっき:混合サンプルからの単一細菌コロニーの単一の分離

1. 設定

1. すべての微生物は、それらが危険であるかのように扱われるべきです。常にラボのコートと手袋を着用し、長い髪を結び、傷が特によく保護されていることを確認してください。
2. 70%エタノールを使用して殺菌して作業スペースを準備します。
3. 寒天プレート、サンプル溶液、および殺菌前のプラスチック接種ループまたは金属ループとブンゼンの炎の箱が近くにあることを確認します。使い捨て可能な、プラスチックループは通常前殺菌される。金属ループは70%エタノールに浸し、ブンセン炎の青い領域の近くに保持し、熱くなるまで加熱する必要があります。プレートの蓋を上げて(汚染を防ぐためにわずかに)、固化媒体に対してそれをタップして、ワイヤーを冷却することができます。
4. 作業スペースの繰り返し殺菌と手と手首の徹底的な洗浄/殺菌で各手順を終了します。

2. プロトコル

1. メディアの準備
   1. 利用される細菌種/株を維持する固体培地(通常は1.5%(w/v)寒天を含む固体培地を同定し、調べます。オートクレーブ時のオーバーフローを避けるために、最終ボリュームの2倍を保持することができるボトルに媒体を混ぜます。
   2. ボトルを半締め付けしたキャップで、オートクレーブに20分間121°Cに設定して、メディアを殺菌します。
   3. ボトルがオートクレーブから取り外されるとすぐにキャップを正しく閉じます。メディアをすぐに使用する場合は、ボトルを45°Cに設定した水風呂に入れ、液体状態に保ちます。寒天はそれ以外の場合は32〜40°C未満で固化し、後で85°Cの融点に再加熱(通常は電子レンジを使用)することができます。
2. 培養プレートの調製
   1. 滅菌ペトリ皿(通常は100 x 15 mm)のベースを、実験者の名前、日付、メディアタイプで側面または下部にマークします。
   2. 45°C寒天培養培地(以前に調製)の20〜25 mLをラベル付きプレートのそれぞれに注ぎます。泡がエッジに沿って表示される場合は、これは迅速に通常のピペットと無菌先端を使用して除去する必要があります。
   3. 直ちにすべての蓋を皿の上に戻し、汚染を防ぎます。
   4. 寒天を室温で約2時間、または4°Cで一晩固化させます。一度設定すると、細菌培養プレートは、中表面の結露を最小限に抑えるために、4°Cで逆さまに保存する必要があります。
3. ストリークメッキ
   1. 生殖不能ループを目的の接種液に沈め、ジグザグ運動を用いて採取したサンプルをプレートの最初の象限に直ちに分散させる(図1、I)。
   2. ふたを閉じ、接種ループを再殺菌するか、新しい生殖不能の使い捨てループを集める。
   3. プレートの第2象限に向かって第1象限(比較的密度の高い細菌集団を含む)から放射する3~4ストロークを作ります(図1、II)。
   4. 蓋を閉じて接種ループを再殺菌するか、使い捨てループを廃棄し、新しい滅菌ループを回収します。
   5. 第2象限から第3象限に3-4ストロークのこのストリークを繰り返し、次に3番目から4番目の象限に、毎回無菌ループを使用します(図1、III - IV)。
   6. 滅菌ループを使用して、プレートの中央に向かって4番目の象限からジグザグパターンで1つの最終ストロークを行います(図1、V)。細菌の有病率は、この領域では低く、理想的には個々のコロニーを単一の生存可能な母細胞から確立することを可能にする。
   7. 蓋を閉じ、(細菌種によって必要な場合)空気の流れを防ぐためにパラフィルムでシール。
   8. 細菌種/株に応じて、培養プレートを適切な環境に上下に置き、細菌のコロニーが見えるまでインキュベートします(分離されたコロニーは、初期濃度が変化する可能性があるため、プレートのどちらの領域にも現れることがあります)。
   9. クローン細菌集団を生成するために、別のプレートをストリークアウトし、元のプレートの単一のコロニーから単離した細胞に対してメッキされた接種を元のプレートに交換する。