16S rRNAシーケンシング:細菌種を同定するPCRベースの技術

1. 設定

1. 微生物を取り扱いながら、良好な微生物の実践に従う必要がある。すべての微生物、特に未知のサンプルは、潜在的な病原体として扱われるべきです。無菌技術に従って、サンプル、研究者、または実験室の汚染を避けてください。細菌の取り扱い前後に手を洗い、手袋を着用し、防護服を着用してください。
2. ゲノムDNA単離およびPCR産物精製のための実験プロトコルのリスク評価を行う。一部の試薬は有害である可能性があります!
3. 純粋な培養は16S rRNAシーケンシングに不可欠です。ゲノムDNAの単離に進む前に、出発物質が完全に純粋であることを確認してください。これは、個々のコロニーを分離するためにストリークメッキによって行うことができます。これらは、必要に応じて、個別に、またはスープに、さらにストリークすることができます。
4. 必要な実験装置:
   1. PCR用サーマルサイクラー。サーマルサイクラーの機能は、設定されたプログラムに応じて温度を上げたり下げたりすることです。プログラムの作成中に、すべてのPCRステップの温度と時間の値だけでなく、サイクルの合計数を入力するように求められます。
   2. アガロースゲル電気泳動システム。これは、そのサイズと電荷に基づいてDNA断片を分離するために使用されます。このプロトコルでは、アガロースゲル電気泳動を用いて、単離されたゲノムDNAおよびPCR産物の品質を可視化する。

2. プロトコル

注:実証されたプロトコルは、細菌の純粋な培養から16S rRNA遺伝子シーケンシングに適用されます。メタゲノム研究には適用されません。

1. ゲノムDNA(gDNA)の単離のための細菌を培養する。
   1. 適切な培地で微生物を育てなさい。液体および固体媒体の両方がこのステップで使用することができる。最高の成長をもたらす条件を選択します。実験を計画している間、成長が遅い細菌は、後期ログ/静止成長段階に到達するまでに数日を要する可能性があることに留意してください。このプロトコルでは、バチルス・サチリス168を200rpm、37°Cに設定した振盪インキュベーターで一晩リソジェニーブロス(LB)で増殖した。
2. gDNAの分離
   1. 細菌を固形培地で増殖させた場合、滅菌ループを用いて一部の細胞を削り取り、蒸留水の1mLで再懸濁する
   2. 細菌を液体培地で増殖させた場合は、一晩培養の約1.5mLを使用する。
   3. 遠心分離(1分、12,000~16,000×g)による細胞のペレットは、上清を除去し、市販キットまたは標準プロトコルを用いてgDNA単離のために細胞を使用する[例えばCTAB総DNA製剤(13)またはフェノールクロロホルム抽出(14)]。ここで、市販キットを用いて、B.subtilis 168の1.5mLからgDNAを一晩培養し、OD_600=1.5を分離した。
      注1:いくつかのグラム陰性細菌のために、このステップは省略し、沸騰することによって細胞からのDNAの簡単な放出に置き換えることができます。蒸留水で細菌ペレットを再中断し、100°Cに設定された加熱ブロックで10分間インキュベートします。
      注2:グラム陽性細菌細胞は破壊しにくい。したがって、この細菌群からの単離に特化したgDNA単離方法またはキットを選択することをお勧めします。
3. gDNA品質チェック。
   1. アガロースゲル電気泳動による単離されたgDNAの品質を確認します。まず、単離したgDNAの5μLを装填色素(6倍)の1μLと混合し、DNA染色試料を含む0.8%のアガロースゲルに試料をロードします。
   2. 分子質量標準をロードし、色素フロントがゲルの底に達するまで電気泳動を実行します。
   3. 電気泳動が完了したら、適切なトランシルミレータ(UVまたは青色光)上のゲルを視覚化します。gDNAは厚い高分子バンド(10kb以上)として現れる。gDNA品質チェックの例を図 3 に示します。
   4. gDNAが品質管理を通過した場合(すなわち、高分子バンドが存在し、gDNAの塗りつぶしがほとんどない場合)、最初に3つのマイクロ遠心管を次のようにラベル付けしてgDNAを連続的に希釈します:「10x」、「100x」、「1000x」。
   5. 3つの管のそれぞれに無菌蒸留水のピペット90 μL。
   6. gDNA溶液の10 μLを取り、「10x」とマークされたチューブに追加します。
   7. 溶液が均一に混合されていることを確認するために、全体の体積(すなわち100 μL)を徹底的に上下にピプテします。次に、このチューブから溶液の10 μLを取り、「100x」とマークされたチューブに移します。
   8. 前述のように混合し、チューブ「100x」からチューブ「1000x」に溶液の10 μLを転送することにより、同じ手順を繰り返します。これらの希釈物は、PCR反応においてテンプレートとして使用される。

図 3:バチルス・サチリスから単離されたgDNAのアガロースゲル電気泳動.レーン 1: M - 分子量マーカー (上から下へ: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp)レーン2: gDNA -バチルス・サチリスから単離されたゲノムDNA.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. PCRによる16S rRNA遺伝子の増幅
   注:以下のPCRプロトコルは、特定のDNAポリメラーゼおよびプライマーペア8F~1492Rに対して最適化されています(表1参照)。各ポリメラーゼおよびプライマーペアに対してプロトコルの最適化が必要である。
   1. 氷上のすべての試薬を解凍します。
   2. 表 2 に示すように、PCR マスター ミックスを準備します。DNAポリメラーゼは室温で活性であるため、反応セットアップは氷上で行う必要があり、すなわちPCRチューブおよび反応成分は常に氷上に保持されるべきである。gDNAサンプルごとに1つの反応を調作し、1つの反応を陰性対照に調用する。ネガティブコントロールは、gDNAテンプレートのないPCRミックスであり、反応の他の成分が汚染されていないことを保証するために使用されます。
      注:複数のサンプルの場合、マスターミックスが一般的に調製されます。マスターミックスは、テンプレートを除く全ての反応成分を含む溶液である。反復的なピペットを省略し、ピペットエラーを回避し、サンプル間の高い一貫性を確保するのに役立ちます。マスターミックスを調作成するには、各成分の体積(DNAテンプレートを除く)に、テストされたサンプル数を掛けます。マイクロ遠心管内のすべてのコンポーネントを混ぜ、ボリューム全体を数回上下にピペットします。
   3. 個々のPCRチューブにマスターミックスのアリコート49 μL。
   4. マスターミックスでチューブに1 μLテンプレートを追加します。陰性制御のために無菌水の1 μLを追加します。成分がよく混合されていることを確認するには、30-50μLに設定されたピペットでミックスを約10回ゆっくりとピペットします。
   5. 表 3 に示すプログラムを使用して PCR マシンを設定します。
   6. チューブをPCRマシンに入れ、プログラムを起動します。
   7. プログラムが完了したら、アガロースゲル電気泳動によってPCR製品の品質を調べます。
   8. 8F-1492Rプライマーペアを用いてPCR反応が成功すると、約1.5kbの単一バンドが得られます(図4)。他のバンド(すなわち、非特異的な製品)が存在する場合は、アニーリング温度を調整してPCRプログラムを最適化します。期待されるサイズのバンドが 1 つある場合は、次の手順に進みます。ここでは、100倍希釈されたgDNAテンプレートを使用したPCR反応は、期待されるサイズの鋭いバンドを有し、非特異的な製品を欠いていたため、最良の製品を生み出した。したがって、それは浄化され、シーケンスのために送信されるように選択されました。
   9. シーケンシングの前に、PCR反応に存在していた残留プライマー、デオキシリボヌクレオチド、ポリメラーゼ、およびバッファーから製品をクリーンアップする必要があります。PCR製品は、市販のPCR精製キットを用いて単離することができる。PCR反応は、DNA結合マトリックスを含むカラムにロードされます。PCR 製品は列にバインドされ、他のコンポーネントは列を通過します。その後、カラムは洗浄バッファーを使用して洗浄され、最後にDNAが選択したバッファーでELE化されます。キットで補完される溶出バッファーがシーケンスと互換性があることを確認します。
   10. DNAシーケンシング用の精製PCR製品を送付します。選択したシーケンシング施設でのシーケンスサンプルの提出に関するガイドラインに従ってください。最適なシーケンス カバレッジを行うには、PCR 増幅プライマー(セクション 2.4.1 で使用されているのと同じ)をシーケンス プライマーとして使用します。ここで、プライマー8F及び1492Rを用いてPCR製品のシーケンシングを行った。

コンポーネント	最終濃度	反応あたりの体積	x反応あたりの体積(マスターミックス)
5x反応バッファー	1x	10 μL	10 μL × x
10 mM dNTP	200 μM	1 μL	1 μL × x
10 μM プライマー 8F	0.5 μM	2.5 μL	2.5 μL × x
10 μM プライマー 1492R	0.5 μM	2.5 μL	2.5 μL × x
フシオンポリメラーゼ	1ユニット	0.5 μL	0.5 μL × x
テンプレート DNA *	-	1 μL	-
ddH2O	-	32.5 μL	32.5 μL × x
総ボリューム		50 μL	49 μL × x

表 2:PCR反応成分。*ステップ2.3から10x、100xまたは1000x希釈されたgDNAを使用してください。

ステップ	温度	時間	サイクル
初期の非核化	98°C	30秒
変性	98°C	10秒	25-30
焼鈍	60°C	30秒
拡張子	72°C	45秒
最終拡張子	72°C	7 分
保持	4°C	∞

表 3:16S rRNA遺伝子の増幅のためのPCRプログラム。

図 4:プライマー8F及び1492R及びgDNAをテンプレートとして増幅したPCR製品のアガロースゲル電気泳動。B.subtilis由来のgDNAサンプル(図3参照)を、最良の結果をテストするために10、100および1000回希釈した。レーン1:M - 分子量マーカー(上から下へ:10000 bp、8000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000bp、750bp、500bp)。レーン2:10倍希釈テンプレートを使用したPCR反応。レーン 3:100倍希釈テンプレートを使用したPCR反応。レーン4:1000x希釈テンプレートを使用したPCR反応。レーン5:(C-)-陰性制御(DNAテンプレートを使用まない反応)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. データ分析と結果

注:PCRプロダクトは、フォワード(ここでは8F)と逆(ここでは1492R)プライマーを使用してシーケンス化されます。したがって、2 組のデータ シーケンスが生成され、1 つはフォワード用、もう 1 つはリバース プライマー用です。各配列について少なくとも2種類のファイルが生成される:i)DNA配列およびii)DNAクロマトグラムは、シーケンス実行の品質を示す。

1. フォワードプライマーの場合は、クロマトグラムを開き、シーケンスを注意深く調べます。品質シーケンスの理想的なクロマトグラムは、均等に間隔をあけたピークを持ち、バックグラウンド信号をほとんどまたは全く持っていない必要があります(図5A)。
2. クロマトグラムが高品質でない場合は、シーケンスを破棄するか、シーケンステキスト ファイルを次のように変更する必要があります。
   1. クロマトグラム全体の二重ピークの存在は、複数のDNAテンプレートの存在を示す。これは、細菌培養が純粋ではなかった場合に当てはまる可能性があります。このようなシーケンスは破棄する必要があります (図 5B)。
   2. あいまいなクロマトグラムは、同じ場所に異なる色のピークの存在から生じる可能性があります。最も一般的なエラーの 1 つは、同じ位置に 2 つの異なる色のピークが存在し、シーケンス ソフトウェアによるベースの不適切な割り当てです (図 5C)。誤って割り当てられたヌクレオチドを手動で修正し、テキストファイルで編集します。
   3. 低分解能クロマトグラムは、これらの領域におけるヌクレオチドの誤カウントを引き起こす「広いピーク」をもたらす可能性があります(図5D)。このエラーは修正が難しいため、それ以降の位置合わせステップでミスマッチが発生する可能性があるため、信頼性の高い方法として扱う必要はありません。
   4. クロマトグラムの読み取り品質が悪く、複数のピークの存在は、一般的にシーケンスの5'と3'の終わりに見られます。シーケンサーソフトウェアの中には、これらの低品質フラグメントが自動的に除去され(図5E)、ヌクレオチドはテキストファイルに含まれません。シーケンスが自動的に切り捨てられなかった場合は、端部にある低品質のフラグメント(弱い信号、重なり合うピーク、解像度の損失など)を特定し、テキストファイルからそれぞれのベースを削除します。

図 5:DNA シーケンシングのトラブルシューティングの例。A) 高品質のクロマトグラム配列の例(均等間隔、明確なピーク)。B)通常クロマトグラムの先頭に発生する品質の悪いシーケンス。グレーゾーン領域は低品質と見なされ、シーケンスソフトウェアによって自動的に削除されます。より多くの塩基は手動でトリミングすることができます。C) ダブルピークの存在(矢印で示す)。赤い矢印で示されるヌクレオチドはシーケンサーで「T」(赤いピーク)と読み取られたが、青いピークが強く、「C」とも解釈できる。D)重なり合うピークはDNA汚染(すなわち複数のテンプレート)を示す。E)解像度の損失と、信頼性の高いベースコールを防ぐいわゆる「広いピーク」(長方形でマーク)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. リバースプライマーの場合は、3.1 と 3.2 を繰り返します。
4. 最後に、前方シーケンスと逆シーケンスを 1 つの連続したシーケンスに組み立てます。良好なシーケンス実行では、最大 1100 bp のシーケンスが生成されます。
   1. DNA配列アセンブリプログラムを使用して2つの配列をマージし、例えばCAP3(http://doua.prabi.fr/software/cap3)(15)のような自由なツールを使用してマージする。
   2. 指定されたボックスに FASTA 形式の 2 つのシーケンスを挿入します。[送信] ボタンをクリックし、結果が返ってくるのを待ちます。
   3. 組み立てられたシーケンスを表示するには、結果タブで「Contigs」を押します。アライメントの詳細を表示するには、「アセンブリの詳細」を押します。
      注1:CAP3 ソフトウェアをコンティグ アセンブリに使用する場合、逆プライマー シーケンスを逆補完に変換する必要はありません。ただし、別のプログラムを使用する場合は、この手順が必要になる場合があります。
      注2:FASTA形式は、ヌクレオチド配列を表すテキストベースのフォーマットである。FASTA ファイルの最初の行 (説明行) は、シンボル ">" で始まり、その後にシーケンスの名前または一意の識別子が続きます。説明行に続いて、ヌクレオチド配列である。シーケンスを次の形式で貼り付けします。
      
      >シーケンス_frw_プライマー
      ここにテキストファイルからシーケンスを貼り付けます
      >シーケンス_rvs_プライマー
      ここにテキストファイルからシーケンスを貼り付けます
5. 基本的なローカルアライメント検索ツール(BLAST;https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)のウェブサイトにアクセスして、データベース検索を行います。
   1. シーケンスをデータベースと比較するには、「ヌクレオチド BLAST」ツールを選択します。
   2. シーケンス(3.5で組み立てられたコンティグ)を「クエリシーケンス」テキストボックスに入力し、スクロールダウンメニューのデータベース「16S rRNAシーケンス(細菌とArchea)」を選択します。
   3. ページ下部の「BLAST」ボタンを押します。最も類似したシーケンスが返されます。BLAST の結果の例を図 6 に示します。提示された実験では、トップヒットはB.subtilis株168であり、BLASTデータベースで利用可能な配列を持つ100%のアイデンティティを示す。
   4. トップヒットに 100% の ID が表示されない場合は、位置合わせに移動し、不一致がないかどうかを確認します。トップヒットをクリックすると、アライメントの詳細が表示されます。整列したヌクレオチドは短い垂直線で結合され、不一致のヌクレオチドはそれらの間にギャップを持つ。シーケンシング会社から受け取ったクロマトグラムに戻り、不一致の領域に焦点を当ててシーケンスをもう一度修正します。追加のエラーが見つかった場合は、シーケンスを修正します。修正されたシーケンスを使用して、もう一度 BLAST を実行します。

図 6:ヌクレオチドBLAST結果の例。B.subtilis 168の純粋培養からの16S rRNA遺伝子配列を照会配列として用いられた。トップヒットは、期待どおりにB.サチリス株168に100%アイデンティティ(下線付き)を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。