6.6: 成長曲線:コロニー形成単位と光学密度測定を用いて成長曲線を生成する

1. セットアップ

1. 必要な実験室材料:液体媒体、固化寒天媒体、エルレンマイヤーフラスコ、15 mL試験管、リン酸緩衝生理食(PBS)、細菌細胞拡散機、70%エタノール、および分光光度計。すべてのソリューションとガラス製品は、使用前に殺菌する必要があります。
2. 70%エタノールで殺菌してワークステーションを準備します。メディアの汚染を防ぐために、ブンセンバーナーの近くで作業します。
3. 細菌を使用する場合は、適切な個人用保護具と無菌技術を使用する必要があります。細菌培養を行う場合は、ラボコートと手袋が必要です。
4. バッファー、ソリューション、試薬のレシピ
   1. リン酸緩衝生理食液(PBS)(8)。
   2. ルリア・ベルタニ・ブロス(LB)(9)。

2. プロトコル

1. メディアの準備
   1. 細菌を増殖させ、液体スープと固形寒天(1.5%w/v寒天)の両方の培地を別々のオートクレーブ可能なボトルに調剤する成長培地を特定します。ここで、LBスープとLB寒天は、大腸菌の成長のために調製した。
   2. オートクレーブで半締め付けキャップでメディアを殺菌し、121 °Cに設定し、35分間使用します。
   3. 寒天媒体の場合は、オートクレーブ後、50°Cに設定した水風呂に30分間入れ、冷却する。冷却したら、100x15mm円形ペトリ皿に20-25 mL寒天媒体を注ぎます。使用前にプレートを室温で24時間設定してください。
2. 細菌の初期調製
   1. 凍結ストックから、選択した媒体寒天上で単一のコロニー単離物を得るためのストリーク細菌。選択した細菌に対して許容される成長条件でインキュベートする。ここで、大腸菌はLB寒天に縞模様され、一晩37°C(16〜18時間)でインキュベートされる。
   2. 無菌接種ループを使用して、ストリークプレートから単一のコロニーを選択し、15 mL試験管で4mL液体媒体を接種し、選択した細菌に許容される条件で成長する。ここで、大腸菌は一晩210rpm(16-18h)で振盪で37°Cで成長する。
3. 成長曲線の設定
   1. 成長フラスコ製剤
      1. オートクレーブ適切なサイズのアーレンマイヤーフラスコ。通常、フラスコ量の合計に対するメディアの比率は 1:5 です。ここで、100mL LB培媒体は500mLフラスコに使用される。
      2. 血清ピペットを使用して、無菌培分をエルレンマイヤーフラスコに移します。
   2. 希釈シリーズの準備
      1. ラベル 15 mL 試験管: -1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、および -9 に 9 mL PBS をそれぞれに分配します。これらの数値は、CFU/mL の計算に使用される希釈係数に対応します。コレクションのタイムポイントごとに、新しいチューブのセットが必要です。(図 2)
   3. 寒天プレート製剤
      1. 収集時間と希釈係数を持つラベルプレート。各タイムポイントには、希釈ごとに1つのプレートがあります。
4. 成長曲線プロトコル
   1. メディアの接種
      1. ステップ2.2.2の一部として調製された一晩の液体培養を使用して、フラスコ培地を1:1000体の培養量で接種する。ここで、100 μLの一晩液体培養を100mL LB培養剤に添加する。
      2. メディアを旋回して、細菌を均等に分配します。
   2. タイムポイントコレクション
      1. 成長条件の設定
         1. 所定の細菌に対して選択された実験的な成長条件にフラスコを置きます。タイムポイントは、急速に成長する細菌のために頻繁に取られるべきであり、成長が遅い細菌のためにより長い間隔で取ることができる。ここで、大腸菌は毎分210回転(rpm)で揺れ、1時間ごとに取られるタイムポイントで37°Cで成長します。
      2. 光学密度(OD600)測定
         1. 開始時点(t = 0)を含む各タイムポイントで、細菌培養の1 mLを撤回し、分光光度計キュベットに分配する。
         2. キュベットをきれいに拭き取り、600 nmの波長で光学密度を記録します。光密度読み取り値が 1.0 より大きい場合は、900 μL の新鮮な媒体で培養 1:10 の 100 μL を希釈し、光学密度を記録し、OD600 測定の場合にこの値に 10 を掛けます。
      3. コロニー形成ユニット(CFU/mL)測定
         1. 各タイムポイントで、細菌培養の1 mLを撤回し、PBSの9 mLを含む-1ガラス試験管に分配する。
         2. 希釈シリーズの場合は、-1チューブからすべての希釈チューブを-9に連続的に1mL転送し、各転写後に渦を起用します。(図 2)
         3. 希釈ごとに、対応する標識された固体媒体寒天プレートに100μLの細胞懸濁液を分配する。(図 2)
         4. エタノールで殺菌したセル拡散機を用いて、文泉バーナーの炎を通過し、寒天の表面に触れて冷却し、寒天板の表面が乾燥するまで100μLの細胞懸濁液を広げる。
         5. バクテリアの増殖を支える温度でスプレッドプレートを逆さまにインキュベートします。ここで、大腸菌を37°Cでインキュベートする。
         6. インキュベーション後、一度目に見えるコロニーが発生したら、各プレート上の細菌コロニーの数をカウントし、各タイムポイントですべてのプレートに関連する希釈係数と共にこれらの値を記録します。

3. データ分析と結果

1. 光学密度(OD600)成長曲線プロット
   1. 光学密度(OD600)と時間を半ログスケールでプロットします。(図 3)
2. コロニー形成ユニット(CFU/mL)成長曲線プロット
   1. 各タイムポイントについて、コロニー数が30〜300菌の範囲内に収まる希釈プレートを選択します。コロニー数に希釈係数を掛け、100 μL スプレッドが CFU/mL を計算する際に追加の 1:10 希釈と見なされるため、10 を掛けます。
      
   2. コロニー形成単位と時間を半ログスケールでプロットします。(図 4)
3. 光学密度とコロニー形成ユニットの関係
   1. OD600とCFU/mLの関係が1.0 OD600を超える精度が低いため、OD600読み取り値が1.0 OD600以下の線形スケールでコロニー形成単位と光学密度をプロットします。ここでは、最初の 6 つのタイムポイントがプロットされます。(図 5)
   2. 方程式と R²値を表示する線形回帰近似曲線を生成します。
4. 細菌の倍増時間の決定
   1. コロニー形成単位成長曲線プロットを使用して、指数相の間に、グラフ上の2つの点をそれらの間で最も急な勾配で識別し、倍増時間を計算します。
   2. 倍増時間の計算
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t₁、 t 1 = タイムポイント₁およびt₂ = タイムポイント 2
      3. 、ここで b = t ₂の細菌数、B = t₁の細菌数、およびn = 世代数。 派生元: .
      4. 次の方法で倍増時間を計算します。
         

細菌は細胞分裂と呼ばれるプロセスを通じて繁殖し、その結果、2つの同一の娘細胞が生成されます。成長条件が良好であれば、細菌の個体数は指数関数的に増加します。

細菌増殖曲線は、培養物中の細菌の量を時間の関数としてプロットします。典型的な成長曲線は、ラグフェーズ、指数関数フェーズ、固定フェーズ、およびデスフェーズの4つの段階を経て進行します。ラグフェーズとは、バクテリアが素早く成長して分裂できる状態に達するのにかかる時間のことです。この後、細菌は指数関数的段階に移行し、急速な細胞増殖と分裂を特徴とする。この段階での細菌培養物の指数関数的な増殖速度は、特定の条件下で細菌が繁殖できる最速の速度である倍加時間として表すことができます。次に来るのは固定期で、細菌の細胞増殖が停滞し、環境中の栄養素の枯渇により成長率と死亡率が均一になります。最後に、細菌は死の段階に入ります。これは、細菌の成長が急激に低下し、深刻な栄養素の枯渇が細胞の溶解につながる場所です。

2つの手法を使用して、培養物中に存在する細菌の量を定量化し、成長曲線をプロットできます。これらの最初のものは、コロニー形成ユニット(CFU)を介して行われます。CFUを得るために、9回の希釈を1〜10シリーズ、一定の時点で行います。これらの希釈液の最初の希釈液(この例では陰性希釈液)には、9mLのPBSと1mLの細菌培養液が含まれています。その結果、希釈係数は1:10になります。次に、この溶液の1mLを次のチューブ(ネガティブ2)に移し、希釈係数は1:100になります。このプロセスは、最後のチューブであるマイナス9まで続き、最終的な希釈係数は1:10億になります。この後、各希釈液の100マイクロリットルをメッキします。次に、プレートをインキュベートし、クローンコロニーをカウントします。30〜300コロニーで成長する特定の時点の希釈プレートを使用して、その時点のミリリットルあたりのCFUを計算します。

細菌濃度を測定する2番目の一般的な方法は、光学濃度です。培養物の光学密度は、分光光度計を使用して、メディアブランクに関連して即座に測定できます。通常、これらの測定には600ナノメートル(OD600とも呼ばれる)の波長が使用され、細胞密度が増加するにつれて波長が増加します。光学密度はCFUよりも精度が劣りますが、瞬時に取得でき、必要な試薬が比較的少ないため便利です。両方の手法を併用して、培養物の細菌細胞数をより正確に近似する標準曲線を作成できます。このビデオでは、大腸菌の時限段階希釈液からCFUとOD600の測定値を取得する方法を学びます。次に、CFUとOD600の測定値をそれぞれ使用した2つの成長曲線をプロットしてから、標準曲線で関連付けます。

バクテリアを扱うときは、白衣や手袋などの適切な個人用保護具を使用し、適切な無菌技術を観察することが重要です。

この後、ワークステーションを70%エタノールで滅菌します。まず、LBブロスとLB固体寒天培地を別々のオートクレーブ可能なボトルで調製します。ボトルのキャップを部分的に閉じた後、121°Cに設定したオートクレーブで培地を35分間滅菌します。次に、寒天培地を摂氏50度に設定されたウォーターバスで30分間冷却します。冷めたら、各シャーレに20〜25mLを注ぎます。この後、プレートを室温で24時間硬化させます。

後で液体細菌培養物を作製するために使用される単一コロニー分離株を調製するには、以前に凍結したストックと適切なストリークプレーティング技術を使用して、LB寒天上に分離するための大腸菌をストリークします。皿を摂氏37度で一晩インキュベートします。この後、寒天の上で火炎滅菌接種ループを冷却してから、縞模様のプレートから単一のコロニーを選択します。15mLの試験管に4mLの液体培地を接種します。次に、大腸菌を摂氏37度で一晩成長させ、210rpmで振とうします。

成長曲線で使用される1:1000容量の細菌培養をセットアップするには、まずオートクレーブ処理した500 mLの三角フラスコを入手します。次に、50 mLの血清学的ピペットを使用して、100 mLの滅菌培地をフラスコに移します。次に、9本の15ml試験管に1〜9本として連続してラベルを付けます。これらの数値は、コロニー形成単位(CFU)の計算に使用される希釈係数に対応します。次に、各チューブに9 mLの1X PBSを加えます。この後、準備した寒天プレートに、成長する対応する時点と希釈係数をラベル付けします。この例では、大腸菌の場合、開始時点の後、1時間に1回、時点が取得されます。事前に調製した一晩の液体大腸菌培養物を使用して、オートクレーブ500 mL三角フラスコ中の培地に1:1000容量の培養液を接種します。メディアを渦巻いて、バクテリアを均等に分散させます。

分光光度計をブランクにした後、糸くずの出ないワイプでキュベットを清掃します。次に、1 mLの培養物をキュベットに分注し、分光光度計に入れて、時間点0での培養物の光学密度を取得します。次に、210rpmで振とうしながら、大腸菌を摂氏37度で成長させます。タイムポイントゼロ以降の各時点で、フラスコからさらに1 mLの細菌培養物を取り出し、光学濃度測定を繰り返します。光学濃度の読み取り値が1.0より大きい場合は、100マイクロリットルの細菌培養物を900マイクロリットルの新鮮な培地で希釈し、光学濃度をもう一度測定します。この値に OD 600 の測定では 10 を掛けることができます。

各時点のコロニー形成単位測定値を取得するには、各時点でフラスコからさらに1 mLの細菌培養物を引き出します。細菌培養物を陰性の試験管に分注し、ボルテックスで混合します。次に、最初に1 mLをネガティブ1チューブからネガティブ2チューブに移し、ボルテックスして混合することにより、希釈シリーズを実行します。1 mLをネガティブ2チューブからネガティブスリーブチューブに移し、ボルテックスで混合します。このシリアル転写をすべての希釈チューブからネガティブナインチューブまで続けます。希釈ごとに、100マイクロリットルの細胞懸濁液を対応するラベルプレートに分注します。希釈するたびに、セルスプレッダーをエタノールで滅菌し、ブンゼンバーナーの炎に通し、接種物から離れて寒天の表面に触れて冷却します。次に、セルスプレッダーを使用して、寒天プレートの表面が乾くまで細胞懸濁液を広げます。プレートを逆さまにして摂氏37度でインキュベートします。目に見えるコロニーが発生したら、各プレート上の細菌コロニーの数を数えます。これらの値とそれに関連する希釈係数を各時点で各プレートに記録します。

OD 600 成長曲線を作成するには、すべてのデータ ポイントがテーブルに正しく入力されていることを確認した後、すべてのタイム ポイントとそれに対応するデータを選択します。コロニー形成単位成長曲線プロットを生成するには、各時点でコロニー数が30〜300個の細菌の範囲内にある希釈プレートを選択します。コロニーカウント数に希釈係数を掛け、次に10を掛けます。これは、100マイクロリットルのスプレッドが、ミリリットルあたりのコロニー形成単位を計算するときに追加の1:10希釈と見なされるためです。この後、コロニー形成単位と時間の関係を半対数スケールでプロットします。

これらのプロットは、それぞれOD 600とCFUの測定で作成され、大腸菌の成長速度に関する貴重な情報を提供できます。光学密度とコロニー形成単位を関連付けることができるため、OD 600の測定値からミリリットルあたりのCFUを推定でき、将来の実験で時間と材料を節約できます。

これを行うには、OD 600 の読み取り値が 1 以下の線形スケールで、光学密度に対してコロニー形成単位をプロットします。0. この後、Y = MX + B の形式で線形回帰傾向線を生成します。ここで、M は傾き、B は y 切片です。データポイントを右クリックし、[トレンドラインと線形の追加]を選択します。次に、チェックボックスをオンにして方程式をグラフに表示し、Rの二乗値をグラフに表示します。R二乗値は、データが適合回帰直線にどの程度一致したかの統計的測定値です。この例では、最初の 6 つの時点が X 軸に OD 600、Y 軸にミリリットルあたりの CFU でプロットされています。同じ成長条件での将来の実験では、これらの傾きとy切片の値をこの式に当てはめて、OD 600の読み取り値からCFUを推定できます。次に、コロニー形成単位成長曲線プロットを見てください。指数フェーズでは、2 つの時間ポイント間の傾斜が最も急な 2 つの時点を特定します。倍増時間を計算するには、まず選択した時点間の時間の変化を計算します。次に、ここに示す式を使用して世代の変化を計算します。ここで、小文字の b は時点 3 の細菌の数で、大文字の b は時刻 2 の細菌の数です。最後に、時間の変化を世代の変化で割ります。この例では、倍増時間は 0 です。26時間または15分19秒。異なる実験的処理間で倍加時間を比較することで、特定の細菌種に最適な増殖条件を特定することができます。したがって、倍加時間が最も短い治療は、テストされた条件の中で最も最適になります。