成長曲線:コロニー形成単位と光学密度測定を用いて成長曲線を生成する

1. セットアップ

1. 必要な実験室材料:液体媒体、固化寒天媒体、エルレンマイヤーフラスコ、15 mL試験管、リン酸緩衝生理食(PBS)、細菌細胞拡散機、70%エタノール、および分光光度計。すべてのソリューションとガラス製品は、使用前に殺菌する必要があります。
2. 70%エタノールで殺菌してワークステーションを準備します。メディアの汚染を防ぐために、ブンセンバーナーの近くで作業します。
3. 細菌を使用する場合は、適切な個人用保護具と無菌技術を使用する必要があります。細菌培養を行う場合は、ラボコートと手袋が必要です。
4. バッファー、ソリューション、試薬のレシピ
   1. リン酸緩衝生理食液(PBS)(8)。
   2. ルリア・ベルタニ・ブロス(LB)(9)。

2. プロトコル

1. メディアの準備
   1. 細菌を増殖させ、液体スープと固形寒天(1.5%w/v寒天)の両方の培地を別々のオートクレーブ可能なボトルに調剤する成長培地を特定します。ここで、LBスープとLB寒天は、大腸菌の成長のために調製した。
   2. オートクレーブで半締め付けキャップでメディアを殺菌し、121 °Cに設定し、35分間使用します。
   3. 寒天媒体の場合は、オートクレーブ後、50°Cに設定した水風呂に30分間入れ、冷却する。冷却したら、100x15mm円形ペトリ皿に20-25 mL寒天媒体を注ぎます。使用前にプレートを室温で24時間設定してください。
2. 細菌の初期調製
   1. 凍結ストックから、選択した媒体寒天上で単一のコロニー単離物を得るためのストリーク細菌。選択した細菌に対して許容される成長条件でインキュベートする。ここで、大腸菌はLB寒天に縞模様され、一晩37°C(16〜18時間)でインキュベートされる。
   2. 無菌接種ループを使用して、ストリークプレートから単一のコロニーを選択し、15 mL試験管で4mL液体媒体を接種し、選択した細菌に許容される条件で成長する。ここで、大腸菌は一晩210rpm(16-18h)で振盪で37°Cで成長する。
3. 成長曲線の設定
   1. 成長フラスコ製剤
      1. オートクレーブ適切なサイズのアーレンマイヤーフラスコ。通常、フラスコ量の合計に対するメディアの比率は 1:5 です。ここで、100mL LB培媒体は500mLフラスコに使用される。
      2. 血清ピペットを使用して、無菌培分をエルレンマイヤーフラスコに移します。
   2. 希釈シリーズの準備
      1. ラベル 15 mL 試験管: -1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、および -9 に 9 mL PBS をそれぞれに分配します。これらの数値は、CFU/mL の計算に使用される希釈係数に対応します。コレクションのタイムポイントごとに、新しいチューブのセットが必要です。(図 2)
   3. 寒天プレート製剤
      1. 収集時間と希釈係数を持つラベルプレート。各タイムポイントには、希釈ごとに1つのプレートがあります。
4. 成長曲線プロトコル
   1. メディアの接種
      1. ステップ2.2.2の一部として調製された一晩の液体培養を使用して、フラスコ培地を1:1000体の培養量で接種する。ここで、100 μLの一晩液体培養を100mL LB培養剤に添加する。
      2. メディアを旋回して、細菌を均等に分配します。
   2. タイムポイントコレクション
      1. 成長条件の設定
         1. 所定の細菌に対して選択された実験的な成長条件にフラスコを置きます。タイムポイントは、急速に成長する細菌のために頻繁に取られるべきであり、成長が遅い細菌のためにより長い間隔で取ることができる。ここで、大腸菌は毎分210回転(rpm)で揺れ、1時間ごとに取られるタイムポイントで37°Cで成長します。
      2. 光学密度(OD600)測定
         1. 開始時点(t = 0)を含む各タイムポイントで、細菌培養の1 mLを撤回し、分光光度計キュベットに分配する。
         2. キュベットをきれいに拭き取り、600 nmの波長で光学密度を記録します。光密度読み取り値が 1.0 より大きい場合は、900 μL の新鮮な媒体で培養 1:10 の 100 μL を希釈し、光学密度を記録し、OD600 測定の場合にこの値に 10 を掛けます。
      3. コロニー形成ユニット(CFU/mL)測定
         1. 各タイムポイントで、細菌培養の1 mLを撤回し、PBSの9 mLを含む-1ガラス試験管に分配する。
         2. 希釈シリーズの場合は、-1チューブからすべての希釈チューブを-9に連続的に1mL転送し、各転写後に渦を起用します。(図 2)
         3. 希釈ごとに、対応する標識された固体媒体寒天プレートに100μLの細胞懸濁液を分配する。(図 2)
         4. エタノールで殺菌したセル拡散機を用いて、文泉バーナーの炎を通過し、寒天の表面に触れて冷却し、寒天板の表面が乾燥するまで100μLの細胞懸濁液を広げる。
         5. バクテリアの増殖を支える温度でスプレッドプレートを逆さまにインキュベートします。ここで、大腸菌を37°Cでインキュベートする。
         6. インキュベーション後、一度目に見えるコロニーが発生したら、各プレート上の細菌コロニーの数をカウントし、各タイムポイントですべてのプレートに関連する希釈係数と共にこれらの値を記録します。

3. データ分析と結果

1. 光学密度(OD600)成長曲線プロット
   1. 光学密度(OD600)と時間を半ログスケールでプロットします。(図 3)
2. コロニー形成ユニット(CFU/mL)成長曲線プロット
   1. 各タイムポイントについて、コロニー数が30〜300菌の範囲内に収まる希釈プレートを選択します。コロニー数に希釈係数を掛け、100 μL スプレッドが CFU/mL を計算する際に追加の 1:10 希釈と見なされるため、10 を掛けます。
      
   2. コロニー形成単位と時間を半ログスケールでプロットします。(図 4)
3. 光学密度とコロニー形成ユニットの関係
   1. OD600とCFU/mLの関係が1.0 OD600を超える精度が低いため、OD600読み取り値が1.0 OD600以下の線形スケールでコロニー形成単位と光学密度をプロットします。ここでは、最初の 6 つのタイムポイントがプロットされます。(図 5)
   2. 方程式と R²値を表示する線形回帰近似曲線を生成します。
4. 細菌の倍増時間の決定
   1. コロニー形成単位成長曲線プロットを使用して、指数相の間に、グラフ上の2つの点をそれらの間で最も急な勾配で識別し、倍増時間を計算します。
   2. 倍増時間の計算
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t₁、 t 1 = タイムポイント₁およびt₂ = タイムポイント 2
      3. 、ここで b = t ₂の細菌数、B = t₁の細菌数、およびn = 世代数。 派生元: .
      4. 次の方法で倍増時間を計算します。