抗生物質感受性試験:2つの抗生物質のMIC値を決定し、抗生物質の相乗効果を評価するエプシロメーター試験

1. エプシロメーター試験(E検定)

1. セットアップ
   1. 手袋とラボコートを着用する
   2. 70%エタノールを使用して殺菌してワークスペースを準備
   3. ミュラー・ヒントン寒天プレート(MHAプレート)を収集
2. マクファーランド濁度規格No.0.5の準備
   1. 塩化バリウム(BaCl2)の1%溶液を調調します。
      100mL蒸留水に1グラムの無水バリウム塩化バリウム(BaCl2)を加えます。渦がよく。
   2. 硫酸の1%溶液を調出_す(H2SO_4):
      蒸留水の99 mLに_濃縮H2SO4の1 mLを加えます。渦がよく。
   3. マクファーランドの濁り標準番号0.5を準備します。
      1%H2 SO₄溶液の5mLで50 μL BaCl₂溶液。濁った懸濁液を得るためによく解決策を渦。
   4. ホイルで覆われた管の中のMcFarlandの濁りの標準No.0.5を保つ。最大6ヶ月間25°Cで保管してください。使用前に均質な溶液によく渦。
3. MHAプレートの準備
   1. 無菌ループを用いて血液寒天板からスクレープストレプトコッカス群G細菌。生理生理生理の1mLに混合し、細菌の懸濁液に渦。
   2. 実験中に同じ接種サイズを持つために、同じ濁りを達成するために、マクファーランド標準No.0.5とサスペンションを比較します。追加の生理生理生理知または細菌を使用して濃度を調整します。
   3. 無菌綿の先端アプリケーターを使用してMHAプレートを接種します。プレートをそっと洗って表面を覆います。以下に説明する 3 つの方法のいずれかに進みます (1.4-1.6)。
4. 単一の抗生物質耐性試験。 連鎖球菌群G、ペニシリンGまたはゲンタマイシンに対する耐性
   1. MHAプレートの中央にE検定ストリップ(ペニシリンGまたはゲンタマイシン)を置きます(図1 A,B)。
   2. 18-20時間、37°Cのインキュベート。
   3. 結果を読んでください。MICは、等級付き抗生物質試験帯と交差する阻害ゾーンとして測定される(図1 C,D)。

図1:単一E検定。A)ペニシリンGおよびB)のE検定ストリップの配置(AおよびB)の前に(AおよびB)および後(CおよびD)一晩のグループG連鎖球菌の細菌コロニーで覆われたミューラー・ヒントン寒天板上のゲンタマイシン37°Cでのインキュベーション 5% CO₂.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

5. シナジーテストのクロスアプローチ。連鎖球菌群Gは、ペニシリンGおよびゲンタマイシンに対する耐性である。
   1. 異なる抗生物質(例えばペニシリンGおよびゲンタマイシン)を含む2つのE検定ストリップを、クロス形成中の接種されたMHAプレートに置きます。
      1. 最も正確な結果を出すには、単一の抗生物質耐性試験で以前に決定されたMIC値でのスケール間の交点に約90°の角度で十字を配置することを目指す(図2A)。
      2. 一部の抗生物質は既にプレートに吸収されている可能性があるため、ストリップを寒天プレート上に置くと、それらは移動しないでください。したがって、ストリップをわずかに間違った角度(例えば85°)で維持し、実際のMIC値から最大1〜2mmに維持することがより適切です。この問題を軽減するために、実験を三色にすることをお勧めします。
   2. 18-20時間、37°Cのインキュベート。
   3. 結果を読んでください。MICは、それぞれのE検定ストリップ上の等級付き抗生物質試験ストリップと交差する阻害ゾーンとして測定される(図2B)。
   4. 相乗効果を決定するために、分画抑制濃度(FIC)(式1)の式を使用します。

図2:相乗効果検出-クロステスト。連鎖球菌群GのペニシリンGおよびゲンタマイシンのMICの抗菌相乗効果試験の結果(A)及び(B)インキュベーションを37°C 5%CO2で一晩インキュベーションした。2つの個々のMIC値(ペニシリンG:0.094 μg/mL、ゲンタマイシン:8 μg/mL)の間に90°の角度が形成されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

6. シナジーテスト非クロスアプローチ。連鎖球菌群Gは、ペニシリンGおよびゲンタマイシンに対する耐性である。
   1. EテストストリップをMHAプレートの中央に配置します(図3 A,D)。
   2. 以前に決定された MIC 値が各ストリップ上のどこにあったかをマークします。
   3. 室温で1時間インキュベートする。
   4. 各MHAプレートのEテストストリップを破棄します(図3 B,E)。
   5. MIC 値がマークに対応し、整列するように、2 番目の E 検定ストリップ (異なる抗生物質を含む) を以前に削除したストリップの領域にそれぞれ配置します。
   6. 18-20時間、37°Cのインキュベート。
   7. 結果を読んでください。MICは、それぞれのE検定ストリップ上の等級付き抗生物質試験ストリップと交差する阻害ゾーンとして測定される(図3 C,F)。
   8. 相乗効果を決定するために、分画阻害濃度(FIC)の式が用いられる(式1)。

図 3: 相乗効果検出 - 非クロステスト。連鎖球菌群G.A)レンタマイシンストリップ(8μg/mL中心)のペニシリンGおよびゲンタマイシンのMICの抗菌相乗効果試験の結果(8μg/mL中心)ストレプトコッカス群G細菌の上に、B)ゲンタマイシンストリップ、Cの除去)ストレプトコッカス群G細菌、D)ペニシリンGストリップ(0.094 μg/mL中心)の上にゲンタミシン/ペニシリンGストリップ(0.094 μg/mL中心)、E)ペニシリンGストリップ、F)複合ペニシリンG/の除去レンタマイシンストリップ(8 μg/mL中心)をストレプトコッカス群G細菌の上に置く。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. ブロス試験

1. セットアップ
   1. 手袋とラボコートを着用する
   2. 70%エタノールを使用して殺菌してワークスペースを準備
   3. 50%のライズされた馬の血および20 mg/mL β-NAD(MH-F)と15mL MHのスープを集める
2. (オプション)E検定[プロトコル1]を実行して、固体媒体上のMICを決定する
   1. オプションですが、このような知識は、より良い実験設計を可能にします(例えば、追加された抗生物質の濃度は、プレートから決定されたMIC値を囲むように設計することができ、実験が成功する可能性を向上させる)。
3. 細菌の接種を準備する。前述のように、細菌濃度はOD nm測定またはマクファーランド濁度基準によって推定することができる
   1. OD600 nm法
      1. 確立された細菌濃度で細菌懸濁液を得る
      2. 0.003のOD600を達成するためにMH-Fスープの培養を希釈する
   2. マクファーランド濁度法
      1. 無菌チューブに15 mL MH-Fスープを入れます。
      2. MH-Fスープを(プレートから)マクファーランドレベルに細菌で接種します。溶液を精力的に渦に入れ。無菌ペトリ皿に溶液を注ぎます。
4. 抗生物質の準備
   1. 必要な抗生物質の濃度を決定する
      1. E-検定からMIC値を特定する(ペニシリンGの場合は0.125 μg/mL、ゲンタマイシンは8μg/mL)
      2. 寒天板MIC値に2^4-27を掛け、4-7 2xシリアル希釈に対応します。これは抗生物質の開始濃度になります。(ペニシリンG、7つの2xシリアル希釈:0.125 μg/mL x 2⁷ = 16 μg/mL;ゲンタマイシンの場合、4つの2xシリアル希釈8 μg/mL x 2⁴ = 128 μg/mL
      3. 抗生物質のストック濃度を生成するために所望の開始値100倍を乗算する(例えば1.6 mg/mLペニシリンGおよび12.8 mg/mLゲンタマイシンの株式)
   2. それに応じて100倍の抗生物質ストック濃度を準備する
      1. 10mLオートクレーブ水に抗生物質を溶解し、ボルテックスを生成するために、ストック溶液を生成する(例えば16mgペニシリンGと128mgゲンタマイシンは、上記の株式を作成するために)
5. マイクロプレートウェルに細菌を追加
   1. アリコット200 μl MH-Fブロスは、三重の実験のための96ウェルマイクロチタープレートの最初の3列のウェルに細菌の接種を含有する。
6. マイクロプレートウェルに抗生物質を追加
   1. ウェルの最初のカラム(A1、B1、C1)に細菌を含む200μLの余分なMH-Fスープを追加し、総体積を400μLにします。
   2. ウェルの最初の列に抗生物質のストック濃度の4 μLを追加します。サンプルには400 μLが含まれているため、抗生物質の100倍の希釈が生じる。
   3. A1からA2に200 μL細菌/抗生物質をA11に移すことによって2倍の連続希釈を生成する。希釈の間に激しくピペット。追加の行の手順を繰り返します。
   4. すべてのウェルの最終容積が200 μLになるように、カラム11から200 μLを取り外します。
   5. 最後の列(A12、B12、C12)は、抗生物質なしで、コントロールとして残します。
7. MIC 値の決定
   1. 96ウェルマイクロチタープレートを37°Cで24時間、揺らさずにインキュベートします。
   2. MIC値は、細菌の目に見える増殖を示さない希釈系列の最後の井戸として定義される(図4)。ただし、この値は、元のイノクル サイズが正しい場合にのみ信頼できます。

図4:ブロス希釈によるMIC判定。MICは、濁りを変化させる前に透明度(細菌の増殖なし)を示す最後の井戸として定義されています。行はペニシリンGのMIC値の複製であり、行はゲンタマイシンのMIC値の複製であり、いずれもストレプトコッカスグループG.Aの単離と比較して、実際の実験結果、B)Aからの値の概略解釈(灰色 = 成長なし;白=成長)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:元の細菌濃度をカウントする希釈系列の概略手順。希釈は記載されているように(10x希釈系列に対して180μLで希釈した20μL)、次いでA-H行から10μLが示すように2つの別々の血液寒天プレートにめっきされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

8. 元のイヌキュラムサイズを決定する
   注:マイクロブロスアッセイは、使用される元の接種サイズに対して非常に敏感です。過剰な接種サイズは、追加された抗生物質は、もはやその比率で成長を阻害することができないので、偽陽性の結果を与えます。したがって、マイクロウェルにどの程度の細菌が追加されたかを確認することが重要です。データは実験の時点では利用できませんが(24時間インキュベーションが必要なため)、コントロールとして機能します。添加された細菌の数が記載された濃度範囲内にある場合、MIC値を信頼できます。接種が高すぎるか低すぎる場合は、実験を繰り返す必要があります。
   1. 細菌を連続的に希釈する
      1. 96ウェルマイクロティタープレートを調製し、元の細菌濃度を希釈して接種サイズを決定する。最適は10^5-6細菌と200 μLの容積である。希釈を行うために、まずアリコート180μL滅菌PBSをB-Hの各ウェルに(三重1-3)。
      2. 次に、100 μlの細菌溶液をAに加える(三量三分の1-3)。
      3. 20μlの細菌をAからBに移し、ピペを激しく移送して10倍の連続希釈(三重)を生成します。C-H の手順を繰り返します。
   2. 接種サイズ決定のための細菌希釈をプレート化
      1. 図 5に従って血の寒天プレートをマークします。
      2. 図 5に従って、シリアル希釈からプレートに 10 μL を転送します。
      3. プレートを37°Cで20~24時間インキュベートします。
   3. 細菌の接種サイズを決定する
      1. 5~50コロニー内のスポット内の細菌数を数える(図6)。
      2. トリプリケートサンプルの平均を計算して初期の接種サイズを計算し、希釈係数を増算し、希釈係数(例えばBサンプルの場合は100倍、Cサンプルの場合は1000倍、Dサンプルの場合は1000倍)を乗算し、10μLのスポッティング量を補正します。cfu/mLの接種サイズ。接種が10^5-6 cfu/mL内にある場合、MICデータは信頼できます。

図6:接種サイズの決定。図5に従って接種した細菌を37°Cで20〜24時間インキュベートし、次いでカウントした。行 D には、数えるコロニーの数が多い (例: 5~ 50) があります。Aの試料は希釈されず、Bは10倍、Cは100倍希釈され、Dは1000倍希釈され、各スポットで10μLのみがめっきされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。