顕微鏡検査と染色:グラム、カプセル、内胞染色

1. グラム染色

1. セットアップ
   1. 染料が手や衣類を汚すので、手袋と不燃性のラボコートを着用してください。
   2. ブンゼンバーナーは、細菌を加熱するために使用されます。炎を扱うときは注意してください。長い髪を結び返す
   3. 市販のグラム染色試薬が使用されます。
   4. 実験室のワイプが付いているきれいな顕微鏡のスライド。
2. プロトコル
   1. ピペ状10μLリン酸塩緩衝生理食生または培養ブロスをスライド上に置く。
   2. 細菌のコロニーを液体に塗りつぶし、薄い均一層を作り出す。
      注:細菌がグラム染色結果に影響を与える細胞壁に変化を持つことができるので、24時間より古い培養物を使用しないでください(1、4)。
   3. 完全に空気乾燥スライド。
   4. 乾燥したら、炎(細菌側上)を通してスライドを通過させて熱修正細菌を4〜5回。
      注:炎の中でスライドを長く保持したり、細菌細胞を歪めたりしないでください(1)。
   5. シンクの上で作業し、スライドレベルを保持し、完全に熱固定細菌をカバーするためにグラムのクリスタルバイオレットを適用し、45秒を保持することを可能にします。
   6. 余分なクリスタルバイオレットを斜めに保持し、スライド上の穏やかな間接的な水の流れを噴出し、それが染色された細菌の上に実行できるようにすることで、過剰なクリスタルバイオレットをすすいでください。細菌に直接水を噴出しないでください。
   7. スライドレベルをもう一度保持し、グラムのヨウ素溶液を塗布して染色された細菌を完全に覆い、45秒間放置する。
   8. 上記のステップ1.2.6のように余分なヨウ素をすすいでください。
   9. スライドを斜めに保持しながら、スライドにデカラーライザーを数滴追加し、流出が明らかになるまで染色された細菌の上にトリクルダウンさせます。通常、約 5 秒です。上記のステップ1.2.6のように、すぐに水ですすいでください。
      注:これはプロトコルの重要なステップです。デカラーライザーが長すぎたり、十分に長くならない場合は、誤ったグラム染色(4)が生じる。
   10. もう一度スライドレベルを保持し、完全に細菌をカバーするためにグラムのサフラニンを適用し、45秒を保持できるようにします。
   11. 上記のステップ1.2.6のように過剰なサフラニンをすすいでください。
   12. ブロットは、ペーパータオルを使用してスライドから余分な水をこすらない。
   13. 100Xの目的で油浸を使用して顕微鏡上のスライドを調べます。
3. 結果とデータ分析
   1. グラム陽性の細菌は紫色に染色します。
   2. グラム陰性の細菌は赤く染まる。
   3. 細菌の形状(コッチ、バチリ、曲面ロッド、スパイラル)が見えるようになります。
   4. 細菌細胞(単一細胞、対化細胞、細胞鎖、クラスター、グループ化)の配置が表示されます。

2. カプセル染色

1. セットアップ
   1. 手袋とラボコートを染色物として着用し、手や衣類を汚します。
   2. 1%のクリスタルバイオレット溶液を調作成するには、溶解するまで25mLの蒸留水で0.25グラムのクリスタルバイオレットを混ぜます。
   3. 1%のコンゴ赤溶液を調作成するには、0.25グラムのコンゴレッドを溶かすまで25 mLの蒸留水と混合します。
   4. 実験室のワイプが付いているきれいなスライド。
2. プロトコル
   1. スライド上に10 μLコンゴレッドを配置します。
   2. ピペット先端を使用して、細菌のコロニーを染料に塗りつぶし、薄い均一層を作り出します。
   3. 染料/細胞混合物と完全に空気乾燥スライド、5-7分。
      注:加熱はカプセルを脱水または歪めることができるので、加熱固定しないでください。
   4. 1%クリスタルバイオレットで1分間塗りつぶしを水浸しにします。
   5. スライドを斜めに保持し、滑り台に穏やかな間接的な水の流れを吹き付け、染色された細菌の上に流れ落ちることによって余分な汚れをすすいでください。細菌に直接水を噴出しないでください。
   6. 完全に空気乾燥するまで、スライドを45度の角度で保持します。
   7. 100Xの目的で油浸の下で顕微鏡の汚れを調べる。
3. 結果とデータ分析
   1. 細菌細胞は紫色に染色します。
   2. スライドの背景が暗く染まる。
   3. カプセルは、暗い背景に対して細胞の周りの明確なハローになります。

3. 内散性染色(シェーファーフルトン法)

1. セットアップ
   1. 手袋と不燃性のラボコートを着用して、手や衣類を染料や炎から守ってください。
   2. ブンゼンバーナーは、細菌を加熱するために使用されます。炎を扱うときは注意してください。長い髪を結び返す
   3. 0.5%のマラカイトグリーン溶液を調作成するには、溶解するまで25 mLの蒸留水で0.125グラムのマラカイトグリーンを混ぜます。
   4. 市販のグラムのサフラニン試薬ソリューションを使用してください。
   5. 実験室のワイプが付いているきれいなスライド。
2. プロトコル
   1. ピペ状10μlリン酸緩衝生理食生(PBS)または培養ブロスをスライド上に置く。
   2. 無菌技術を用いて、細菌のコロニーを液体に塗りつぶし、薄い偶数層を作り出す。
      注:内胞子は一般に若い細胞では形成されないため、培養は18~36時間齢(9)であることが推奨される。
   3. 完全に空気乾燥スライド。
   4. 炎を4~5回通してスライド(細菌側を上に)渡すことで熱を固定します。
   5. 染料を含むのに役立つように、熱固定スミアの上にレンズペーパー(細菌の汚れに合わせてカット)を置きます。
   6. マラカイトグリーン溶液でレンズペーパーを飽和させます。
   7. 熱いお湯のビーカーの上にスライドを置き、5分間スチームスライドし、必要に応じて一度にさらに染料を加えてレンズペーパーを湿らせます。
      注:染料溶液の過熱や乾燥は避けてください。
   8. ビーカーからスライドを取り外し、レンズペーパーを取り外して捨て、スライドを2分間冷まします。
   9. スライドを斜めに持ち、穏やかな間接的な水の流れをスライドに吹き付け、スミアの上に排水できるようにし、十分に洗い流します。
   10. スライドレベルを保持し、サフラニンで洪水スミアは、1分間立つことを可能にする。
   11. 上記のステップ 3.2.9 のように過剰なサフラニンをすすいでください。
   12. 空気乾燥を許可します。
   13. 100Xの目的で油浸の下の顕微鏡の滑土を調べる。
3. 結果とデータ分析
   1. 胞子は緑色に染まる
   2. 栄養細胞は赤く染まる。
   3. いくつかの栄養細胞は胞子を含む;細胞は赤く染色し、内胞子は緑色に染まる。