適応塩化カルシウム手順を用いて大腸菌細胞の形質転換

このプロトコルは、塩化カルシウム手順(12)の適応を用いて有能な大腸菌DH5αの調製および形質転換について説明する。

1. セットアップ

1. 機器
   • 分光 光度 計
   • ソルバル遠心分離機(または同等)
   • ベンチトップ遠心分離機
   • ヒートブロックまたは水浴
   • オービタルシェーカー
   • ステーナリーインキュベーター
   • ゲル鋳造トレイ
   • まあ櫛
   • 電圧源
   • ゲルボックス
   • 紫外線光源
   • マイクロ波
2. ソリューションと試薬
   • ルリア・ベルタニ(LB)スープ(10gカゼイン酵素加水分解物、5g酵母エキス、5g塩化ナトリウム1000 mL_のH2O)
   • カタボライト抑圧(SOC):(2%(w/v)トリプトン、0.5%(w/v)酵母エキス、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl 2、10mMMgSO_4、および20mMグルコース)
   • CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl_2,20 mM CaCl₂₎溶液.
   • M CaCl₂溶液(細胞が直ちに形質転換される場合)または10%(v/v)グリセロールを含む0.1M_CaCl2溶液(細胞が将来の使用のために凍結される場合)。
   • LB寒天プレート
   • LB寒天選択プレート(この実験では、プラスミド使用済みのアンピシリン耐性を付与するので、アンピシリン100μg/mLを含むLB寒天プレートを用いた)
   • 大腸菌DH5α株
   • プラスミド pUC19 DNA (100 pg/ μl)
   • QIAprep スピン ミニプレップ キット (キアゲン)
   • ヒンドIII制限酵素
   • 1 kb プラス DNA はしご
   • 低融点アガローズ
   • 1X TAEバッファー(40mMトリスベース、20mM酢酸、1mM EDTA)
   • 臭化エチジウム (10mg/mL)
3. 一般的な安全に関する注意事項
   大腸菌DH5αは、バイオセーフティレベル1(BSL1)に分類されます。このカテゴリーの微生物は、健康な成人における感染の脅威をほとんどまたは全くもたらさない。しかし、微生物の慎重な操作が必要です。

重要重要このプロトコルのすべてのステップは、無菌技術を使用して、指示がない限り氷または4°Cの温度で行われる必要があります。

2. プロトコル

1. 大腸菌DH5αの凍結ストック(LBで成長した一晩培養から20%グリセロールで凍結)から、LB寒天プレート上で単離するための細菌をストリークアウトする。一晩37°C(16~20時間)でインキュベートしてください。
2. 単一のコロニーをチューブ内のLBスープの3 mLに接種します。一晩37°C(16-20時間)で210 rpmで揺れを成長させる。
3. 一晩培養のOD600を測定します。一晩培養を使用して、1リットルのフラスコで100 mLのLBスープをOD600=0.01に接種します。培養量がOD600=0.35(約3時間)に達するまで、分光光度計で37°CモニタリングOD600で激しく揺れる培養(210rpm)を15~20分ごとにインキュベートします。
   注:変換を効率的に行うには、細菌細胞が指数関数的な成長段階にある必要があります。細胞の最大数は10⁸細胞/mLである必要があり、大腸菌のほとんどの株はOD600=0.4に対応します。分光光度計を使用すると、OD600を測定することができ、細胞が適切な成長段階にあることを判断することができます。このプロトコルが細菌の他の株に使用される場合、この相関を決定するために、特定のOD600値でコロニー形成単位の数を決定するための較正が必要になります。
4. 培養物の50mLを2本の冷たいポリプロピレン遠心分離ボトルに移します。ボトルを氷の上に20分間置き、冷まします。
5. 2700g(ソルバルGSAローターで4100rpm)の遠心分離によって細胞を回収し、4°Cで10分間回収します。
6. 上清を取り除く。ボトルをパッドまたはペーパータオルの上に逆さまに置くことによって、メディアの最後の痕跡を排出します。
7. 各細菌ペレットをCaCl_2-MgCl2(80 mM MgCl_2、20 mM CaCl₂₎の30 mLに再ステーペンします。まず溶液の5 mLを追加し、ペレットが完全に溶解するまで慎重に旋回し、残りの25 mLの溶液を追加します。
8. 手順 2.4 を繰り返します。
9. 手順 2.5 を繰り返します。
10. 有能な細胞が直接形質転換される場合は、チューブを慎重に旋回することにより、各細菌ペレットをCaCl 2(0.1M)氷冷溶液の2mLに再ステージングします。ペレットがこの方法で再懸濁されない場合は、上下にゆっくりとピペッティング(気泡形成を避ける)によって再懸濁する。
    あるいは、有能な細胞を凍結し、後で使用するために保存することができる。有能な細胞の凍結ストックを調剤するために、10%(v/v)グリセロールを含む0.1M_{CaCl2溶液の2ml}でペレットを再中断する。このソリューションは、氷冷である必要があります。アリコット細胞懸濁液を氷冷1.5 mLポリプロピレンチューブ(チューブ当たり160μl)に注入。有能な細胞をドライアイス/エタノール浴で直ちに凍結する。チューブを-70°Cの冷凍庫に移します。
11. CaCl_2-処理細胞を形質転換するには、50 μlの有能な細胞を2つの1.5mlポリプロピレンチューブのそれぞれに移します。pUC19プラスミドDNAの1 μl(100 pg)をチューブの1つに加え、DNAなしで2番目のチューブを残します(陰性対照)。穏やかに混ぜる(気泡形成を避ける)。氷の上で30分間インキュベートします。
    注:10μL以下の体積のDNAは50ng以下で、変換に使用する必要があります。
12. チューブをヒートブロックに移し、42°Cで45度正確にインキュベートします。
    注:ヒートショックは重要なステップです。温度またはインキュベーション時間を超えないようにしてください。
13. 容易に氷に管を移す。2分間インキュベートします。
14. 950 μLのSOC培地を加え、37°Cで1時間チューブをインキュベートし、プラスミドにコードされた抗生物質耐性マーカーを回収して発現させます。
15. SOCで1000 μLの細胞懸濁液の10μLを希釈し(1/100希釈)、SOCで1000μLの細胞懸濁液の100μL(1/10希釈)。希釈のプレート100μlは、コントロールと同様に、選択的プレート上に、へらを用いて広がる。通常、1/100および1/10希釈のメッキ100 μLは、プレートあたり十分な数のコロニー形成単位(cfu)をもたらすでしょう。理想的には、この数は30~300 cfuの範囲で、十分なコロニーがあるが互いに分離している必要があります。ただし、cfu の数は変換効率によって異なります (データ分析と結果セクションを参照)。
16. プレートを37°Cでインキュベートします。形質転換されたコロニーは12〜16時間で現れるはずです(この範囲は細胞株と選択方法によって異なります)。ネガティブコントロールでコロニーが成長してはなりません。
17. 変換のために得られたcfu/プレートをカウントします(表1)。
18. pUC19プラスミドを持つ形質転換体を確認するために、プラスミド調製およびその後の消化が行われる。この目的のために、チューブ内のLBスープの3ミリリットルに単一のコロニーを接種します。一晩37°C(16-20時間)で210 rpmで揺れを成長させる。
19. メーカーの指示に従って、QIAprepスピンミニプレップキットを使用してプラスミド製剤を準備します。
20. 精製したpUC19の1μgを37°Cで1時間37°Cで消化する。
    注:pUC19複数のクローニング部位で切断する酵素は、このステップに使用できます。

コンポーネント	量
10X 制限ダイジェスト バッファ	2.5 μl
プラスミド pUC19	1 μg
ヒンドIii	1 μl
H2O	20.5 μl (25 μl まで)

21. 分子量はしご、消化されたpUC19 DNAおよび同量の未消化pUC19 DNAを1%のアガロースゲルで95Vで1時間の臭化物を含む。
    注:時間と電圧は、使用する機器によって異なります。
22. 紫外線の下でゲルを視覚化します。消化されたpUC19 DNA(図2)の大きさを比較する(データ分析と結果セクションを参照)。
    各特定の変換実験の目標に従って変換を検証するために必要な手順を進めます。

図2:形質転換DH5α細胞からの回収プラスミドDNAの消化。プラスミドDNAは形質転換されたDH5α細胞から回収し、ヒンdIIIで消化し、1%のアガロースゲルで走り、UV源で可視化した(ステップ2.19~2.22)。

3. データ分析と結果

形質転換効率を計算するには、細胞が細胞外DNAをどの程度よく取り上げたかを示す指標で、形質転換で得られたコロニーをカウントする必要があります。

希釈	Cfu
1/100	34
1/10	246

表1:コロニー形成単位(cfu)は、形質転換実験からカウントされた。

形質転換効率(TE)は、1μgのプラスミドを所定の容積の有能な細胞に変換することから生じるcfuの数の尺度である。多くのパラメータは、プラスミドサイズ、細胞遺伝子型、能力準備中の成長段階、変換方法など、変換効率に影響を与えます。TE を計算する際には、めっき前に行われた希釈(もしある場合)を考慮し、cfuの総数の計算に組み込むことが重要です。変換効率 (TE) は、次の式で計算されます。

まず、この例では0.0001μgのDNAのμgでcfuを分割します。次に、結果を希釈係数で除算します。この例では、1/10希釈を用いて、1ml溶液の100μLをめっきした(希釈:1/10×100μL/1000 μL=0.01)。