結合:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に移す方法

1. セットアップ

1. ルリア・ベルタニ培地(LB)のオートクレーブ約1L。この無菌LBは、0.3mMジアミノピメル酸(DAP)を含むLBの約5mLを作るために使用されます。
2. 次のプレートを収集する:1Xテトと0.3 mM DAPのLB寒天プレート、1XテトのみのLB寒天プレート、および1Xアンプ/テットのみのLB寒天プレート。
3. いくつかのグリセロールと殺菌前のプラスチックピペットの先端の箱が手元に近いであることを確認してください。
4. 微生物を含む任意の作業を開始する前に、70%のエタノールでワークスペースを殺菌します。ラボコートや手袋など、必要な個人用保護具は必ず着用してください。
5. 終了後、70%のエタノールですべての表面と手袋を殺菌し、手を洗います。

2. ドナーおよびレシピエント株の調製

1. ドナーおよびレシピエント株の5mL細菌培養物を調作し、通気と220rpmで振盪して37°Cで一晩成長させる。ドナー株は0.3 mM DAPでLBで成長する必要があります。
2. 両方の培養物の1 mL(5分間〜3000 rpm)をスピンダウンし、PBSで細胞を洗浄します。
3. リン酸緩衝生理食生の500 μLで細胞を再中断する(PBS)。

3. コンジュゲーション

1. 50 μLのレシピエント細胞と50μLのドナー細胞をマイクロ遠心管に組み合わせ、ピペッティングで混合します。
2. 細胞混合物を37°Cで1時間インキュベートします。これは次のめっきステップの前および間に共役の効率を高める。
3. セル混合物のピペット100 μLを1X Tetおよび0.3 mM DAPの寒天板上に置いた。皿の上に広がらないで下さい。
4. 1X Tetおよび0.3 mM DAPを用いて寒天プレート上にレシピエント細胞培養のピペット100 μL。皿の上に広がらないで下さい。
5. 両方のプレートを37°Cで一晩インキュベートします。
6. 生殖細胞スクレーパーで共役細胞混合物とレシピエント細胞培養を掻き取る。無菌マイクロ遠心チューブに細胞を移し、PBSの1 mLで細胞を再懸濁する。
7. 細胞を渦にし、穏やかにスピンダウンします(~3000 rpm 5分間)。
8. PBSの1 mLで細胞を再中断する。
9. 1Xアンプ/テットのみでLB寒天プレート上のコンジュゲーション反応細胞混合物をプレートします。このプレートでは、結合によってアンプ耐性遺伝子を獲得したレシピエント菌のみが増殖することが期待されます。
10. レシピエントセルをLB寒天プレートに1X Tetのみでプレートします。このプレートでは、アンプ耐性遺伝子を持たない未結合レシピエント細菌のみが増殖することが期待されます。
11. プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
12. 両方のプレートから単一のコロニーを選択し、メディアの5 mL(220 rpmで通気で37°C)で一晩培養を成長させるためにそれらを使用します。

4. DNA分離

1. DNAミニプレップにより総培養量の4.5mLを用いて、以前に調製した培養物からDNAを分離する。
2. これを行うには、ヌクレアーゼフリー水の35 μLを使用してDNAを溶出します。
3. 純DNAは約1.8の吸光度比(A_260/280)を生成します。
4. 各培養の残りの0.5 mLを使用して、細菌培養と100%グリセロールの1:1混合物を作ることによってグリセロールストックを調製します。
5. 冷凍庫の在庫は-80 °C.

5. PCRによるプラスミド転写の確認

1. 2つのPCRマスターミックスを準備し、それぞれが異なる前方プライマーとリバースプライマーのセットを持ち、1つはアンピシリン耐性遺伝子内の500塩基セグメントを標的とし、もう1つはハウスキーピング遺伝子内のセグメントを標的とする。
   1. ハウスキーピング遺伝子プライマーは、DNAジャイラゼB(14)をコードする細菌遺伝子内のDNAのセグメントを増幅するように設計された。
   2. 以下の試薬量を使用して、各マスターミックスの90 μLを調作しました。
      10 μM 前方プライマーの 7.5 μL
      10 μM 逆プライマーの 7.5 μL
      2X PCRマスターミックスの75 μL
2. 15 μLマスターミックス、10ngのテンプレートDNA、および25 μLの最終容積までのヌクレアーゼフリー水を使用して、以下の6つのPCR反応を調製します。
   共役反応DNAとアンピシリンプライマー
   コンジュゲーション反応DNAとハウスキーピングプライマー
   陰性制御DNAとアンピシリンプライマー
   陰性制御DNAとハウスキーピングプライマー
   DNAとアンピシリンプライマーなし
   DNAとハウスキーピングプライマーなし
3. ブロックを98°Cに予熱したPCRマシンにこれらの反応を転送し、次の条件下でサーモサイクリングを開始します。
   98 °C 30 秒
   98 °C の 25 ~ 35 サイクル(5~10 秒)、10 ~ 30 秒の 45 ~72 °C、および 1 kb あたり 15 ~ 30 秒の 72 °C
   72 °C 5-10分
   4 °Cでホールド
4. 6つのPCR反応をすべて1%のアガロースゲルにロードし、約20分間〜150Vで実行します。
5. UVイルミレータを使用してPC製品を視覚化します。