結合:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に移す方法
ソース: アレクサンダー S. ゴールド1, トーニャ M. コルピッツ1
1ボストン大学医学部微生物学科、国立新興感染症研究所、ボストン、マサチューセッツ州
1946年にレダーバーグとテイタムによって最初に発見された共役は、2つの細菌細胞間の直接的な物理的接触に依存する細菌間の水平遺伝子伝達の一形態…
1. セットアップ
- ルリア・ベルタニ培地(LB)のオートクレーブ約1L。この無菌LBは、0.3mMジアミノピメル酸(DAP)を含むLBの約5mLを作るために使用されます。
- 次のプレートを収集する:1Xテトと0.3 mM DAPのLB寒天プレート、1XテトのみのLB寒天プレート、および1Xアンプ/テットのみのLB寒天プレート。
- いくつかのグリセロールと殺菌前のプラスチックピペットの先端の箱が手元に近いであることを確認してください。
- 微生物を含む任意の作業を開始する前に、70%のエタノールでワークスペースを殺菌します。ラボコートや手袋など、必要な個人用保護具は必ず着用してください。
- 終了後、70%のエタノールですべての表面と手袋を殺菌し、手を洗います。
2. ドナーおよびレシピエント株の調製
- ドナーおよびレシピエント株の5mL細菌培養物を調作し、通気と220rpmで振盪して37°Cで一晩成長させる。ドナー株は0.3 mM DAPでLBで成長する必要があります。
- 両方の培養物の1 mL(5分間〜3000 rpm)をスピンダウンし、PBSで細胞を洗浄します。
- リン酸緩衝生理食生の500 μLで細胞を再中断する(PBS)。
3. コンジュゲーション
- 50 μLのレシピエント細胞と50μLのドナー細胞をマイクロ遠心管に組み合わせ、ピペッティングで混合します。
- 細胞混合物を37°Cで1時間インキュベートします。これは次のめっきステップの前および間に共役の効率を高める。
- セル混合物のピペット100 μLを1X Tetおよび0.3 mM DAPの寒天板上に置いた。皿の上に広がらないで下さい。
- 1X Tetおよび0.3 mM DAPを用いて寒天プレート上にレシピエント細胞培養のピペット100 μL。皿の上に広がらないで下さい。
- 両方のプレートを37°Cで一晩インキュベートします。
- 生殖細胞スクレーパーで共役細胞混合物とレシピエント細胞培養を掻き取る。無菌マイクロ遠心チューブに細胞を移し、PBSの1 mLで細胞を再懸濁する。
- 細胞を渦にし、穏やかにスピンダウンします(~3000 rpm 5分間)。
- PBSの1 mLで細胞を再中断する。
- 1Xアンプ/テットのみでLB寒天プレート上のコンジュゲーション反応細胞混合物をプレートします。このプレートでは、結合によってアンプ耐性遺伝子を獲得したレシピエント菌のみが増殖することが期待されます。
- レシピエントセルをLB寒天プレートに1X Tetのみでプレートします。このプレートでは、アンプ耐性遺伝子を持たない未結合レシピエント細菌のみが増殖することが期待されます。
- プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
- 両方のプレートから単一のコロニーを選択し、メディアの5 mL(220 rpmで通気で37°C)で一晩培養を成長させるためにそれらを使用します。
4. DNA分離
- DNAミニプレップにより総培養量の4.5mLを用いて、以前に調製した培養物からDNAを分離する。
- これを行うには、ヌクレアーゼフリー水の35 μLを使用してDNAを溶出します。
- 純DNAは約1.8の吸光度比(A260/280)を生成します。
- 各培養の残りの0.5 mLを使用して、細菌培養と100%グリセロールの1:1混合物を作ることによってグリセロールストックを調製します。
- 冷凍庫の在庫は-80 °C.
5. PCRによるプラスミド転写の確認
- 2つのPCRマスターミックスを準備し、それぞれが異なる前方プライマーとリバースプライマーのセットを持ち、1つはアンピシリン耐性遺伝子内の500塩基セグメントを標的とし、もう1つはハウスキーピング遺伝子内のセグメントを標的とする。
- ハウスキーピング遺伝子プライマーは、DNAジャイラゼB(14)をコードする細菌遺伝子内のDNAのセグメントを増幅するように設計された。
- 以下の試薬量を使用して、各マスターミックスの90 μLを調作しました。
10 μM 前方プライマーの 7.5 μL
10 μM 逆プライマーの 7.5 μL
2X PCRマスターミックスの75 μL
- 15 μLマスターミックス、10ngのテンプレートDNA、および25 μLの最終容積までのヌクレアーゼフリー水を使用して、以下の6つのPCR反応を調製します。
共役反応DNAとアンピシリンプライマー
コンジュゲーション反応DNAとハウスキーピングプライマー
陰性制御DNAとアンピシリンプライマー
陰性制御DNAとハウスキーピングプライマー
DNAとアンピシリンプライマーなし
DNAとハウスキーピングプライマーなし - ブロックを98°Cに予熱したPCRマシンにこれらの反応を転送し、次の条件下でサーモサイクリングを開始します。
98 °C 30 秒
98 °C の 25 ~ 35 サイクル(5~10 秒)、10 ~ 30 秒の 45 ~72 °C、および 1 kb あたり 15 ~ 30 秒の 72 °C
72 °C 5-10分
4 °Cでホールド - 6つのPCR反応をすべて1%のアガロースゲルにロードし、約20分間〜150Vで実行します。
- UVイルミレータを使用してPC製品を視覚化します。
大腸菌などの細菌細胞は、細胞から細胞へ遺伝情報を伝達することができます。コンジュゲーションは、形質導入や形質転換などの他のDNA導入メカニズムとは異なり、細胞間の物理的な接触を必要とします。
結合を進めるには、受精能(F因子)を発現するドナー細胞と、それを持たないレシピエント細胞(Fマイナス細胞)が必要です。このプロセスには 2 つの手順が必要です。1つ目は、細胞間直接の接触の確立です。これを行うために、ドナー細胞は性線毛と呼ばれる細胞外糸状構造を生成します。抱合は無性生殖細菌の交配の一形態であるため、これと名付けられていますが、配偶子が交換されず、子孫が形成されないため、真の有性生殖ではないことに注意する必要があります。
2番目のステップは、レシピエント細胞へのDNAの送達です。性線路が2つの細胞間の接触を確立した後、IV型分泌システムと呼ばれる導管が構築され、DNAの移植が可能になります。その後、ドナー細胞は、OriTまたは転写起源として知られる遺伝要素の存在に基づいて選択されて移植される染色体外DNAの複製を開始します。新たに複製されたDNAの一端は、DNAタンパク質結合を介して導管にねじ込まれます。DNAがさらに複製されると、OriTの近くに位置する遺伝子によってコードされるタンパク質の複合体によって促進され、チャネルを介してポンプで送られます。DNAが完全に転写されると、DNAは追加の染色体プラスミドを形成するか、レシピエント細胞の染色体に組み込まれる可能性があります。転送されたDNAのエンドポイントがいずれであっても、それがコードする遺伝子が発現されます。この遺伝子発現は、成功した標識を確認するために使用できます。
例えば、ドナー株がアンピシリン耐性を発現し、これを結合DNAでレシピエント細菌に伝えるが、レシピエント株はドナーには存在しないテトラサイクリン耐性遺伝子も持っているというシナリオを考えてみます。この場合、テトラサイクリンとアンピシリンの両方を含むLB培地に細胞を播種すると、コロニーは、両方の耐性表現型を発現する成功した結合細菌からのみ増殖するはずです。結合の成功をさらに確認するために、これらのコロニーからプラスミドDNAを回収し、転写されたプラスミドに特異的なDNAの一部をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅することができます。PCR産物を標準サイズのラダーと一緒に電気泳動ゲル上で分析すると、既知のサイズのPCRフラグメントがゲル上に見えるはずであり、標識の成功がさらに確認されます。この実験では、プラスミドを使用して、ドナー株からテトラサイクリン耐性レシピエント株に結合を介してアンピシリン耐性遺伝子を移行します。この後、標識を確認するために、標識混合物を両方の抗生物質を含むプレート上でインキュベートし、形質転換した細菌のみを残します。最後に、成功した標識はPCRでさらに確認されます。
手順を開始する前に、白衣や手袋などの適切な個人用保護具を着用してください。次に、70%エタノールを使用してワークスペースを滅菌し、表面を拭き取ります。
この手順では、アンピシリン耐性遺伝子を大腸菌のWM3064株から大腸菌のJ53株に結合を介して移行します。ドナー株WM3064はテトラサイクリンとアンピシリンに耐性があり、成長にはジアミノピメリン酸(DAP)が必要です。レシピエント株J53はテトラサイクリンにのみ耐性があり、増殖にDAPは必要ありません。これは、うまく結合した細胞は、テトラサイクリンとアンピシリンに耐性があり、DAPなしで増殖できる必要があることを意味します。
0.3ミリモルのDAPを含む5ミリリットルのLBに凍結ドナー株グリセロールストックのスクラップを接種することにより、ドナー株培養物を調製します。次に、DAPを含まない5ミリリットルのLBブロスに凍結レシピエント株のグリセロールストックのスクラップを接種することにより、レシピエント株を調製します。これらの培養物を、振とうインキュベーターで220RPMのエアレーションと振とうを行いながら、摂氏37度で一晩成長させます。培養物がOD 600 of twoに成長したら、それぞれから1ミリリットルの培養物を取り出し、これを2つの新しい別々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。次に、これらのアリコートを3000 RPMで5分間遠心分離し、細菌細胞をペレット化します。上清を捨て、各ペレットを250マイクロリットルの1X PBSで洗浄します。サンプルを再度遠心分離し、上清を捨てた後、各ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
標識の手技を開始するには、まず1.5ミリリットルの微量遠心チューブに50マイクロリットルのレシピエント細胞と50マイクロリットルのドナー細胞を結合し、ピペッティングで優しく上下させて混合します。次に、レシピエント細胞培養物の100マイクロリットルをDAPを含む別の1Xテトラサイクリンプレートにピペットで移します。次に、100 μリットルのレシピエント細胞培養物のみをDAPを含む非選択的寒天プレート上にピペッティングして、ネガティブコントロールを調製します。次に、コンジュゲーションプレートとネガティブコントロールプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日、滅菌細胞スクレーパーを取り、コロニーを収集して標識プレートから細胞を回収します。次に、コロニーを1ミリリットルの1X PBSを含む滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。このプロセスを繰り返して、他のプレートからレシピエントセルを収集します。
この後、サンプルをボルテックスして混合します。混合後、チューブを遠心分離機に移し、細胞を穏やかにペレット化します。上清を捨ててから、細胞ペレットを1ミリリットルのPBSで洗浄し、チューブをボルテックスして細胞を再懸濁します。遠心分離機により細胞を再度ペレット化します。上清を再度捨て、両方の細胞ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。次に、滅菌ピペットチップを使用して、100マイクロリットルの標識反応細胞混合物を、1Xテトラサイクリンと1Xアンピシリンを含むDAPを含まないLB寒天プレートにプレートします。PBS中の同じ細胞混合物を10倍に希釈した100マイクロリットルを、1Xテトラサイクリンおよび1Xアンピシリンを含むDAPを含まない別のLB寒天プレートに使用して、プレーティング法を繰り返します。
最後に、ネガティブコントロール細胞混合物100マイクロリットルを、1Xテトラサイクリンのみを含む単一のLB寒天プレートにピペットで移します。摂氏37度で一晩インキュベートした後、コロニーが見えるはずです。滅菌ピペットチップを使用して、標識反応プレートから1つのコロニーを取り出し、両方の抗生物質を含む5ミリリットルの選択的LB培地を含むチューブに加えます。次に、レシピエント細胞プレートから単一のコロニーを選択してコロニーの単離を繰り返します。これらの培養物を摂氏37度で一晩成長させ、220RPMで曝気します。
翌日、ベンチトップを70%エタノールで拭き取り、プレートをインキュベーターから取り出します。DNAミニ調製キットを使用して、4からDNAを単離します。製造元の指示に従って、各文化の5ミリリットル。DNAミニ調製が完了したら、35マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を使用してDNAを溶出します。最後に、残りの 0 を使用します。各培養物の5ミリリットルを調製し、100%グリセロールの0.5ミリリットルを1対1の希釈液として添加することにより、1ミリリットルのグリセリンストックを調製する。これらのアリコートを摂氏マイナス80度に置いて、必要になるまで保管します。
PCRによる標識の成功を確認するには、まず、75マイクロリットルの2X PCRマスターミックスを微量遠心チューブに添加してPCRマスターミックスを調製します。次に、プラスミドからアンピシリン耐性遺伝子を増幅するように設計された10マイクロモルのフォワードプライマーと10マイクロモルのリバースプライマーをそれぞれ7.5マイクロリットル加えます。次に、75マイクロリットルの2X PCRマスターミックスを微量遠心チューブに添加し、次にハウスキーピング遺伝子(この場合はDNAジャイレースB)を増幅するように設計された10マイクロモルのフォワードプライマーと10マイクロモルのリバースプライマーをそれぞれ7.5マイクロリットル加えることにより、2番目のPCRマスターミックスを調製します。
次に、最初のマスターミックスを15マイクロリットルをPCRチューブに加え、次に10ナノグラム、約2マイクロリットルのテンプレート実験DNAを同じチューブに加えます。ヌクレアーゼフリーの水で反応を最終容量25マイクロリットルまで上げます。これらの手順を繰り返して残りの5つの反応を生成し、チューブにここに示す成分が含まれるようにします。次に、これらの反応をブロックを摂氏98度に予熱したサーモサイクラーに移し、プログラムを開始します。PCRが完了したら、チューブを機械から取り外します。次いで、各反応の2マイクロリットルを、2マイクロリットルのローディング色素および4マイクロリットルの分子量マーカーと混合して、1%アガロースゲルの連続ウェルにロードする。ゲルを150ボルトで20分間動作するように設定します。最後に、UVイルミネーターを使用してゲルを視覚化します。
この実験では、結合によるアンピシリン耐性遺伝子の成功した導入がPCRによって確認されました。ここでは、結合DNAとアンピシリンプライマー(この例ではウェル2)を含むウェルで、約500塩基対のサイズのバンドが観察されます。ハウスキーピング遺伝子であるDNAジャイレースBを、それぞれ結合DNAとレシピエント細胞DNAとともにウェル3と5にロードしました。これらのウェルで観察されたバンドは、DNAテンプレートが存在し、PCRが成功したことを確認するためのポジティブコントロールとして機能します。レシピエント細胞DNAとアンピシリンプライマーペア(この例ではウェル4)の反応を含むウェルでは、レシピエント細胞はアンピシリン耐性ではないため、バンドは観察されません。さらに、テンプレートDNAを欠く反応(ここではウェル6と7)にバンドは観察されません。これらの条件が満たされると、アンピシリン耐性遺伝子の成功した移行が確認され、大腸菌のWM3064株から大腸菌のJ53株へのアンピシリン耐性が付与されます。
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Q1: What is the sex pilus and what role does it play in bacterial conjugation?
The sex pilus is an extracellular filamentous structure generated by the donor cell to establish direct cell-to-cell contact with the recipient cell. This physical contact is essential for conjugation to proceed. The sex pilus is encoded by the F (fertility) factor and serves as the initial bridge between donor and recipient cells before DNA transfer begins.
Q2: How does the Type IV secretion system facilitate DNA transfer during conjugation?
After the sex pilus establishes contact, a conduit called the Type IV secretion system is built between the two cells. This multiprotein complex allows DNA to be actively transported from the donor to the recipient. The system works with coupling proteins to pump replicated DNA through the channel, enabling the transfer of genetic material encoding traits like ampicillin resistance.
Q3: Why is selective plating used to confirm successful conjugation in this experiment?
Selective plating uses antibiotics to isolate only successfully conjugated cells. The donor strain requires diaminopimelic acid (DAP) to survive, while the recipient lacks ampicillin resistance. Plating on media with both tetracycline and ampicillin without DAP eliminates donor cells and non-conjugated recipients, leaving only recipient cells that acquired ampicillin resistance through conjugation.
Q4: What is the origin of transfer (OriT) and why is it important for conjugation?
The origin of transfer (OriT) is a genetic element on the plasmid that signals where DNA replication and transfer should begin. A relaxase enzyme cleaves at the nic site within the OriT sequence and covalently attaches to the DNA strand, initiating the formation of the relaxosome complex. This complex is essential for directing which DNA gets replicated and transferred to the recipient cell.
Q5: How does PCR confirm the successful transfer of ampicillin resistance genes?
PCR amplifies a specific DNA sequence from the transferred plasmid using primers designed for the ampicillin resistance gene. Successfully conjugated cells contain this gene and produce a visible band of known size on an agarose gel. A housekeeping gene serves as a positive control, while recipient-only DNA should show no amplification, confirming the resistance gene was successfully transferred.
Q6: How does conjugation differ from other bacterial DNA transfer mechanisms?
Conjugation requires direct physical contact between donor and recipient cells through the sex pilus, unlike transduction or transformation. It is unidirectional, with DNA flowing from donor to recipient, and naturally occurs in bacteria. This process has contributed to the spread of antibiotic resistance and can be manipulated in laboratory settings using selective pressures for horizontal gene transfer.
Q7: What happens to transferred DNA once it enters the recipient cell?
Once transferred, the DNA can either form an extrachromosomal plasmid or integrate into the recipient cell's chromosome. Regardless of its final location, the genes encoded on the transferred DNA are then expressed in the recipient cell. This gene expression produces the new phenotype, such as ampicillin resistance, which can be detected through selective plating or PCR analysis.