ファージトランスダクション:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に伝達する方法
ソース: アレクサンダー S. ゴールド1, トーニャ M. コルピッツ1
1ボストン大学医学部微生物学科、国立新興感染症研究所、ボストン、マサチューセッツ州
トランスダクションは、バクテリオファージ(ファージ)を利用する細菌間の遺伝的交換の一形態であり、原核生物に排他的に感染するウイルスのクラスであ…
1. セットアップ
- 微生物を含む任意の作業を開始する前に、70%エタノールを使用してワークスペースを殺菌します。常に必要なPPE(ラボコートと手袋)を使用してください。
- 1xアンピシリンを含むLB寒天プレート、市販のP1ファージ溶解液、クロロホルム、1Mクエン酸ナトリウム、グリセロール、および殺菌前のプラスチックピペットチップとセル拡散機の箱が近くにあることを確認してください。
- オートクレーブによって滅菌LBを準備し、LB塩溶液の3つの1 mLアリコートを作るためにそれを使用します。
- mM MgCl2 (952.11-2.3803 μg), 5 mM CaCl2 (11.098 mg), 0.1-0.2% ブドウ糖 (100-200 μg)
- mM MgSO4 (12.0366 mg), 5 mM CaCl2 (11.098 mg)
- mM ク硝酸ナトリウム (25.806 mg)
- 完成したら、70%のエタノールで手袋と同様に、すべての表面を殺菌し、手を洗います。
2. プロトコル
- ドナーファージリサート製剤
- LBでドナーW3110株大腸菌の1mL培養を37°Cで一晩増殖させ、220rpmで振盪を起こす。
- この一晩培養 1:100 を 1 mL の新鮮な LB 1 mL で希釈し、10-25 mM MgCl2、5mM CaCl2、および 0.1-0.2% グルコースを補充した。
- この細菌希釈を37°Cで2時間、通気と220rpmで振ります。
- これらの細胞が早期対数成長期(顕著な成長とわずかな濁り)に達したら、市販のP1ファージの40 μLを追加し、通気と220rpmで振って37°Cで残します。
- ファージ添加の前に、これらの細胞の600nmで測定された光学密度は、約0.4(6)でなければなりません。
- 培養がリズするまで1~3時間細胞を監視します。
- Lysisは、細胞の破片の増加だけでなく、濁度の顕著な減少をもたらす(すなわち、細胞は、培養を通して見ることができたら、細胞がlyslysと見なされます)。
- 塩分にクロロホルムの数滴(50-100 μL)を加え、渦で混合します。
- クロロホルムは、残りのドナー細胞を殺すことによってファージリサートを殺菌し、ファージだけを残し、このリサートのツチエーターを増加させる。
- 遠心分離機は2分間14,000rpmでライサートし、破片を除去し、上清を新鮮なチューブに移します。
- クロロホルムを数滴加え、1日以上4°Cに保存します。
- 伝達
- レシピエントJ53株大腸菌の1mL培養を37°CでLBで一晩成長させ、220rpmで通気および振盪を行う。
- ドナーファージライザート(2.1)の100 μLを1.5mLマイクロフュージチューブに移し、キャップを37°Cで30分間開けてインキュベートします。
- このインキュベーションは、P1溶解液中の残りのクロロホルムをレシピエント細胞に添加する前に蒸発することを可能にする。
- 6,000rpmで5分間遠心分離によるペレットレシピエント株細胞。
- 100 mM MgSO4および 5 mM CaCl2を含む新鮮な LB の 300 μL でこれらの細胞を再中断します。(P1ファージは、感染するカルシウムを必要とします)。
- レシピエント細菌細胞を用いて2つの反応を設定し、ドナーファージライセートを調製:1)100μLレシピエントJ53株大腸菌と100μLドナーファージリサートを組み合わせた経度反応、および2)100μLレシピエントJ53株を組み合わせた陰性対照大腸菌および100 mM MgSO4および5 mM CaCl2を含有するLBの100 μL。
- 37°Cで30分間インキュベートし、220rpmで振ります。
- 1 mL LB および 200 μL 1M クエン酸ナトリウム (pH=5.5) を追加し、220 rpm で振盪を起こす 37 °C で 1 時間インキュベートします。
- クレートは、カルシウムでキレートすることによりP1の感染率を減少させるために使用され、レシピエント細菌のリシスを防止する。
- この溶液のインキュベーションは、アンピシリン耐性マーカーの発現を可能にする。
- ペレット細胞を6,000rpmで5分間遠心分離する。
- 100 mMクエン酸ナトリウム(pH 5.5)でLBの100 μLで細胞ペレットを再ステースします。2つのLB寒天プレート上の両方の反応のための渦およびプレート全体の溶液。
- LBプレートは、変換されたサンプルに対して1xアンペアを持ち、負のコントロールにはアンプを持たない必要があります。
- このプレート上のP1ファージ汚染は、冷凍庫の在庫を準備する前に再ストリークを必要とします。
- ファージを除去しない場合、これらのコロニーから成長した培養物は、カルシウムキレートの存在下でなければ成長しません。
- 両方のプレートから約3-4コロニーを選び、クエン酸ナトリウム100μL(pH=5.5)で広がる2つのLB寒天プレートに再びストリークします。
- LBプレートは、変換されたサンプルに対して1xアンペアを持ち、負のコントロールにはアンプを持たない必要があります。
- 一晩37°Cでプレートをインキュベートし、ファージを含まないコロニーが成長できるようにします。
- 両方のプレートからコロニーを選び、37°CでLBの5 mLで一晩培養し、通気と220rpmで振ります。
- 総培養量の4.5mLを用いてDNAミニプレップによりこれらの培養物からDNAを分離する。
- ヌクレアーゼフリー水の35μLを用いて溶出DNA。
- ナノドロップで得られた濃度を測定します。純DNAは約1.8の吸光度比(A260/280)を生成します。
- 各培養の残りの0.5 mLを使用して、100%グリセロールと細菌培養の1:1混合物を作ることによって1 mLグリセロールストックを調製します。
- 細菌のグリセロールストックを-80 °Cで保存します。
3. データ分析と結果
- qPCRによるトランスダクションの確認
- 6つのqPCR反応に対して2つのqPCRマスターミックスを準備し、3つはアンピシリン耐性遺伝子にqPCRプライマーを使用し、他の3つはハウスキーピング遺伝子にqPCRプライマーを使用します(反応あたり14.5 μL):12.5 μL qPCRバッファミックス+1μLフォワードプライマー+1μLリバースプライマー。
- この実験では、SYBRグリーンマスターミックスを用いて使用した。
- ハウスキーピング遺伝子プライマーは、DNAジャイラゼB(7)をコードする細菌遺伝子内のDNAのセグメントを増幅するように設計された。
- 各qPCR反応について、各反応(10.5 μL)のDNAの100 μgと14.5 μLのqPCRマスターミックスを組み合わせます。
- 表1に記載されているqPCRマシンとサーモサイクリングプロトコルを用いて、6つの反応すべてに対するアンピシリン耐性およびハウスキーピング遺伝子の増幅を測定した。
- qPCRによって生成されたCq値は、アンピシリン耐性遺伝子の正規化されたトランスダクション効率を計算するために使用され(図3)、アンピシリン耐性遺伝子の転写に成功したことを確認した。
- サンプルのCq値(サイクル定量値)は、信号がバックグラウンドしきい値を超えた最も早いPCRサイクル番号です。低い Cq 値は、より多くのターゲット シーケンスに対応しますが、その逆も同様です。
- サンプル内の遺伝子の正規化されたトランスダクション効率は、これらのCq値を使用して、標的遺伝子の値からハウスキーピング遺伝子の値を引くことによって計算することができ、正規化されたトランスダクションの計算に使用できるΔCq値を生成する。効率 2(-ΔCq)
- 6つのqPCR反応に対して2つのqPCRマスターミックスを準備し、3つはアンピシリン耐性遺伝子にqPCRプライマーを使用し、他の3つはハウスキーピング遺伝子にqPCRプライマーを使用します(反応あたり14.5 μL):12.5 μL qPCRバッファミックス+1μLフォワードプライマー+1μLリバースプライマー。
| 温度 | 時間 | |
| 変性 | 94 °C | 2 分 |
| 40サイクル: | ||
| 変性 | 94 °C | 15秒 |
| アニーリング、延長、蛍光読み取り | 最低プライマーTm以下60 °Cまたは5 °C | 1 分 |
表 1: qPCR サーモサイクリング プロトコル
細菌は遺伝物質を交換することで急速に変化する環境に迅速に適応することができ、その方法の一つが、細菌ウイルスが媒介する遺伝物質の交換である形質導入です。バクテリオファージは、しばしばファージと略され、最初に宿主の表面に付着し、次にそのDNAを細菌細胞に注入することによって細菌に感染するウイルスの一種です。次に、宿主細胞自身のDNAを分解し、ウイルスゲノムを複製すると同時に、細胞の機構を乗っ取ってタンパク質の多くのコピーを合成します。次に、これらのファージタンパク質は自己組織化してファージゲノムをパッケージ化し、複数の子孫を形成します。しかし、DNAパッケージングメカニズムの忠実度が低いため、時折、ファージが細菌DNAの断片をファージキャプシドにパッケージ化することがあります。宿主の溶解を誘導した後、ファージの子孫が放出され、そのようなファージが別の宿主細胞に感染すると、それは前の宿主のDNA断片を移します。その後、これは組み換えて新しい宿主の染色体に恒久的に組み込まれ、それによって2つの細菌間の遺伝子導入を仲介することができます。
研究室でファージ形質導入を行うには、目的の遺伝子を含むドナー株、それを欠くレシピエント株、両方の株に感染できるファージ、および形質導入細菌を選択する方法が必要です。ほとんどの場合、これは形質導入された細菌の増殖をサポートする選択的な固体増殖培地ですが、形質導入されていない細菌の増殖を阻害します。まず、目的の遺伝子を含むドナー株を液体増殖培地で培養します。すべての細菌が成長の対数期で活発に分裂しているとき、培養物に標的ファージを接種します。インキュベーションの3〜4時間後、ほぼすべての細菌が溶解してファージ粒子を放出したとき、ドナーファージ溶解物は、レシピエント細菌株の新たに成長した培養物に接種されます。1時間の短いインキュベーションの後、培養物には形質導入された細菌細胞と形質導入されていない細菌細胞の混合物が含まれているはずであり、これは、懸濁液の一部を適切な選択的固体増殖培地に広げることによって形質導入細胞についてスクリーニングされます。さらにインキュベートすると、形質導入された細胞は増殖し、増殖して目に見えるコロニーを生成するはずです。これらのコロニーは、コロニーPCR、DNAシーケンシング、定量PCRなど、形質導入の成功をさらに確認するためのさまざまな方法を使用して、さらなる分析のために選択することができます。
手順を開始する前に、白衣や手袋など、適切な個人用保護具を着用してください。次に、ワークスペースを70%エタノールで滅菌し、表面を拭き取ります。
この後、LB塩溶液の3つの1ミリリットルアリコートを準備します。次に、500マイクログラムのアンピシリンを含む5ミリリットルのLB増殖培地を含む15ミリリットルのコニカルバイアルに100マイクロリットルの大腸菌を追加して、ドナー株培養物を準備します。次に、220rpmで曝気と振とうを行いながら、摂氏37度で一晩培養します。翌日、ベンチトップを70%エタノールで拭いてから、振とうのあるインキュベーターから培養物を取り出します。次に、塩溶液を添加した990マイクロリットルの新鮮なLBに10マイクロリットルのドナー株を加えて、一晩培養物を100に希釈します。
細菌の希釈液を摂氏37度で2時間増殖させ、通気して220rpmで振とうします。細胞が早期の対数期に達したら、培養物をインキュベーターから取り出し、40マイクロリットルのP1ファージを培養物に加えて、再度インキュベートします。培養物が溶解するまで、1〜3時間細胞をモニターし続けます。次に、ライセートに50〜100マイクロリットルのクロロホルムを加え、ボルテックスして混合します。次に、ライセートを遠心分離して破片を取り除き、上清を新しいチューブに移します。上清に数滴のクロロホルムを加え、摂氏4度で1日以内保存します。
形質導入手順を開始するには、レシピエント株の1ミリリットルの培養物を入手します。次に、100マイクロリットルのドナーファージ溶解物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、キャップを開けた状態で摂氏37度で30分間インキュベートし、残っているクロロホルムを蒸発させます。ドナーファージライセートがインキュベートしている間に、穏やかな遠心分離によりレシピエント株細胞をペレット化します。上清を捨て、100ミリモルの硫酸マグネシウムと5ミリモルの塩化カルシウムを含む300マイクロリットルの新鮮なLBに細胞ペレットを再懸濁します。
次に、レシピエント株100マイクロリットルとドナーファージライセート100マイクロリットルを微量遠心チューブに組み合わせて形質導入反応を設定します。次に、100マイクロリットルのレシピエント株と100マイクロリットルのLBを硫酸マグネシウムと塩化カルシウムと組み合わせてネガティブコントロールを設定します。インキュベーション後、200マイクロリットルの1モルクエン酸ナトリウムと1ミリリットルのLBを両方のチューブに加え、ピペッティングで穏やかに上下させて混合します。次に、チューブを1時間インキュベートした後、遠心分離により細胞を穏やかにペレット化します。
遠心分離後、上清を廃棄し、ペレット化した細胞を100ミリモルのクエン酸ナトリウムを含む100マイクロリットルのLBに再懸濁します。溶液をボルテックスし、形質導入したサンプル全体を1X ampicillinを入れたLB寒天プレートにピペットで移します。最後に、ネガティブコントロール細胞混合物の全容量をアンピシリンを含まないLB寒天プレートにピペットで移します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートした後、滅菌ピペットチップを使用して形質導入プレートから3〜4個のコロニーをピックアップし、1Xアンピシリンと1モルクエン酸ナトリウム100マイクロリットルを含む新しいLB寒天プレートにそれらをストリークします。1モルクエン酸ナトリウムを100マイクロリットルしか含まない別のLB寒天プレートのネガティブコントロールについて、このめっき方法を繰り返します。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートして、ファージのないコロニーが成長できるようにします。
翌日、インキュベーターからプレートを取り外す前に、ベンチトップを70%エタノールで拭きます。滅菌ピペットチップを使用して、形質導入プレートから3つのコロニーを取り出し、それぞれを5ミリリットルのLB培地を含む別々のチューブに加えます。次に、ネガティブコントロールプレートから3つのコロニーを選択し、それらを5ミリリットルのLB培地を含む別のチューブに加えます。220rpmで曝気し、振とうを行いながら、摂氏37度で一晩培養します。前述のようにベンチトップを滅菌した後、DNAミニプレップキットを使用して、製造元の指示に従って各培養物の4.5ミリリットルからDNAを単離します。次に、35マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でDNAを溶出し、実験室の分光光度計で得られた濃度を測定します。最後に、残りの0.5ミリリットルの両細菌溶液を0.5ミリリットルの100%グリセロールに添加して、グリセロールストックを調製します。
形質導入を確認するには、まず24回のqPCR反応に対して2つのqPCRマスターミックスを調製します。最初のマスターミックスでは、150マイクロリットルのqPCRバッファーミックスを微量遠心チューブに加え、アンピシリン耐性遺伝子を増幅するように設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ12マイクロリットル加えます。次に、150マイクロリットルのqPCRマスターミックスを微量遠心チューブに添加し、次にハウスキーピング遺伝子を増幅するように設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ12マイクロリットル追加して、2番目のqPCRマスターミックスを調製します。
各qPCR反応について、各反応から得られた100マイクログラムの実験DNAと14.5マイクロリットルのqPCRマスターミックスを組み合わせます。次に、前に示したように残りの反応を準備します。反応を摂氏94度に予熱したサーモサイクラーに移し、プログラムを開始します。最後に、qPCRによって生成されたサイクル定量(Cq)値を使用して、アンピシリン耐性遺伝子の正規化された形質導入効率を計算します。
目的遺伝子のサイクル定量(Cq)値を、ネガティブコントロールおよび形質導入サンプルのそれぞれについて表にしました。この例の形質導入サンプルのように、通常は29サイクル未満の低いCq値は、ターゲット配列の量が多いことを示しています。
ハウスキーピング遺伝子は、ここでも表に示されていますが、各反応のDNA量を正常化するためのローディングコントロールとして、またqPCRが機能していることを確認するためのポジティブコントロールとして使用されます。同量のハウスキーピング遺伝子がロードされている場合、各サンプルで比較的同じ速度で見つかります。
次に、各サンプルのデルタCq値を計算するために、対応するターゲット遺伝子のCq値から各サンプルのハウスキーピング遺伝子のCq値を減算します。たとえば、最初のネガティブコントロールのデルタCqは13.54です。次に、この値を使用して、ここに示す式を使用して各サンプルの正規化された形質導入効率を計算します。最後に、各サンプルグループの平均正規化形質導入効率を計算できます。
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Q1: How does a bacteriophage transfer DNA between bacterial cells?
A bacteriophage attaches to a bacterial cell surface and injects its DNA, then replicates its genome while hijacking the host's machinery. Due to low-fidelity DNA packaging, the phage occasionally packages bacterial DNA fragments into its capsid. When this phage infects another cell, it transfers the bacterial DNA, which can recombine and integrate into the new host's chromosome, mediating gene transfer between bacteria.
Q2: What are the key requirements for performing phage transduction in the laboratory?
Phage transduction requires a donor strain containing the gene of interest, a recipient strain lacking it, a phage capable of infecting both strains, and a selective growth media that supports transduced bacteria while inhibiting non-transduced ones. The selective media is essential for screening and identifying which bacterial cells successfully received the transferred genetic material.
Q3: Why is chloroform added to the phage lysate during preparation?
Chloroform is added to the phage lysate to inhibit bacterial growth and preserve the phage particles. After centrifugation removes debris, the supernatant containing phage is treated with chloroform and stored at four degrees Celsius for no more than one day, ensuring the phage remains viable for the transduction procedure.
Q4: What role do magnesium sulfate and calcium chloride play in transduction?
Magnesium sulfate and calcium chloride are added to the recipient strain suspension to enhance phage attachment and DNA transfer efficiency. These divalent cations stabilize the phage-bacterial cell interaction, increasing the likelihood of successful transduction by promoting optimal conditions for DNA uptake by recipient cells.
Q5: How does qPCR confirm successful transduction of the ampicillin resistance gene?
qPCR measures cycle quantification (Cq) values for the ampicillin resistance gene and a housekeeping gene. Low Cq values below 29 cycles indicate high target sequence amounts in transduced samples. Delta Cq values normalize results against the housekeeping gene, and normalized transduction efficiency is calculated to confirm the gene transfer occurred in recipient cells.
Q6: What is the purpose of the negative control in phage transduction experiments?
The negative control combines recipient strain with LB medium containing magnesium sulfate and calcium chloride, but without phage lysate. This control undergoes identical steps as the transduction reaction, allowing researchers to verify that any ampicillin resistance detected in transduced samples resulted from phage-mediated gene transfer, not contamination or spontaneous resistance.
Q7: Why is sodium citrate used during the transduction procedure?
Sodium citrate is added after the one-hour incubation period to chelate divalent cations and halt phage-mediated DNA transfer. This stops the transduction reaction at a defined time point, preventing continued gene transfer and allowing researchers to accurately assess the efficiency of the transduction event that occurred during the incubation window.