cDNA末端の迅速な増幅

1. 3' RACE

に向けた実験セットアップ

1. 目的の遺伝子に対する5'特異的プライマーを設計します(遺伝子特異的プライマー1、GSP-1)。特異性を導入する唯一のプライマーであるため、非常に特異性が高い必要があります。したがって、比較的長いプライマーが望ましいでしょう(典型的な長さは約24ヌクレオチド、Tmは55-65°Cの範囲)。
2. 2つ目のネストプライマー(GSP-2)を設計し、プライマーはGSP-1の3フィートに配置する必要があります。このステップはオプションですが、ネストされたプライマーを使用して2回目のPCRを実行すると、目的の遺伝子に対するPCRの収量と特異性が向上します。dSmad2 cDNAの増幅に使用されるプライマーを表2に示します。

2. cDNAの合成

1. サンプルからRNAを抽出し、RNA抽出方法またはメーカーのプロトコルに従ったキットを使用します。ゲノムDNAの増幅を避けるために、サンプルをDNaseで処理します。この例では、成虫のハエ10匹からRNAを抽出しました。
2. 微量分光光度計を使用してRNA濃度を測定し、必要に応じてRNaseフリー水で最大100 ng/μlに調整します。
3. 逆転写(RT)反応でcDNAを調製するには、RACEに推奨されるキットを使用してください。サンプルごとに以下の試薬を含むマスターミックスを調製します:
   - 4 μl 逆転写バッファー (5x)
   - 2 μl オリゴ(dT)₂₀ プライマー (20 個のデオキシチミジンからなるオリゴ)
   - RNA 10 μl (最大1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 逆転写酵素 1 μl
   - 合計: 20 μl
4. 反応液を42°Cで90分間インキュベートし、逆転写酵素を省略したネガティブコントロールを含めます。
5. 逆転写酵素を不活性化するために、85°Cで5分間インキュベートします。
6. 効率的なPCRのためにDNAレベルを希釈するには、80 μl TEバッファーを添加して、総容量を100 μlにします。

3. cDNA断片の増幅

1. ハイフィデリティ(HF)Taqポリメラーゼを使用して、1回目の増幅PCRミックスを調製します:
   - 5x HF Taqポリメラーゼバッファー 4 μl
   - 0.4 μl dNTPミックス(各10 mM)
   - 1 μl GSP1 プライマー (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)20 プライマー (10 μM)
   - 1 μl cDNAテンプレート
   - 0.2 μl HF Taq DNAポリメラーゼ
   - 12.4 μl ddH2O
   - 合計: 20 μl
2. PCR1プログラムを使用してPCRを実行します(表1)。RTを含まない元のRNA産物をテンプレートとして使用したネガティブコントロールを含めます。さらに、「プライマーなし」コントロールを含んでもよい。
3. オプション:特異性とcDNA産物の量を増やすためのネスティングPCR。PCR産物1 μlを希釈し、TEバッファーでネガティブコントロールを1:20に希釈します。2回目のPCR反応のテンプレートとして使用します:
   - 5x HF Taqポリメラーゼバッファー 4 μl
   - 0.4 μl dNTPミックス(各10 mM)
   - GSP2プライマー 1 μl (10 μM)
   - 1 μl オリゴ(dT)₂₀ プライマー (10 μM)
   - 1 μl PCR 製品テンプレート
   - 0.2 μl HF Taq DNAポリメラーゼ
   - 12.4 μl ddH2O
   - 合計: 20 μl
4. PCR2プログラムを使用して2回目のPCRを実行します(表1)

4. cDNA断片の単離

1. 1-2%アガロースゲルをTAEバッファーで調製し、エチジウムブロマイドまたは代替DNA染色剤を使用してください。
2. 5 μlのサンプルを1 μlの6xゲルローディングバッファーと混合します。
3. サンプルと1kbのDNAラダーをマーカーとしてロードし、ゲルを120Vで約45分間、または色素のフロントがゲルの~75%下になるまで泳動させます。サンプルがゲルから出ないようにしてください。
4. UVランプの下のゲルバンドを確認してください。製品のさらなる加工には、低強度UVを使用し、増幅されたバンドの位置を特定し、メスを使用してゲルからそれらを切り取ります。
5. 凍結スクイーズやキットなどの方法を使用して、ゲルからDNAを精製します。
6. 精製したcDNAフラグメントは-20°Cで保存するか、シーケンシングやクローニングなどのさらなるアプリケーションにすぐに使用してください。