環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析

本手順は、まず水サンプルを5 µmおよび3 µmのフィルターで事前ろ過して海洋微生物バイオマスを回収し、続いて0.22 µmフィルターで回収することから始まります。次に、0.22 µmフィルターに保持された生物から全RNAを抽出します。選択的な酵素分解および減法ハイブリダイゼーションによって全RNAからrRNAを除去し、濃縮したMr.NをpolyAテイル付加およびin vitro転写により線形増幅させます。

増幅されたアンチセンスRNAは、ランダムヘキサマーを用いて2本鎖cDNAに変換されます。得られたcDNAは、クローニングしてシーケンスを行うか、または直接パイロシーケンスにかけることができます。こんにちは、ジョージア大学海洋科学科のMarianne Moran博士の研究室のRachel Perskyです。

本日は、環境サンプルから遺伝子発現を調べるための手順について解説します。環境メタトランスクリプトミクスを用いて、Scott Giffordが環境サンプルのRNA回収に向けた処理方法を実演します。

サンプルからのRNA抽出とJohanna RINsについて説明します。AONがRNA除去を実演し、その後、Maria KostaがRNA増幅およびcDNA合成の手順について解説します。

それでは始めましょう。環境RNAの採取を開始するために、チューブの一端をサンプリング目的の深度の水中に配置し、もう一端を大容量の3 µmフィルターに接続して、チューブの両端の間にポンプを設置し、フィルターラインシステムを構築します。次に、3 µmフィルターを0.22 µmフィルタータワーに接続し、0.22 µmタワーからの流出液をメスシリンダーに導きます。

システムを洗浄するため、数リットルの水を流します。完了後、ポンプを運転させたままチューブを水から取り出し、ライン内に残っている水を排出します。次に、ピンセットを使用して0.22 µmフィルターをフィルタータワーに取り付け、閉じます。

チューブの端を再び水の中に戻し、ポンプを起動します。両方のフィルターから空気が完全に抜けるまで待ち、カーボイの目盛りでろ過された水の量をモニタリングします。目的の量までろ過されたら、チューブを水から取り出し、システム内に残っている水を排出してください。

フィルターが乾き次第、速やかに上部フィルタープレートを取り外し、フィルターペーパーを折り畳みます。フィルターをwhirl packに入れ、液体窒素で急冷凍結させます。実験を開始する前に、RNAは至る所に存在し、mRNAは速やかに分解されるため、作業面やピペットを含め、リボヌクレアーゼフリー環境での作業における標準的な予防策に従うことが重要であることに留意してください。

これらを考慮し、本手順で使用するすべての材料を取り扱う際は、清潔な手袋を着用してください。また、サンプルは可能な限り短時間で処理する必要があります。0.22 µmフィルターから全RNA抽出を開始するために、50 mLコニカルチューブにβ-メルカプトエタノール添加RLTバッファーを8 mL加え、ビーズビーズチューブを準備します。

次に、mobile power soil extraction kitのRNAビーズを1〜2 mL加えます。冷凍庫から凍結させたフィルターを素早く取り出し、ワールドパックに入れたまま、マレットで砕いて破砕します。

破砕したフィルターを準備した50 mLコニカルチューブに加え、パラフィルムまたはラボテープでチューブの蓋を密閉し、10分間ボルテックスします。次に、50 mLチューブを5,000 RPMで1分間遠心分離します。室温で、できるだけ多くの溶解物を回収し、15 mLチューブに移した後、さらに5分間遠心分離します。

5,000 ×gで遠心分離した後、上清を新しい50 mLチューブに移し、溶解物に対して等量（1ボリューム）の100% ethanolを添加します。10 mLシリンジを用い、18～21ゲージの針を通して溶解物を吸い上げ、それを約5回繰り返します。その後の抽出ステップでは、メーカーの指示に従ってKaiGen R and easy mini kitを使用し、バキュームマニホールドまたは反復的な遠心分離を用いて、溶解物を提供されたカラムに適用します。

全RNA量を分光光度計で定量します。全RNAの収量を決定した後、製造元の指示に従いAmbien turbo DNA free kitを用いてDNA混入物を除去します。RNA抽出が完了しましたので、全RNAをJohannaに渡し、彼女が1段階目および2段階目のrRNA除去ステップを行います。

レイチェルさん、ありがとうございます。rRNA除去を開始するために、まず10倍反応バッファーを軽く混ぜ、滅菌済みのRNAフリー0.5 mLチューブ内で短時間遠心します。次に、適切な量の10倍反応バッファー、RNAインヒビター、全RNAサンプル、およびターミネーターエキソヌクレアーゼを混合します。Epicentre社のプロトコルに従い、加熱蓋付きのサーモサイクラーまたはウォーターバスを用いて、反応液を30 °Cで60分間インキュベートします。

次に、フェノール・エタノール沈殿により反応を停止させます。まず、RNaseフリー水を加えて全量を200 µLにし、次いでmRNA遠心分離チューブに1:1フェノール・クロロホルム溶液を1倍量加えます。水層を回収し、100%エタノールと塩を用いて沈殿させます。ここでは、一旦作業を停止することが可能です。

RNAは、後続のアプリケーションでサンプルを使用するまで-80°Cで保存することができます。最初のmRNA濃縮が完了したら、製造元の指示に従ってAmbien microbe enrichおよびmicrobe expressキットを使用し、サンプルから残留しているrRNAを除去します。真核生物のrRNAの除去を促進するために、microbe enrichキットを使用します。

すべての分量は、製造元の指示書に従って決定します。まず、1.5 mLチューブに300 µLの結合バッファーをピペットで分注します。最大30 µLの液量で、合計5〜100 µgの全RNAを加え、ボルテックスで混合します。

結合バッファーに、5 µgのRNA用に調製したキャプチャーオリゴミックス2 µLを静かに加え、チューブを軽くタッピングします。混合物を短時間遠心します。混合物を70 °Cで10分間熱変性させた後、37 °Cで1時間アニーリングさせます。

このインキュベーションの間、オリゴ磁気ビーズをヌクレアーゼフリー水で1回、結合バッファーで1回洗浄し、洗浄の間に磁気スタンドでビーズを回収して準備します。ビーズは氷上で保存し、室温まで温めておきます。使用の5分前に、ウォッシュソリューションをヒートブロックで37 °Cに加熱します。

洗浄済みのオリゴ磁気ビーズにRNAキャプチャーオリゴミックスを加え、チューブをそっと混ぜてスピンダウンさせます。この混合物を37 °Cで15分間短時間インキュベートします。チューブをマグネティックスタンドに設置し、約3分間待機した後、mRNAを含む上清を吸引して、氷上の回収チューブに転送します。

次に、あらかじめ温めておいた洗浄溶液100 µLをキャプチャービーズに加えます。ビーズを軽くボルテックスし、上清を回収します。mRNAを含むこの上清を、氷上の回収チューブに移します。

ambi microbe express kitを使用して原核生物のrRNAを除去する準備をしながら、コレクションチューブを氷上に置きます。このキットを用いて、残留している原核生物のrRNAを除去します。BioanalyzerまたはExperionを使用して、rRNAの混入とmRNAの品質を確認してください。ここでは一旦作業を停止することが可能です。

RNAは-80°Cで保存可能です。rRNAを除去した後、メーカーの指示に従いAmbien message AMP two bacteria kitを使用してmRNAを増幅します。純粋なmRNAサンプルが得られましたので、ここからはマリアに交代し、mRNAの増幅とcDNA合成について説明してもらいます。

Hannahさん、ありがとうございます。mRNA増幅を開始する前に、Ambien message AMP two bacteria kitマスターミックスの各コンポーネントの量を計算してください。まず、最大1000 ngの全RNAを滅菌済みのRNAフリーマイクロ遠心チューブに入れ、テンプレートRNAのポリアデニル化を行います。in vitro転写によりRNAを合成するため、最初のバッファーに6.5 µLのサンプルを使用し、RNAフリー水は使用しないでください。

温度が均一であるため、ハイブリダイゼーションオーブンまたはインキュベーターの使用が推奨されます。また、チューブ内に結露が生じないことが極めて重要であるため、in vitro転写反応を14時間インキュベートすることを強く推奨します。RNA収量を最大化して最高のA RNA収量を得るには、最終反応容量40 µLでIBTを行い、A RNAを約10 µLずつ分注して-80 °Cで保存してください。

RNAの増幅が完了したら、相補的DNA（cDNA）を合成します。Promega社製のuniversal ribot Clone cDNA合成システムキットを用いて、RNAからcDNAを合成します。このキットには、2 µgのRNAをcDNAに変換するための手順が記載されています。弊社では、6～10 µgのRNAを入力量として使用し、それに合わせて反応スケールを調整することを推奨します。

エタノール沈殿またはPromega Wizard DNA Cleanup Systemを用いて、CDNAを精製します。製造元の指示に従い、サンプルを−80 °Cで保存してください。この段階で、二本鎖CDNAを直接シーケンシングすることが可能です。10 Lの海水から、約10 µgの環境RNAを抽出し、20倍に増幅させました。増幅されたmRNAから二本鎖CDNAを生成することで、環境転写物のシーケンシングおよび解析に十分な量の物質を得ることができました。以上で、環境メタトランスクリプトミクスを用いて海洋微生物コミュニティの遺伝子発現を評価する方法について説明しました。

この手順を行う際は、mRNAが急速に分解されること、およびRNAが遍在していることを常に念頭に置いてください。したがって、RNaseフリー環境での作業に関する標準的な予防措置を講じ、可能な限り迅速にサンプルを処理してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。