Name: 環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: 学ぶ環境トランスクリプトミクスを用いた海洋微生物群集からのmRNA抽出・cDNA合成法。フィルター採取、rRNA除去、ポリAテーリングによる増幅、シーケンス解析までの完全なプロトコルを解説します。

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資金は、ゴードンとベティムーア財団の助成金と国立科学財団の助成金MCB - 0702125で提供されていました。

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

天然の微生物群集による遺伝子発現の調査では、微生物の生態学的役割と機能を探求するための手段として近年一般的になっている。海洋微生物の検出、定量、および特性評価と組み合わせて使用​​される、遺伝子発現の解析は、自然の微生物群集に機能するように系統発生をリンクするために使用することができます。機能的な遺伝子発現を標的とするための多くの技術は、特定のプローブまたは既知の配列の遺伝子のために設計されたプライマーセットに依存しています。対照的に、環境へのトランスクリプトは、既存のシーケンスのデータによって課される制約を受けることなく、積極的に発現しているそれらの遺伝子のための優先順位を持つ遺伝子の発現を調べるために使用することができます。環境中のmRNAのプールの分析は、したがって、主要な活動と、それらを媒介する生物間の接続を発見する最も効果的な方法の一つを提供することができます。 環境トランスクリプトの最初のアプリケーションは、自然生態系の3の細菌のmRNAのプールの組成と力学の最初のビューのいずれかを提供する。沿岸の塩湿地（サペロアイランド、ジョージア州）とアルカリ...

<table><tbody><tr><td>PowerSoil Bead Tubes</td><td>キット</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>キット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>キット</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit</td><td>キット</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt; Bacterial mRNA Enrichment Kit</td><td>キット</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt; kit</td><td>キット</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit</td><td>キット</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>キット</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Wizard DNA Clean-Up System</td><td>キット</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

コミュニティが表現されるかもしれないものの遺伝子の事前の知識がなくてもメタゲノム、環境トランスクリプト（metatranscriptomics）を取得し、配列の微生物集団からの環境のmRNAに似ています。したがって、コミュニティの遺伝子発現に最も公平な視点を提供<em&gt;その場で</em&gt;。原核生物のmRNAは、一般に真核生物のメッセージの分離は比較的簡単なようにポリ（A）テールが不足しているため、環境トランスクリプトミクスのプロトコルは、技術的に困難です。<sup&gt; 1</sup&gt;とするためのmRNAの比較的短い半減期の<sup&gt; 2</sup&gt;。さらに、mRNAがあまり豊富なトータルRNAの抽出物中のrRNAsよりも、こうしてrRNAの背景には、多くの場合、mRNAの信号を圧倒する。しかし、これらの困難のいくつかを克服するための手法が最近開発されている。逆転写と環境mRNAを増幅するためのランダムプライマーを用いてクローンライブラリを作成することにより、環境のトランスクリプトームを分析するための手順は、最近記述されていた二つの異なる自然環境では正常終了しましたが、結果はcDNA合成を開始するために使用されるランダムプライマーの選択によってバイアスされた<sup&gt; 3</sup&gt;。 mRNAの線形増幅の進歩により、増幅の段階でランダムプライマーの必要性を未然に防ぐ、それが可能なサンプルの収集と処理時間を減少し、それによってRNAの分解を最小限に少なく、出発物質を使用すること<sup&gt; 4</sup&gt;。<em&gt;試験管内で</em&gt;増幅mRNAの転写の方法は、mRNAをpolyadenylatingと転写産物の3末端にT7プロモーターを組み込んだ伴う。増幅RNA（aRNAを）パイロシーケンシングによって、ランダムヘキサマーを用いて本鎖cDNAをdouble型に変換されると直接配列決定することができます<sup&gt; 5</sup&gt;。駅ALOHAにおけるこのメソッドの最初の使用は、微生物群集の遺伝子発現を特徴付けるために、その有用性を実証<sup&gt; 6</sup&gt;。

私たちは、環境のmRNAからcDNAを生成するための方法を提示する。一般的に、トータルRNAは、最初の環境から収集され、rRNAを選択的に除去され、mRNAが選択的に増幅され、濃縮mRNAのプールから合成したcDNAは、配列決定される。回収された配列は、発現遺伝子を識別するために、標準的なバイオインフォマティクス技術を用いて注釈を付けることができます。

メタゲノミクスと同様に、環境トランスクリプトミクス（メタトランスクリプトミクス）は、微生物群集から環境mRNAを回収し、その配列を解析する手法である。

この手順は、まず水サンプルを5 µmおよび3 µmのフィルターで前ろ過して海洋微生物バイオマスを回収し、続いて0.22 µmフィルターで回収することから始まります。次に、0.22 µmフィルターに捕捉された生物から全RNAを抽出します。選択的な酵素分解および減法的ハイブリダイゼーションにより、全RNAからrRNAを除去し、濃縮したMr.NをpolyAテイル付加およびin vitro転写により線形増幅させます。次に、増幅されたアンチセンスRNAをランダムヘキサマーを用いて二本鎖 cDNA に変換します。得られた cDNA は、クローニングしてシーケンシングするか、直接パイロシーケンシングすることが可能です。こんにちは、ジョージア大学海洋科学科の Marianne Moran 博士の研究室の Rachel Persky です。本日は、環境サンプルからの遺伝子発現を解析する手順をご紹介します。環境メタトランスクリプトミクスを用いて、Scott Giffordが環境サンプルからRNAを回収するための処理方法を説明します。サンプルからのRNA抽出およびJohanna RINsの方法について説明します。AONがRNA除去について実演し、その後、Maria KostaがRNA増幅とcDNA合成の手順を解説します。それでは、始めていきましょう。環境RNAの採取を開始するために、まずフィルターラインシステムを設置します。チューブの一端をサンプリングに必要な深さの水中に配置し、もう一端を高容量の3 µmフィルターに接続し、その間にポンプを設置します。次に、3 µmフィルターを0.22 µmフィルタータワーに接続し、0.22 µmタワーからの流出液をメスシリンダーに導きます。システムを洗浄するため、数リットルの水を流します。完了後、ポンプを作動させたままチューブを水から取り出し、ライン内に残った水を排出します。次に、ピンセットを使用して0.22 µmフィルターをフィルタータワーにセットし、蓋を閉めます。チューブの端を再び水の中に戻し、ポンプを起動します。両方のフィルターから空気が完全に抜けるまで待ち、カーボーイでろ過された水の量をモニターします。目的の量までろ過されたら、チューブを水から取り出し、システム内に残っている水を排出します。フィルターが乾き次第、速やかに上部フィルタープレートを取り外し、フィルターペーパーを折り畳みます。フィルターを whirl pack に入れ、液体窒素で急凍結させます。実験を開始する前に、RNAは遍在しており、またmRNAは速やかに分解されるため、作業台やピペットを含め、リボヌクレアーゼフリー環境で作業するための標準的な予防措置を遵守することが重要であることに注意してください。これを踏まえ、本手順で使用するすべての材料を扱う際は、清潔な手袋を着用してください。また、サンプルは可能な限り短時間で処理する必要があります。0.22 µmフィルターから全RNAを抽出するための準備として、50 mLコニカルチューブにβ-メルカプトエタノールを添加したRLTバッファー 8 mLを加え、ビーズ破砕チューブを用意します。次に、Mobile Power Soil Extraction KitのRNAビーズを1〜2 mL添加します。凍結したフィルターを速やかにフリーザーから取り出し、ワールドパックに入れたまま、マレットで砕いて粉砕します。砕いたフィルターを準備した50 milliliterコニカルチューブに加え、チューブの蓋をパラフィルムまたはラボテープで密封し、10分間ボルテックスします。次に、50 milliliterチューブを5,000 RPMで1分間遠心分離します。室温で、可能な限り多くの溶出した液を取り出し、15 milliliterチューブに移した後、再び5分間遠心分離します。5,000 ×gで遠心分離した後、上清を新しい50 mLチューブに移し、ライセートに1等量の100% ethanolを加えます。10 mLシリンジを用い、18〜21ゲージの針を通してライセートを吸引し、これを5回ほど繰り返します。その後の抽出ステップでは、メーカーの指示に従ってKaiGen R and easy mini kitを使用し、バキュームマニホールドまたは繰り返し遠心分離により、ライセートを付属のカラムに適用します。分光光度計を用いて全RNAを定量します。全RNAの収量を決定した後、メーカーの指示に従ってAmbien turbo DNA free kitを使用し、DNA汚染を除去します。RNA抽出が完了したので、ここからは全RNAをJohannaに引き継ぎ、彼女が第1および第2のrRNA除去ステップを行います。レイチェルさん、ありがとうございます。rRNA除去を開始するために、まず10倍反応バッファーを静かに混ぜ、短時間遠心分離します。滅菌済みのRNAフリー0.5 mLチューブに、10倍反応バッファー、RNAインヒビター、全RNAサンプル、およびターミネーターエキソヌクレアーゼを適切な量ずつ合わせます。Epicentre社のプロトコルに従い、加熱蓋付きのサーモサイクラーまたはウォーターバスを用いて、反応液を30 °Cで60分間インキュベートします。次に、フェノール・エタノール沈殿法で反応を停止させます。まず、RNA-free waterを加えて全量を200 µLにし、続いてmRNA遠心分離用にフェノール・クロロホルム等量混合液を1容量加えます。水相を回収し、100%エタノールと塩で沈殿させます。ここで一旦中断することが可能です。RNAは、ダウンストリームのアプリケーションで使用するまで-80°Cで保存できます。最初のmRNA濃縮が完了したら、メーカーの指示に従ってAmbien microbe enrichおよびmicrobe expressキットを使用し、サンプルから残留するrRNAを除去します。真核生物のrRNAを除去しやすくするため、microbe enrichキットを使用します。すべての容量は、製造元の指示書に従って決定します。まず、1.5 milliliterチューブにbinding bufferを300 microliters分ピペットで分注します。そこに、最大30 microlitersの容量に溶解した5～100 microgramsの全RNAを加え、ボルテックスで混合します。結合バッファーに、5 µgのRNAあたり2 µLのキャプチャーオリゴミックスを緩やかに加え、チューブを軽くタッピングします。混合液を短時間遠心します。混合液を70 °Cで10分間変性させた後、37 °Cで1時間アニールさせます。このインキュベーションの間に、オリゴ磁性ビーズをヌクレアーゼフリー水で1回、次いで結合バッファーで1回洗浄し、洗浄の合間に磁気スタンドでビーズを回収して準備します。ビーズは氷上で保存し、室温まで温めておきます。使用の5分前に、ヒートブロックを用いて洗浄溶液を37°Cに加熱します。洗浄済みのオリゴ磁性ビーズにRNAキャプチャーオリゴミックスを加え、チューブを穏やかに混ぜてスピンダウンさせます。この混合物を37°Cで15分間、短時間インキュベートします。チューブをマグネットスタンドに設置し、約3分間待機した後、mRNAを含む上清を吸引し、氷上の回収チューブに移します。次に、あらかじめ温めておいた洗浄液100 µLを捕捉ビーズに加えます。捕捉ビーズを軽くボルテックスし、上清を回収します。mRNAを含むこの上清を、氷上の回収チューブに移します。ambi microbe express kitを用いて原核生物由来のrRNAを除去する準備をしながら、回収チューブを氷上に置きます。このキットを使用して、残存する原核生物のrRNAを除去します。BioanalyzerまたはExperionを使用して、rRNAの混入とmRNAの品質を確認してください。ここで一旦停止することが可能です。RNAは-80°Cで保存可能です。rRNAを除去した後、メーカーの指示に従ってAmbien message AMP two bacteria kitを使用し、mRNAを増幅させます。これで純粋なmRNAサンプルが得られましたので、ここからはMariaに交代し、mRNAの増幅とcDNA合成について解説してもらいます。ハンナさん、ありがとうございます。mRNA増幅を開始する前に、Ambien message AMP two bacteria kitマスターミックスの各コンポーネントの量を算出してください。まず、最大1000 ngの全RNAを滅菌済みのRNAフリーマイクロ遠心チューブに入れ、テンプレートRNAのポリアデニル化を開始します。インビトロ転写によりRNAを合成するため、最初のバッファーに6.5 µLのサンプルを用い、RNAフリー水は使用しないでください。温度が均一であるため、ハイブリダイゼーションオーブンまたはインキュベーターの使用を推奨します。また、チューブ内部に結露が生じないことが極めて重要であるため、in vitro転写反応のインキュベーションは14時間行うことを強く推奨します。RNA収量を最大化し、最高水準のA RNA収量を得るには、最終反応容量 40 µL でIBTを実施してください。A RNAは、約 10 µL ずつに分注し、-80 °C で保存してください。RNAの増幅が完了したら、相補的DNA（cDNA）を合成します。RNAからcDNAを合成するために、Promega社のUniversal riboClone cDNA synthesis system kitを使用します。このキットには、2 µgのRNAをcDNAに変換するための手順が記載されています。実際には6〜10 µgのRNAを入力し、それに合わせて反応系をスケールアップすることを推奨します。エタノール沈殿法またはPromega Wizard DNA Cleanup Systemを用いて、cDNAを精製します。メーカーの指示に従い、サンプルを-80 °Cで保存してください。この時点で、二本鎖cDNAを直接シーケンシングすることが可能です。10 Lの海水から約10 µgの環境RNAを抽出し、20倍に増幅しました。増幅されたmRNAを二本鎖cDNAに変換することで、環境転写物のシーケンシングおよび解析に十分な量の材料を調製しました。以上で、環境メタトランスクリプトーム解析を用いて海洋微生物コミュニティの遺伝子発現を評価する方法について解説しました。本手順を実施する際は、mRNAが速やかに分解されること、およびRNAが至る所に存在することを常に念頭に置いてください。したがって、RNaseフリー環境で作業するための標準的な予防措置を講じ、可能な限り迅速にサンプルを処理してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

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