環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析

この手順は、5マイクロメートルおよび3マイクロメートルのフィルターによる事前ろ過により水サンプルから海洋微生物バイオマスを取得することから始まり、続いて0.22マイクロメートルのフィルターに収集されます。次に、0.22マイクロメートルのフィルターに保持された生物から全RNAを抽出します。当社のRNAは、選択的な酵素分解によって全RNAから除去され、濃縮されたMr.NはポリAテーリングとin vitro転写によって直線的に増幅されます。

増幅されたアンチセンスRNAは、ランダムヘキサマーを使用して二本鎖CD NAに変換されます。得られたCD NAは、クローニングしてシーケンシングするか、直接パイロシーケンシングすることができます。こんにちは、ジョージア大学海洋科学部のマリアンヌ・モラン博士の研究室のレイチェル・パースキーです。

環境サンプルから遺伝子発現を調べる手順をご紹介します。環境メタトランスクリプトミクスを使用します。Scott Giffordが、RNA採取のための環境サンプルの処理方法をご紹介します。

サンプルとJohanna RINからRNAを抽出する方法をご紹介します。AONはRNA除去を実演します。その後、Maria Kosta は RNA 増幅と CD NA 合成のステップを経ます。

それでは始めましょう。環境RNAの収集を開始するには、チューブの一方の端をサンプリング用の水に挿入することでフィルターラインシステムを構築し、もう一方の端をチューブの両端の間にポンプを配置して3マイクロメートルの大容量フィルターに取り付けます。次に、3マイクロメートルのフィルターを0.22マイクロメートルのフィルタータワーに接続し、0.22マイクロメートルのタワーから目盛り付きの貨物に流出します。

数リットルの水をシステムに流してすすぎます。終了したら、ポンプが作動している間にチューブを水から取り外して、ラインから残りの水をパージします。次に、一対の鉗子を使用して、0.22マイクロメートルのフィルターをフィルタータワーに置き、閉じます。

ラインの端を水に戻し、ポンプをオンにします。両方のフィルターから空気をパージし、カーボーイでろ過された水の量を監視します。所望の量がろ過されたら、水からラインを取り外し、システムから残りの水をバージします。

フィルターが乾いたらすぐに、上部フィルタープレートを取り外し、フィルターペーパーを折ります。フィルターをワールパックに入れ、液体窒素でスナップフリーズします。実験を始める前に、RNAは遍在しており、mRNAは急速に分解されるため、リボヌクレアーゼフリーの環境で作業するための標準的な予防措置(作業面やピペットなど)に従う必要があることに注意することが重要です。

これを念頭に置いて、この手順で使用される材料を取り扱うときは、清潔な手袋を着用する必要があります。また、サンプルはできるだけ短時間で処理する必要があります。0.22マイクロメートルのフィルターから全RNA抽出を開始するには、50ミリリットルのコニカルチューブにベータメトエタノールを添加した8ミリリットルのRLTバッファーを添加してビーズビーズチューブを調製します。

次に、モバイルパワー土壌抽出キットから1〜2ミリリットルのRNAビーズを添加します。冷凍フィルターを冷凍庫からすばやく取り出し、ワールドパックに保管します。木槌で粉

準備した50ミリリットルの円錐形チューブに粉々になったフィルターを追加し、チューブの蓋を香水またはラボテープの渦で10分間密封します。次に、50ミリリットルのチューブを5、000 RPMで1分間遠心分離します。室温で、できるだけ多くのライセートを除去し、15ミリリットルのチューブに移してから、再び5分間遠心分離します。

5, 000倍Gで、上清を新しい50ミリリットルチューブに移し、1容量の100%エタノールを溶解物に加えます。10ミリリットルの注射器を使用して、ライセートを18〜21ゲージの針に通し、約5回戻します。その後の抽出ステップでは、製造元の指示に従ってKaiGen Rと簡単なミニキットを使用し、真空マニホールドまたは遠心分離を繰り返して、提供されたカラムにライセートを適用します。

全RNAスペクトロを測光的に定量します。総RNA収量を決定した後、製造元の指示に従ってAmbien turbo DNAフリーキットを使用してDNAコンタミネーションを除去します。RNAの抽出が完了したので、全RNAをヨハンナに渡し、ヨハンナは1番目と2番目のRRNA除去ステップを行います。

ありがとうレイチェル。RRNA除去を開始するには、滅菌RNAフリーの0.5ミリリットルチューブで使用する前に、mRNAを反応バッファーの10倍のみ穏やかに混合し、短時間遠心分離し、10倍反応バッファーRNA阻害剤、トータルRNAサンプル、ターミネーターエキソヌクレアーゼの適切な容量を組み合わせます。震源地のプロトコルに従って、加熱された蓋または水浴を備えたサーモサイクラーで摂氏30度で60分間反応をインキュベー

次に、フェノールエタノール沈殿で反応を終了します 最初にRNA遊離水を総容量200マイクロリットルに添加し、次に1容量の1対1フェノールクロロホルム溶液をmRNA遠心分離機に加えます。水相を収集し、次に100パーセントエタノールで沈殿させて攻撃します。これは潜在的な停止点です。

RNAは、ダウンストリームアプリケーションでサンプルを使用する準備ができるまで、摂氏マイナス80度で保存できます。最初のmRNA濃縮が完了したら、製造元の指示に従ってAmbien microbe enrichおよびmicrobe expressキットを使用して、サンプルから残留RRNAを除去します。真核生物のRRNAの除去を容易にするために、微生物濃縮キットを使用します。

すべてのボリュームは、製造元の指示を読んで決定されます。ピペットを開始するには、1.5ミリリットルのチューブに300マイクロリットルの結合バッファーを入れます。最大容量30マイクロリットルとボルテックスで5〜100マイクログラムの総RNAを追加します。

結合バッファーに5マイクログラムのRNAに対して2マイクロリットルのキャプチャーオリゴミックスを穏やかに加え、チューブを軽くたたいます。混合物を短時間スピンダウンします。混合物を摂氏70度で10分間変性させた後、摂氏37度で混合物を1時間ひざまずかせます。

このインキュベーション中に、オリゴマグビーズをヌクレアーゼフリー水で1回洗浄し、結合バッファーで1回洗浄し、洗浄の合間に磁気スタンドでビーズを捕捉して調製します。ビーズを氷の上に置き、室温まで温めます。使用の5分前に、ヒートブロックで洗浄液を摂氏37度に加熱します。

洗浄したオリゴマグビーズにRNAキャプチャーオリゴミックスを加え、チューブを穏やかに混合してスピンします。混合物を摂氏37度で15分間短時間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに入れ、約3分間待ってから、上清を含むmRNAを吸引し、氷上の採取チューブに移します。

次に、捕捉したビーズに100マイクロリットルの予め温めた洗浄液を加えます。そして、ビーズを静かに渦巻き巻き取り、上澄みの愚か者を回収します。氷上の収集チューブに Mr.NA が入ったこの上清。

アンビ・ミクロブ・エクスプレス・キットを使用して原核生物のRRNAを除去する準備をしながら、採取チューブを氷の上に置きます。これを使用して、残留原核生物であるRRNAを除去します。バイオアナライザーまたはExperionを使用して、RRNA汚染とMRを確認します。NA品質。これは潜在的な停止点です。

RNAはマイナス80°Cで保存することができます。RRNAが除去されたら、製造元の指示に従ってAmbien message AMP two bacteria kitを使用してmRNAを増幅します。さて、mRNAの純粋なサンプルができたので、実験をマリアに引き継ぎ、mRNAの増幅とCDNA合成を指導します。

ありがとう、ハンナ。mRNA増幅を開始する前に、AmbienメッセージAMPの2つのバクテリアキットマスターミックスの各成分の容量をオンラインで計算し、最大1000ナノグラムの全RNAを滅菌RNAフリーのマイクロフュージチューブに入れることにより、テンプレートRNAのポリアデニル化を開始します。最初のバッファーに 6.5 マイクロリットルのサンプルを使用し、RNA を含まない水を使用して、in vitro 転写により RNA を合成します。

ハイブリダイゼーションオーブンまたはインキュベーターは温度が均一であるため、使用することをお勧めします。また、チューブ内で凝縮が発生しないことが非常に重要であるため、14時間のin vitro転写反応インキュベーションを強くお勧めします。最高のA RNA収量を得るためにRNA収量を最大化するには、40マイクロリットルの最終反応容量でIBTを実施し、約10マイクロリットルのクォートで摂氏マイナス80度のA RNAを貯蔵します。

RNAが増幅されたら、相補体またはCDNAを合成します。プロメガのユニバーサルリボットクローン。CDNA合成システムキットは、NAからCD NAを合成するために使用されます。このキットには、NAからCD NAへの2マイクログラムの変換手順が記載されています。NAあたり6〜10マイクログラムの入力と、それに応じて反応のスケーリングをお勧めします。

エタノール沈殿法またはPromega Wizard DNAクリーンアップシステムを使用してCD NAを洗浄します。メーカーの指示に従って、マイナス80°Cの二本鎖CDNAで保存したサンプルは、この時点で10リットルの海水から直接配列決定することができ、約10マイクログラムの環境RNAを抽出し、増幅されたMRの変換により20倍に増幅しました。NAから二本鎖CDNAは、環境転写産物のシーケンシングと分析に十分な量の材料を生成しました。ここでは、環境メタトランスクリプトミクスを使用して海洋微生物群集からの遺伝子発現を評価する方法を紹介しました。

この手順を実行するときは、mRNAが急速に分解され、RNAが遍在していることを常に覚えておいてください。したがって、肋骨核のない環境で作業するための標準的な予防措置を講じ、サンプルをできるだけ早く処理してください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。