アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング
2009年2月20日
の複雑な運動挙動の研究キイロショウジョウバエ与えられたハエの動きの変化を定量化する能力に依存しています。この記事では、高分解能のトラッキングシステムを使用してこれを行う方法を示します。
ビデオトラッキングアッセイでは、ハエを麻酔を使用せずに正方形の観察チャンバーにロードする必要があります。これを行うには、ハエをチャンバーにノックするために、チャンバー内に小さな漏斗をネジ穴に並べる必要があります。この漏斗を使用して、ネジがチャンバーの穴を塞ぎ、通気孔からエアパルスが投与されて移動を開始します。
チャンバーの上に吊り下げられたビデオカメラは、この移動運動をキャプチャし、ハエの経路が追跡および分析されるコンピューターに送信します。こんにちは、ブランダイス大学生物学部のグリフィス研究室のジャスティン・スローソンです。今日は、ロコモーションの高解像度ビデオトラッキングの手順をお見せします。
この手順を研究室で使用して、成虫のハエの機関車の挙動を研究します。それでは始めましょう。実験を開始するには、酵母を含まない標準培地を含むハエとボトルを育てます。
このプロトコルでは多数のハエが必要なため、それに応じてクロスを設定する必要があります。ハエは、摂氏25度で12時間の明るい暗いサイクルで育てる必要があります。Ausが二酸化炭素ディフューザーを使用してハエを酵母を含まない媒体を含む試験管に選別し、試験管ごとに10人のオスを選別してから1〜3日後にハエを収集します。
行動実験を実行する前に、二酸化炭素の使用後少なくとも1日か2日待ってください。ハエが収集され、選別されたら、ビデオ追跡システムで実行できます。ビデオトラッキング実験は、摂氏25度の一定温度、湿度70%の環境室で行われます。
ビデオテープが動きながら飛ぶようにするには、録画する領域にデジタルビデオカメラを吊り下げる必要があります。カメラを下に向けて、トラッキングソフトウェアはコントラストベースであるため、カメラをライトボックスの上に吊り下げます。次に、ファイアワイヤーケーブルを使用して、カメラをコンピューターに接続します。
ソフトウェアプログラムであるWindowsムービーメーカーを使用して、ビデオを直接コンピューターに録画します。このプロトコルではエアパルスが投与されるため、部屋にはエアフローソースが存在する必要があります。ゴムチューブは、空気源をカーボンフィルターに接続して空気ろ過します。
また、ゴムチューブは、カーボンフィルターの反対側を中空ゴムストッパーを介して三角フラスコに接続します。フラスコには約半インチの水を入れておくと、空気が加湿されます。フラスコには小さなサイドアームも付いており、より多くのゴムチューブを介してYs形状のバルブに接続する必要があります。
Yバルブの一方の分岐は流量計に接続し、もう一方の分岐は正方形の移動チャンバーに接続します。この正方形の移動の部屋は追跡システムに部屋を接続する前に部屋の中を飛ぶことから蠅を防ぐための小さい低下の皿の付加のWolf Etal 2002年からの設計に基づいている、すべての部屋の部品を殺菌するために70%エタノールを使用することを忘れないでください。使用する前に、コンポーネントを駆動させてください。
追跡システムの準備ができたので、ハエを移動チャンバーに送り込み、ハエをチャンバーに届けることができます。通常、チャンバーの小さなプレキシガラスの上部を固定しているネジを外します。次に、ネジ穴が内部チャンバーの真上にくるようにプレキシガラスの上部を配置します。
実施直前にハエに麻酔をかけます。ビヘイビアアッセイは、パフォーマンスを損なう可能性があります。麻酔を避けるために、小さな出口のある漏斗を使用して、ハエをチャンバーにそっとノックします。
小さな出口のある漏斗を作成するには、漏斗の端にP1000ブルーピペットチップを取り付けます。はさみを使用してピペットチップの先端を切り取り、ハエが通過するのに十分な大きさの開口部にします。次に、ハエが入った試験管を取り、漏斗の上に逆さまに置きます。
次に、漏斗の端をネジ穴に入れます。漏斗を動かさないでください、これはハエを傷つけたり損傷したりする可能性があるためです。代わりに、チャンバーの漏斗全体をそっと叩き、すべてのハエがチャンバー内に入るまですべて叩きます。
マウスパッドを使用して、この衝撃を吸収します。ハエが中にいる場合は、漏斗を取り外し、プレキシガラスの上部をスクリューベッドの上に再配置してから、プレキシガラスの上部を所定の位置にSCRします。フライが適切に装填されたら、チャンバーをライトボックスの上に置きます。
環境室の他の照明を消し、ハエをチャンバー内に30分間順応させます。30分間の順応期間の後、自発運動アッセイに進み、アッセイを開始します。エアフローシステムのYバルブを切り替えて、空気が流量計にのみ流れるようにし、空気をオンにして、空気を目的の速度まで上げます。
毎分4〜6リットル以内の速度であれば、何でも機能します。通常、毎分5〜5リットル半を使用します。目的の対気速度に達したら、Yバルブを切り替えて、空気が移動チャンバーに流れるようにします。
このエアパルスの時間を 15 秒間計測し、エアをオフにすると同時に突然エアをオフにします。カメラを録画モードに切り替えます。このステップを一度に行うには練習が必要です。
毎秒10フレームで32回目の試行を記録し、遺伝子型ごとに少なくとも8回の試行を記録します。体験版が完了したら録画を停止し、体験版が完了したらムービーを保存してください。ビデオ解析を進めて、自発運動アッセイビデオのモーショントラッキングを行うことができます。
このソフトウェアを使用するために、動的画像解析システムを使用しています。QuickTime 7.5 0.5を使用してビデオをA VIファイル形式に変換します。次に、しきい値による自動トレース機能を使用して、コントラストに基づいてハエを追跡し、続いてトレースからパスを作成してデジタル化します。
次に、これらのトレースは計算パラメータ関数を適用して、各フライの瞬間速度をデータベースファイルに出力します。この関数では、データの平滑化も可能になります。5 15 60 15 5 のスムージング ウィンドウを使用します。
この情報をデータベースファイルとして出力したら、Microsoft Excelでファイルを開いて保存します。Excel ファイルは、MATLAB スクリプトを使用して処理され、瞬時速度をコンパイルし、移動ダイナミクスを理解するために必要な追加のパラメーターを計算します。そして、試合の構造。
以下は、このアッセイの代表的な結果です。左の図は野生型のカントンの生物の痕跡を示し、右の図は、2つの大きな重なり合う欠失を交差させることによって生成されたダスク遺伝子のハエヌルを示しています。私たちのパラダイムでわかるように、Daskヌルフライは、異なるタイプのロコモーターアッセイを使用して文献ですでに報告されているCanton Sと比較して、移動が大幅に減少しています。
以上、自発運動ビデオトラッキングアッセイの設定方法と実行方法をお見せしました。この手順を実行するときは、概日リズムの問題を回避するために、毎日同じ2〜3時間の時間枠内でアッセイを実行することを忘れないでください。また、常に野生型の生物を最初に実行して、特定の日の行動反応が正常範囲内にあることを確認することが重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、高解像度ビデオトラッキングシステムを使用してショウジョウバエの運動行動を定量化する方法を実証します。この手順により、麻酔なしでショウジョウバエの動きの詳細な分析が可能になります。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 行動分析
- ビデオトラッキング技術
背景
- ショウジョウバエは運動を研究するためのモデル生物です。
- 運動の定量化は複雑な行動を理解するために不可欠です。
- 高解像度のトラッキングシステムは運動分析の正確性を向上させます。
- この研究は分野の研究者のためのプロトコルを提供します。
研究目的
- ショウジョウバエの運動を追跡する手法を実証する。
- 研究者に詳細なプロトコルを提供する。
- ショウジョウバエの複雑な運動行動の研究を促進する。
使用方法
- ショウジョウバエを麻酔なしで四角い観察チャンバーにロードします。
- 漏斗を使用してチャンバーにショウジョウバエを誘導します。
- ネジでチャンバーの穴を密閉し、空気パルスで運動を開始します。
- ビデオカメラで動きを撮影し分析します。
主要な結果
- トラッキングシステムはショウジョウバエの動きを正常に捕捉します。
- 動きの経路はコンピューターで追跡・分析されます。
- この方法により運動行動の定量化が可能になります。
- 結果はショウジョウバエの様々な行動面を研究するのに使用できます。
結論
- 高解像度のトラッキングシステムはショウジョウバエの運動を研究するのに効果的です。
- この方法は行動神経科学の研究を向上させることができます。
- さらなる応用には遺伝子改変が運動に与える影響の研究が含まれるかもしれません。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying locomotor behavior in model organisms enables mechanistic de-risking of neuropharmacological targets by linking genetic perturbations to functional phenotypes. This high-resolution video tracking approach supports target validation through reproducible, quantitative phenotyping in Drosophila, a genetically tractable system for early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing real-time, anesthesia-free behavioral readouts that reflect neuronal circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring locomotor output as a functional readout of neuronal activity.
- Operational Value: Supports biological de-risking through anesthesia-free, real-time quantification of movement parameters such as speed, acceleration, and bout structure.
- Strategic Value: Facilitates phenotypic screening of genetic models to clarify pathway involvement and prioritize targets with strong behavioral correlates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, contrast-based video tracking with 10 msec temporal resolution for high-content locomotor phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via controlled environmental conditions (25°C, 70% humidity) and standardized air pulse initiation.
- Strategic Value: Generates quantitative outputs (average speed, max speed, time in motion) suitable for automated analysis and cross-genotype comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking locomotor deficits to genetic modifications, such as Dask null phenotypes.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation using consistent behavioral endpoints across studies.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by offering mechanistically interpretable, quantifiable behavioral data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by transforming genetic or pharmacological manipulations into quantifiable locomotor phenotypes, supporting hypothesis testing and lead optimization.
- Discovery Biology: Enables pathway clarification and target validation by correlating genetic lesions with changes in locomotor dynamics.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber setup, air pulse delivery, and contrast-based tracking software.
- Analytics: Outputs instantaneous speed, acceleration, and bout structure data for statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a scalable, reproducible phenotyping platform for neurobehavioral assessment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening genetic models, pharmacological compounds, or environmental stressors in Drosophila-based discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in behavioral phenotypes through high-resolution, real-time tracking.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled environmental parameters and automated trajectory analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying objective, quantitative locomotor data that reduces reliance on subjective scoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral effect size and reproducibility across genetic backgrounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, behavioral assay design, and video-based motion tracking software.
- Dependent on imaging infrastructure including a contrast-sensitive camera, light box, and airflow delivery system for pulse initiation.
- Necessitates cross-team standardization of environmental controls (temperature, humidity, light cycle) and acclimation protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different chamber sizes, fly densities, or genetic backgrounds affecting motility.
- Limited by the need for manual fly loading via funnel and air pulse timing, which requires operator training for consistency.
