Name: 骨髄の造血細胞のホーミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ骨髄造血細胞のホーミング機構をマウスを用いた実験系で解明する方法。細胞分離、蛍光染色、移植後の追跡により、造血幹細胞の骨髄定着効率を定量的に評価し、細胞移植治療の改善に寄与する知見を得る。

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このプロトコルは、デビッドスカデンの研究室でテストされ最適化されていました。資金は、ダナファーバー癌研究所/マサチューセッツ総合病院臨床血液腫瘍フェローシッププログラムによって提供されます。

<ol><li>我々は実験で使用するセルを抽出することによりホーミング実験を始める。レシピエント動物の長い骨の隙間に全骨髄のホーミングなどC57BL/6J（WT）及びトランスジェニックいるかを確認することがWTの動物から抽出した骨髄細胞ごとに異なる​​場合は、この現在の実験のために我々が調べることも検討されてリゾホスファチジン受容体1（LPAR1）（KO）のためのノックアウト。 </li><li>我々が実験を開始する前に、我々はこの実験のために必要な資料を収集します。私たちの研究室ではすべてのマウスの解剖は、細胞がレシピエント動物に移植しようとしている代わりに、 生体外分析のために使用されている場合は特に層流の組織培養フード内で行われている。私たちは、フード内ブルーシートを置くことによって始めます。必要に応じて他のオブジェクトには、ピンセットとオートクレーブされているハサミ、滅菌使い捨てメスとアルコール綿棒などがあります。私たちは、修正されたPBSと滅菌6ウェルプレートを必要とする、乳鉢、乳棒、50ccの青は円錐管と70uM使い捨てフィルターを突破した。 </li><li>我々一WT一KOマウスを取ることから始めます。 </li><li>これらのマウスは、CO 2吸入により安楽死させ、その後5秒間isopropranolol 70％に浸漬されています。このステップでは、細胞や実験結果の収率のいずれかの妥協につながっていないマウスの毛皮で、私たちの手で目的の細胞の混入を防ぎます。 </li><li>マウスは、鉗子とはさみのペアを使用して順番に切開されています。我々は通常、ルーチンの問題として、WTマウスで始まります。小さな断片は、腹部を覆うマウスの腹側皮膚で作られ、皮膚は、手を使って拡大されます。皮膚は簡単に後肢をオフにしています。大腿骨と脛骨が、これは骨髄を大量に含んでいるとして大腿骨頭が剥がれないように注意しながら抽出されます。上肢は体幹が動かない維持しながら、単にそれらにトラクションを適用することにより、動物の胴体から切り離されます。これは一体として上肢を削除します。上腕骨は、上肢から抽出されます。 </li><li>削除された骨を6ウェルプレートに追加されている修正されたPBS中に配置されます。変性PBSは、熱不活性化ウシ胎児血清およびEDTA、0.5M PH8の2 ccの2 mlを添加することにより行われます。この溶液をNalgene 0.45μMのフィルターを通して濾過され、少なくとも月に摂氏4度で保存することができます。 </li><li>それは正確にWTとKOの骨を識別できるようにするためにプレートのウェルにラベルを付けることが不可欠です。 </li><li>マウスの死体は削除され、オフに配置されている。 </li><li>新しいシートは、フード内に配置され、骨は使い捨てメスを使用して掃除している。 </li><li>きれいに骨がモルタルで一度にマウスを配置されます。修正PBSの2mlを乳棒を用いてモルタルと骨が粉砕されているために追加されます。それは10でその後にと乳棒のあちこちの動きと骨が円形の回旋の動きとそれらを粉砕最初のフラグメントに重要です。私は通常、50右回り、後、50反の動きを行うので、乳鉢で残った材料は、色および変更されたPBS中で白になるまで、上に白または透明のままの材料に追加。 </li><li> 50円形の粉砕の動きのすべてのセットの後、我々は、モルタルから50 mlコニカルチューブの上に置かれた70μMのフィルターに流体を転送する。フィルタへのすべての転送後にモルタルにPBSを2mlを追加することを忘れないでください。これが細胞のアポトーシスにつながるとして試してみて、粉砕、乾燥骨をまたは任意の期間のためにそれらが乾燥したままにしたくない。 </li><li>モルタルの材料は、白色になると、フィルターの材料は、モルタルに転送され、破砕が再び実行されます。これは、フィルタのセルが浪費されないことを保証します。通常は、再び、細胞の抽出が完了している時に色の白いモルタルの材料を作るために円形の回旋の動きの1つまたは2つのセットを取ります。 </li><li>コニカルチューブ内の溶液は、現在遠心分離し（WTと別のKOマウスから細胞を維持することを忘れないでください。従って、2つの異なるチューブ（WT細胞を持つもの、KO細胞と他の）持っている。10 1200rpmで遠心分。 </li><li>各試験管に別々のアスピレーターのピペットを使用して上清を吸引除去する。各ペレットにACK溶解緩衝液2 Ccを追加。この溶解バッファーは、滅菌する必要があります。氷上で5分間インキュベートする。 </li><li>各チューブに変更されたPBSの8 Ccを追加。 96ウェルプレートに2つの別々のウェルに各チューブとピペットから10 ulを取る。遠心機でチューブをセットし、10分間1200rpmで、それらをスピン。 </li><li>チューブが回転している一方で、目的の細胞を運ぶ96ウェルプレートの各ウェルにtryphan青色色素の30 ULおよび変性PBS 60 ulを追加。 </li><li>血球計算板にこの混合物10μlのを（ピペッティングでよく混ぜてください）​​を追加し、4つの外側の正方形のセルを数える。 </li><li> mlあたり各サンプルの細胞数は4とmultiplieで割ったため、計数した細胞の数です。100 000によるD。 </li><li>遠心分離が完了すると、遠心機からチューブを外し、ミリリットルあたり20万細胞の濃度で、カルシウム、マグネシウムまたはLのグルタミンなしPBSで細胞を懸濁します。あなたは可能性がKO動物のためのWTと容積5mlのための容積の約5mlを持つことになります。我々はPBSを使用するこのステップ以降は、プロトコルのためにPBSを変更されません。 </li><li>各チューブに5uMの最終濃度を達成するためにDII、細胞の染色色素を、追加してください。 10秒直ちにボルテックス。 10分間37℃でインキュベートすると光への暴露を避ける。 </li><li> 1200rpmで10分間PBSとスピンでチューブを埋める。 </li><li>遠心後、上清を吸引し、MLあたり40万セルにPBSで細胞を懸濁します。 </li><li> 27G針（WTマウスとKOマウスは5シリンジ、5シリンジ）で1 ccのシリンジに500μlのをロード。それは、各コホートに6シリンジを準備するのが賢明かもしれません。我々は次に何をしようとしている尾静脈注射はトリッキーなことができるように余分なものを持つことに役立ちます。 </li><li>崩壊からDIIを維持するために、アルミホイルでシリンジをカバーしています。 </li><li>各受信者の動物への細胞の混合物を500 ulを注入し、（各コホートの5）。 </li><li>これらの動物は、4月24日時間注射前に照射の9 Gyで照射する必要があります。 </li><li>注射後48時間、各受信者の動物の後肢から収穫の骨髄。 </li><li>ドナーのために上記のようなプロセス。 PBSの1ccのに各動物からの細胞を再懸濁します。血球計を用いて細胞数を取得します。 </li><li> BDからLSR IIフローサイトメーターまたは同等の楽器をお読みください。結果はパーセンテージまたはDII肯定的に分析骨髄中の細胞の絶対数として表現することができます。 </li></ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

それによって幹細胞、前駆細胞と分化細胞を含む骨髄細胞、それらの方法は、骨髄へのホーミングには、血流や骨髄のマウスの骨髄腔に注入された後のプロセスです。定義から明らかなように、科学者は、造血幹細胞、前駆細胞または免疫表現型によって識別されると細胞選別によって単離された分化細胞のホーミングを勉強することを選んだことがあります。一般的に科学者は、系統マーカーのために枯渇した骨髄細胞を注入し、それ故に前駆細胞および幹細胞を濃縮。 注入された目的の細胞の投与量は、この実験では変数です。細胞の数は、レシピエントマウスあたり500 000からレシピエントマウス当たり20万人に変えることができます。複数のセルが一つの骨髄で容易に検出を注入することができます。細胞数の可用性は、注入された数が制限される場合があります。 2000万LKS SLAMの細胞を選別することであってもおそらく1つは、上記所定の範囲の下端に向かって細胞の数を使用することにしたことがあるので、その場合、ほとんどの実験室の設定で現在の技術、と現実的では極めて困難である。 検討さ...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ウシ胎児血清</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8.0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>ACK溶血バッファー</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>イソプロプラノロール U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD 細胞標識溶液</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI 細胞標識溶液</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

骨髄の造血細胞のホーミング

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

ホーミングは、移植された造血細胞へ旅行し、生着または骨髄中の住居を確立することができるする現象です。様々なchemomkinesと受容体は造血幹細胞のホーミングに関与している。 [1、2] 本論文では、造血幹細胞の研究で使用される古典的なホーミングプロトコルの概要を説明します。一般に、これは、そのホーミングニーズ調査される細胞集団を分離する興味の染料でこの集団を染色し、レシピエント動物の血流中にこれらの細胞を注入する。レシピエント動物は、注射や関心の染料のための陽性の細胞のパーセンテージまたは絶対的な数について評価骨髄後所定の時間で屠殺される。最も一般的な実験的手法の一つでは、2つの遺伝的に異なる動物（野生型動物と対応するノックアウト）から造血細胞のホーミング効率が比較されます。この記事では、実験などの枠組みの中で造血細胞ホーミングプロトコルについて説明します。

この記事では、骨髄中の彼らのニッチへの造血細胞のホーミングを研究するために使用されるプロトコルについて説明します。

ホーミングとは、移植された造血細胞が骨髄へと移動し、生着または定着する現象のことである。さまざまな...

ホーミングとは、移植された造血細胞がレシピエントの骨髄へと移行する現象のことです。本記事では、骨髄内の相対的な領域への造血細胞のホーミングを研究するためのプロトコルについて解説します。目的の細胞集団を単離し、染料で染色した後、レシピエント動物の血流中に注入する方法を用います。一定時間後、動物内における染料陽性細胞の割合を測定します。この手法により、遺伝的に異なる2匹の動物からのこれらの細胞のホーミング効率を比較することが可能です。こんにちは、私はRHI Reen Yusefです。マサチューセッツ総合病院およびハーバード幹細胞研究所の再生医療センターにあるDavid Skadden博士の研究室のポストドクター研究員です。本日は、造血幹細胞が通常的に存在する骨髄へホーミングする機序を研究するための手順をご紹介します。当研究室では、さまざまな遺伝子改変マウス由来の造血幹細胞におけるホーミング能の違いを研究するために、このプロトコルを使用しています。それでは始めていきましょう。ホーミング実験を開始するために、WTおよびリゾホスファチジン酸受容体1（LPA R1）ノックアウト動物の両方から骨髄を抽出します。マウスの解剖はすべて、特に細胞をレシピエント動物に移植する場合、ラミナーフロー式の組織培養フード内で行う必要があります。解剖にあたっては、まずフードの底にライナーを敷きます。次に、オートクレーブ済みのピンセットと鋭利な鋏、滅菌使い捨てメス、およびアルコール綿を含む解剖道具をライナーの上に配置します。次に、クリーンベンチの中に、修飾PBSAのボトル、滅菌済みの6ウェルプレート、乳鉢と乳棒、50 ccの青色キャップ付きコニカルチューブ、および使い捨てフィルターを配置します。CO₂による安楽死後、目的の細胞の汚染を防ぐため、マウスの体を70%イソプロパノールで5秒間滅菌します。マウスの被毛がある場合でも、この工程が細胞の回収量や実験結果に悪影響を及ぼすことはないと考えられます。マウスを滅菌した後、ピンセットと鋭い鋏を用いて、マウスの腹部の腹側皮膚に小さな切り込みを入れます。次に、手で皮膚を広げて剥がします。皮膚は後肢から剥がれるはずです。大腿骨頭を脱臼させないよう注意しながら、大腿骨と脛骨を慎重に抽出します。これらには大量の骨髄が含まれているためです。次に、胴体を固定した状態で前肢に牽引を加えることで、胴体から前肢を分離します。これにより、上肢を一体として取り除きます。これらの上肢から上腕骨を取り出します。回収した骨を、WTサンプル用としてラベルを貼った6ウェルプレート内の修飾PBSに入れます。KOマウスに対しても同様の解剖を行い、今回はKOサンプル用としてラベルを貼った6ウェルプレートに、修飾PBSを用いて回収します。解剖が完了したら、マウスの死骸を廃棄し、フード内に新

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Biology

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骨髄の造血細胞のホーミング

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