Name: アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション技術。核輸送基質を注入し薄切片電子顕微鏡で可視化する方法です。細胞内輸送メカニズムの研究に有用です。

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我々はバキュロウイルスのAcMNPVを提供するために、役立つ議論のためのデイビッドTheilmann（パシフィック農業食品研究センター、サマーランド、ブリティッシュコロンビア州）を感謝。 この作品は、健康研究（CIHR）、保健研究のためのマイケルスミス財団（MSFHR）、およびカナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）のイノベーションカナダ財団（CFI）、カナダの協会からの補助金によって支えられて。

第1部：マイクロインジェクションのためのアフリカツメガエルの卵母細胞の調製<ol><li> 88 mMのNaCl、1mMのKClを、0.82 mMの：カルシウムを含まない修正バースの生理食塩水でコラゲナーゼ溶液（5 mg / mlのコラゲナーゼの20mlを含む50 mlのコニカルチューブにアフリカツメガエルの卵巣の小片（約2cm）を配置のMgSO 4、10mMのHepes緩衝液、pH7.5）。コラゲナーゼは、卵母細胞を囲む卵胞細胞を除去するために使用されます。 </li><li>シェーカーのプラットフォーム上にチューブを置き、一時間（100 RPMで）軽く揺らし。この時間は、コラゲナーゼの異なるロットによって異なります。こうして一時間後に、卵母細胞の小さなサンプルを取り、解剖顕微鏡下でそれらを調べる。適切にデfolliculated卵母細胞は、よく互いに分離されるべきであり、それは卵母細胞にガラス針を挿入する簡単なはずです。卵母細胞は、十分に脱folliculatedでない場合、それらはコラゲナーゼ溶液に残り、再び5分おきにチェックされます。 </li><li>修正されたバースの生理食塩水（MBS：88 mMのNaCl、1mMのKClを、0.82 mMのMgSO 4を用い 、0.33 mMのカルシウム（NO 3）2、0.41 mMのCaCl 2を 、10mMのHepes緩衝液、pH7.5）で卵母細胞を3回洗浄し、それらを転送するMBSプラス1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む100 mm径のシャーレに。卵母細胞は現在、微量注入する準備が整いました。マイクロインジェクションは、別の日に実行される場合、最大1週間までは4℃で卵母細胞を保存する。 </li><li>解剖顕微鏡を使って、マイクロインジェクションのための成熟期のVIの卵母細胞を選択する。これらの卵母細胞は、黒い動物半球とクリーミーな色の植物半球の間に良好なコントラストで、大規模です。 </li><li>マイクロウェルプレート（Nunc社製、10μlを加えボリューム）に成熟した段階のVIの卵母細胞を移す。これは、卵母細胞のundisrupted吸引を可能にするために最後にカットされているピペットの先端に200μlのピペッターを使用して、慎重に行う必要があります。 </li></ol>第2部： アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション<ol><li>マイクロインジェクションの可視化を支援するために、1％ブロモフェノールブルーを少量添加することにより微量注入するインポートの基板を準備します。例えば、我々は、基板を10μlにブロモフェノールブルーを1μl加える。 </li><li> 100 mm径のシャーレ上にパラフィルムの小さなストリップを配置し、パラフィルムストリップに注入する液の5μlのドロップを分注する。 </li><li>注入される溶液で以前に校正された注射針を（注入+マチックプラーと6.6μlのマイクロピペットドラモンドを引いて得られる）埋める。このため、インジェクターを吸引モードに設定されています。注射針を校正するには、針を50 NLのボリュームに対応するすべての0.5mmの、ドットマークを作る。 </li><li>細胞質注入の場合は、約45度の角度で、動物半球に非常に近い、植物半球の卵母細胞に針の先端を挿入する。顕微注入するために微量注入器の設定をオンにして、輸入材の50 NLで各卵母細胞を顕微注入する。針で、濁点が注入された基質の量を監視するために使用されています。 </li><li> NPCに関連付けられている輸入材の観察を可能にするように時間のポイントがそのように選択されているMBSで満たされた小さな（35mmの直径）ペトリ皿に注入した卵母細胞を移し、そして時間の所望の量（室温でインキュベートする、これが発生します。タンパク質のため、積極的にNPCに向かって輸送されるウイルスの10分から30分、この時間にも）注射の部位とタンパク質/ウィルスのサイズによって異なります。 </li><li>インキュベーションが完了すると、MBSで2％グルタルアルデヒドを含む4 mlのガラスバイアルに卵母細胞を移し、4℃で一晩固定し℃、 </li></ol>パート3： アフリカツメガエル卵母細胞の解剖<ol><li>次の日、MBSで卵母細胞を3回洗浄。 </li><li>低塩緩衝液（1 mMの塩化カリウム、0.5 mMのMgCl 2、10mMのHEPES、pH7.5のLSB）で満たされた小さなペトリ皿に卵母細胞を移す。解剖顕微鏡と解剖ピンセットを使用して、それぞれの卵母細胞から植物極を削除します。他のペアは、植物極を削除するには、はさみのように使用されている間は、ピンセットの一組で解剖されている卵母細胞を安定化するのに便利です。この時点では、細胞質ゾルで青みの存在によってマイクロインジェクションの成功を評価することが可能です。プロトコルは、成功微量注入した卵母細胞のために継続しています。サンプルはEMのために準備される場合に加えて、、この解剖のステップは、サンプルのトリミングとセクショニング時に核を見つけるのがかなり容易になります。 </li><li>室温で1時間のLSBの2％グルタルアルデヒドで再切除した卵母細胞を修正。 </li><li>固定後、LSBで解剖卵母細胞を3回洗浄する。 </li></ol>パート4：埋め込みとEMをシンセクショニングの注入した卵母細胞の調製<ol><li>うつ病のスライドに切除した卵母細胞を移す。 POSなどの液体をできるだけ多く吸引（彼らが乾燥しないように）すぐにその後ルヘ、および2％低融点アガロースで切除した卵母細胞をカバー。アガロースはまだ柔らかいですが、お互いから卵母細胞を分離するためにピペットチップを使用し、それぞれの卵母細胞が（ではない横）表向きにしているか停止していることを確認してください。 </li><li>アガロースは、約10分間固化することができます。アガロースが固化したら、それぞれ含むもの解剖卵母細胞、小さい部分にアガロースをカットするカミソリの刃を使用してください。 </li><li>室温で1時間、LSBの1％OSO 4でアガロース包埋の4ミリリットルガラスバイアルに卵母細胞、および後処理を修正して置きます。 </li><li>サンプルのLSBで3回洗浄する。必要に応じて、℃で一晩4℃でサンプルを保存し、翌日プロトコルを続ける。 </li><li>順次（20分毎に50、70、および90％エタノール）アルコールの昇順シリーズでサンプルを脱水する。これは、15分ごとに100％エタノールで2つの変化が続いている。最後に15分間、100％アセトンでサンプルを脱水する。 </li><li>少なくとも6時間、純粋なエポンで最終的に2時間エポンとアセトンの2:1混合物で浸潤が続く、一時間エポンの1:1混合物（フルカ）を有​​するサンプルとアセトンを浸透させる、と。 </li><li>新鮮な純粋なエポンで満たされた平らな埋め込み型の場所のサンプル。卵母細胞は、注射部位に近い核の側面のような方法で向いている - このケースで解剖された卵母細胞の側は、 - 最初の切片となる。このステップは、選択された基板の輸入を可視化するチャンスを最適化します。 </li><li>最後に、60℃で二日間エポンを重合℃に</li><li>サンプルを可視化するために、ブロックをトリミングしてから、ウルトラミクロトームを用いて区分されています。セクションは、EMグリッド上に移し、標準的な手順を用いて染色し、透過型電子顕微鏡で可視化されています。 それは標準的なEMの手続きであるとして、我々は、プロトコルのこの部分が表示されません 。 </li></ol>パート5：代表的な結果： プロトコルが成功している場合には、核膜（NE）とNPCはEM顕微鏡写真ではっきりと見えるはずです。注入材と注入と固定の間の時間の量に応じて、基板はNPCで、またはNPCの核顔で、NPCの細胞質面で見えるはずです。 図1は、4時間、4℃でインキュベートバキュロウイルスAcMNPVのキャプシドを注入されたアフリカツメガエル卵母細胞から隣接細胞質（C）と核（n）は、ある断面NE、および埋め込 ​​みと薄切片用に処理を示しています。 EMは、説明。矢じりは、NPCに指す。 NPCの細胞質面でのカプシドドッキングは、白い矢印で示されます。 対照的に、図2は、4時間室温でインキュベートしたマウスのパルボウイルスミニッツウイルス（MVM）、を注射されたアフリカツメガエル卵母細胞から隣接細胞質（C）と核（N）と断面NEを示し、埋め込みとEMは前述のように薄いセクションのために処理。このテクニックを使用して、我々は、MVMはNE（コーエンとPanté、2005年）の混乱を引き起こすことを発見した。括弧は、NEで休憩を示している。矢じりは、NPCに指す。 NEに関連付けられている推定上のMVMのキャプシドは、白い矢印で示されている。 <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="図1" width="600" height="459" /> 図1：4時間Cは4℃でインキュベートし、バキュロウイルスAC MNPVのキャプシドを注射し、用に処理されたアフリカツメガエル卵母細胞から北東に隣接する細胞質とのクロスセクション（c）と核（N）の電子顕微鏡写真埋め込みとEMは前述のように薄いセクション。矢じりは、NPCに指す。キャプシドは、白い矢印で示されている。スケールバー：100nmである。 <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="図2" width="600" height="264" /> 図2：4時間室温でインキュベートしたマウスのパルボウイルスミニッツウイルス（MVM）、を注射されたアフリカツメガエル卵母細胞から隣接細胞質（C）と核（N）とNEの断面の電子顕微鏡写真、および埋め込みとEMは前述のように薄いセクションのために処理。矢じりは、NPCに指す。括弧は、NEで休憩を示している。 NEに関連付けられている推定上のMVMのキャプシドは、白い矢印で示されている。スケールバー：100nmである。

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

薄切片EMと組み合わせ、アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクションは、核-細胞質間輸送を研究するための非常に効果的なツールです。このシステムは、細胞質フィラメントおよび核バスケット（Panté、2006年までにレビューさ）のようなNPCの構造部品と核移入基板の例の作用については、NPCを通じて輸入の明確なステップをマッピングするために使用されています。また、核複製ウイルスの核移入を（;レーブら、2003;。コーエンとPanté、2005 Pantéとカン、2002）の研究に使用されています。 ここに示されている細胞質マイクロインジェクション技術の一つのバリエーションは、核外輸送の基質（Panté ら 、1997）の核マイクロインジェクションです。核注入を実行するには、卵母細胞は、動物極が上直面するように配向、マイクロウェルプレートに入れ、そして4℃で一晩インキュベートする。次の日、核が動物極にわずかに隆起領域として表示されるはずです。核が急（45度より大きい）角度で輸出基板の約25 NLでマイクロインジェクションし、E...

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

薄切片電子顕微鏡（EM）に続いてアフリカツメガエルの卵母細胞のマイクロインジェクションは、核-細胞質間輸送を研究するための優れたシステムです。大きいため、大核と核膜孔複合体（NPCの）の高密度で、核輸送は、 アフリカツメガエル卵母細胞で容易に可視化することができます。核のインポートとエクスポートのメカニズムに多くの洞察は、このシステムの使用（Pantéによってレビュー、2006）によって得られている。さらに、我々は、ホストの核内で複製するいくつかのウイルスの核移入経路を分析するためにアフリカツメガエルの卵母細胞のマイクロインジェクションを使用している。 ここでは、核移入基板とアフリカツメガエルの卵母細胞の細胞質マイクロインジェクションを示しています。我々はまた、解剖、脱水、およびエポキシ包埋樹脂に卵母細胞の埋め込みを含めて、EMを薄切片による可視化のために注入した卵母細胞の準備を示しています。最後に、我々はバキュロウイルスオートグラファカリフォルニの核多角体ウイルス （AcMNPV）またはマウス（MVM）のパルボウイルスの分のウイルスのキャプシドにマイクロインジェクションされた卵母細胞の代表的な結果を提供し、技術の潜在的なアプリケーションについて説明します。

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示しています<em&gt;アフリカツメガエル</em核移入基板だけでなく、薄切片の電子顕微鏡による可視化のための注入した卵母細胞の準備と&gt;卵母細胞。

アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞への微小注入およびその後の薄切電子顕微鏡（EM）観察は、核質細胞質間の...を研究するための優れた系である。

Opus Lavu 卵母細胞へのマイクロインジェクションと、それに続く薄切電子顕微鏡観察は、核細胞質輸送を研究するための優れた系です。本実験では、コラゲナーゼを用いて卵母細胞から卵丘細胞を除去し、ステージ6の卵母細胞を選択してマルチウェルディッシュに配置します。その後、卵母細胞に核輸送基質をマイクロインジェクションし、室温でインキュベートして基質を核内に進入させます。細胞を固定し、解剖します。解剖した細胞を低融点アガロースに包埋し、四酸化オスミウムで再度固定した後、脱水し、エポキシ樹脂に包埋します。エポキシ樹脂に包埋した試料をウルトラミクロトームで薄切し、切片を銅製の電子顕微鏡用 specimen grid に載せます。染色後、切片を透過型電子顕微鏡で観察します。こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学動物学部のNellie Pane博士の研究室のSarah Cohenです。同じくPane研究室のShelly Owです。本日は、ゼノプス・ラビス細胞へのマイクロインジェクションの手順について解説します。当研究室ではこの手法を用いて、ウイルスなどの貨物の核内輸送について研究しています。それでは、始めていきましょう。実験を開始するために、約2cmのゼナップ・ラビス（Zenap Lavis）の卵巣片を、20mLのコラゲナーゼ溶液が入った50mLコニカルチューブに入れます。コラゲナーゼは細胞を囲む卵胞細胞を除去します。次に、チューブをシェーカープラットフォームに設置し、100RPMで30分間緩やかに揺らします。この時間は、コラゲナーゼのロットによって異なります。1時間後、細胞の少量をサンプリングし、解剖顕微鏡下で観察します。適切に脱葉された細胞は、互いに十分に分離しているはずです。ガラス針を細胞に挿入し、スムーズに挿入できることを確認してください。細胞の脱葉が不十分な場合は、コラゲナーゼ溶液に浸したまま、5分ごとに再度確認してください。細胞が十分に脱 regulación されたら、修正バル saline で3回洗浄し、MBSに1% Penicillin streptomycin を加えた100 mmペトリ皿に移します。解剖顕微鏡を用いて、マイクロインジェクション用の成熟したステージ6の細胞を選択します。これらの卵細胞は大きく、黒色の動物極とクリーム色の植物極のコントラストが明確です。成熟したステージ6の卵細胞をマルチウェルプレートに移します。その際、卵細胞を壊さずに吸引できるよう、先端をカットしたチップを装着した200 µLピペッターを使用し、卵細胞を慎重にマルチウェルプレートへと移してください。10 µLのウェル容量を持つマイクロウェルディッシュを使用します。EO部位へのマイクロインジェクションの準備が整いました。1%ブロームフェノールブルーを1 µL、基質10 µLに加えることで、マイクロインジェクションに使用する注入用基質を調製します。ブロームフェノールブルー染料を加えることで、マイクロインジェクションの視覚化が可能になります。次に、直径100 mmのペトリ皿の上にパラフィルムの小さな断片を置き、その上に注入溶液を5 µL滴下します。続いて、6.6 µLのDrummondマイクロピペットをInject Plusマットプラーで引き延ばし、注入用ニードルを作成します。ニードルに0.5 mm間隔でドットマークを付けることで、50 nLの容量に相当する目盛りとして校正します。マイクロインジェクターを吸引モードに設定し、細胞質注入用の注入溶液をニードルに充填します。針の先端を、動物極に非常に近い植物極の細胞に、約45度の角度で挿入します。次に、マイクロインジェクターの設定を注入モードに切り替え、各細胞に50 nanolitersの導入基質をマイクロインジェクションします。注入完了後、針にあるドットマークを確認して、注入された基質の量をモニタリングしてください。細胞をMBSで満たした35 mmペトリ皿に移します。室温で目的の時間、細胞をインキュベートします。核膜孔複合体（NPC）に関連する基質の取り込みが観察可能なタイムポイントを選択してください。NPC（核膜孔複合体）に向かって能動的に輸送されるタンパク質やウイルスの場合、通常は10分から30分の間のタイムポイントを使用します。これらのタイムポイントは、注入部位やタンパク質およびウイルスのサイズによっても異なります。インキュベーションが完了したら、細胞を2%グルタルアルデヒド含有MBSが入った4 mLのガラスバイアルに移し、4°Cで一晩固定します。翌日、細胞をMBSで3回洗浄すれば、細胞の解剖準備が整います。卵細胞を低塩バッファーを満たした小型ペトリ皿に移します。解剖顕微鏡と解剖用ピンセットを用い、各卵細胞から植物極を除去します。一方のピンセットで卵細胞を固定し、もう一方のピンセットをハサミのように使用して植物極を除去すると効率的です。この解剖ステップを行うことで、電子顕微鏡用のサンプルをトリミングおよび切片作成する際に、核をより容易に特定できるようになります。この時点で、細胞質に青色の色調が見られれば、マイクロインジェクションが成功したことを示します。マイクロインジェクションに失敗した細胞は破棄してください。次に、分解した細胞をLSB中の2% glutaraldehydeで室温で1時間、再度固定します。固定後、分解した細胞をLSBで3回洗浄します。細胞の洗浄が完了したら、注入済みの卵母細胞を包埋および薄切切片作成に供する準備が整います。摘出した卵母細胞を凹面スライドに転移させ、液体をできるだけ吸引し、細胞が乾燥しないよう迅速に操作します。アガロースがまだ柔らかいうちに、摘出した細胞を2%低融点アガロースで覆います。ピペットチップを使用して細胞同士を分離させ、各細胞が横向きにならず、上向きまたは下向きに配置されていることを確認します。アグロースを約10分間静置し、凝固させます。アグロースが凝固したら、カミソリの刃を用いて、解剖した細胞が1つずつ含まれるように小さく切り分けます。次に、アグロースに封入した細胞を4 mLのガラスバイアルに入れ、ロータリーミキサーを用いて、LSB中の1%オスミウムテトラオキシドで室温で1時間固定します。1時間の固定後、必要に応じてサンプルをLSBで3回洗浄します。サンプルを4°Cで一晩保存し、翌日にプロトコルを続行します。サンプルを50%、70%、90%のエタノールで順次各20分間脱水し、その後100%エタノールで2回、各15分間脱水します。最後に、サンプルを100% acetoneで15分間脱水します。脱水工程が完了した後、epon、flua、acetoneを1:1の割合で混合した液でサンプルを1時間浸透させ、次にeponとacetoneを2:1の割合で混合した液で2時間浸透させ、最後に純粋なeponで少なくとも6時間浸透させます。最終浸透工程が完了したら、新しく調製した純粋なeponを満たした平型の埋め込み型にサンプルを配置します。核の注入部位に近い側が最初に切片となるように、細胞を配置します。この場合、解剖された細胞側が最初に切片となります。このステップにより、選択した基質の取り込みを可視化できる可能性が高まります。細胞の向きが適切に整ったら、60 °Cで2日間エポキシ樹脂を重合させます。重合ステップの後、ウルトラミクロトームを用いて、樹脂包埋試料を厚さ50 nmで薄切します。切片を銅製EM specimen grid上に回収し、試料を染色して透過電子顕微鏡で観察します。プロトコルが成功していれば、電子顕微鏡写真で核膜とNPCが鮮明に観察できるはずです。注入した基質および注入から固定までの時間に応じて、基質はNPCの細胞質側または核側に観察されるはずです。この代表的な結果は、vaoウイルスのカプシドを注入したzenap細胞の、隣接する細胞質と核を含む核膜の断面図を示しています。A-C-M-N-P-Vの矢印はNPCを指しており、NPCの細胞質側にドッキングしているカプシドを白矢印で示しています。対照的に、この図は、マウスパルボウイルスを注入したzenap卵母細胞における、隣接する細胞質と核を含む核膜の断面図を示しています。この手法を用いて、MVMが核膜の破壊を誘発することを見出しました。ブラケットは核膜の断裂を示しています。アローヘッドはNPCを指しており、核膜に関連する推定MVMカプシドは白矢印で示されています。ここまで、Xap levu細胞へのマイクロインジェクションおよび解剖方法について説明しました。この手順を行う際は、コラゲナーゼのロットによって活性が異なることに留意することが重要です。したがって、脱葉に最適な時間を決定するために、使用するコラゲナーゼを慎重にテストしてください。また、脱葉およびMBSによる洗浄ステップの後、細胞はマイクロインジェクションまで最大1週間、4 °Cで保存することが可能です。最後に、グルート（埋め込み組織）は常に氷上に置いて隠し、乾燥させないようにしてください。脱水および浸透のすべてのステップにおいて、完全に浸漬させておく必要があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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