遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

ゼブラフィッシュの雌雄をブリーディングケージ内で交配させ、受精卵を底に沈ませて容易に回収できるようにします。次に、ペトリ皿の中で受精卵を顕微鏡スライドガラスに沿って並べます。続いて、充填済みの注入針をカットし、マイクロメーターで測定した際に注入量が目的のサイズになるよう、注入設定を調整します。

最後に、卵を一つずつ順番に注入します。こんにちは、ボストン子供病院循環器科、John MA研究室のJonathan Rosenです。そして、同じくVY研究室のMichael Sweeneyです。

本日は、ゼブラフィッシュ胚にmRNAまたはモルフォリノ（morpholino）を注入する方法を実演します。当研究室では、特定の遺伝子産物のノックダウンまたは過剰発現による影響を調べるために、この手順を用いています。それでは始めていきましょう。

まず、総産卵数を増やすため、注射の前夜に仕切りを設置した魚用タンクおよび繁殖タンクを準備します。必要に応じて、雌2匹に対して雄1匹の割合で魚を配置してください。翌朝、室内の照明が点灯した後、いくつかのタンクから仕切りを取り除き、約20分間妨げられない状態で交配させます。ストレーナーを用いて繁殖ケージから卵を回収し、卵用保存水で洗浄した後、ペトリ皿に注ぎ入れます。

卵水を用いることで、魚をより大きなタンクにまとめ直し、注入用の卵をさらに数回分採取させることが可能です。卵が単細胞期を過ぎないように注意しながら、最大数の卵を採取できるよう、採取のタイミングを調整してください。最後に、100 mmのペトリ皿の倒立させた蓋の中に顕微鏡スライドガラスを配置します。

転写ピペットを使用して、卵をスライドの端に沿って一列に並べます。その後、卵とは反対側のスライド端にキムワイプを押し当て、余分な卵水を拭き取ります。次に、マイクロピペットプラーを用いてマイクロインジェクション針を作製します。外径1 mmのガラスキャピラリーを引いて2本の針にし、これらの針を150 mmのペトリ皿に保管します。シリコンパテのランプの上に置くことで、針を事前に作製しておくことが可能です。

以下の設定を使用します。Heat 6、45 pole 60、velocity 80に設定します。マイクロローダーピペットを用いて、注入試料 3 µL をニードルの広い端にロードします。

気泡がほとんど、あるいは全くなくなるまで、ボラスを針先に向かって振ります。次に、エアソースとマイクロインジェクターの電源を入れます。針をマイクロインジェクターに挿入し、ハウジング内でしっかりと密閉されていることを確認してください。

マイクロマニピュレーターが、広範囲にわたる移動と調整が可能な適切な位置にあるか確認します。針先を顕微鏡の視野内に移動させます。ステージから高く持ち上げ、針先の最も細い領域に焦点を合わせます。

鋭いピンセットを用いて、卵黄およびcorry onを貫通できる十分な細さを維持しつつ、一定のビーズ径を供給できる位置で針を切り取ります。1回あたりの注入量を算出するために、マイクロメーター上にミネラルオイルを1滴垂らし、針をオイルに挿入してフットペダルを押し、オイル中に溶液のビーズを注入します。オイルへの注入を行いながら、必要に応じて針の調整や注入圧の調整を行い、ビーズの大きさをモニターします。

直径0.1 millimeterのビーズには、500 picolitersの注入材料が含まれています。通常、500 picolitersまたは1 nanoliterの注入量を使用します。理想的な注入量は、卵体積の約10%を満たす量になります。

針先の品質は、注入のしやすさと、結果の質および一貫性の両方にとって極めて重要です。それでは、注入手順を開始するために注入を行います。胚が4細胞期を超えて発達していないことを確認してください。

理想的には、胚は1細胞期である必要があります。次に、針を卵の列に向かって下ろし、観察しながら、絨毛膜の表面を突き破り、1回のスムーズな動作で卵黄内に進入させます。卵黄嚢に潰れや破れが生じた場合は、注入物を卵黄内に注入してください。

気泡が注入されないように注意し、注入作業を進める中で、目視で損傷が確認された胚がないか監視してください。一定のビーズサイズを維持するために必要に応じて圧力を調整し、ピペットチップを用いて、未受精に見える卵や注入過程で破壊された卵を除去します。卵の1列分の処理が完了したら、卵水を用いて注入済みの卵を慎重にきれいなペトリ皿へ移動させ、必要に応じてこの操作を繰り返します。

コントロールとして、注射を行っていない胚を数個保持しておきます。初日の後半に、死滅した胚を取り除き、注射した胚の数を記録します。感染のリスクを軽減するため、ディッシュ内の卵水を定期的に交換してください。

注入する物質によって、胚の生存率が非注入の個体よりも低くなる場合があることに注意してください。幸いなことに、大量の胚に注入することは容易であるため、これが問題になることは滅多にありません。次に、モルフォリノ注入とmRNA注入の両方の代表的な結果を示します。

受精後48時間の未注入コントロールは、期待通り正常な外見を呈しています。しかしながら、2つのEEG様リピートのうちの1つ目を含むHGアイソフォームをノックダウンするmorpho HG E three i three eeg FFR oneを注入した胚では、脳浮腫と心臓ガラスの注入が見られます。また、heart glass mRNAの注入によっても、受精後24時間で明らかな表現型が誘導されました。

非注入のコントロール群の頭部は正常に見えました。対照的に、M NNAを注入した胚の一部には無眼症が認められました。このように、1細胞期の段階でモルフォリノやmRNAを注入することで、その後の発生過程における特定の遺伝子の発現を増強または抑制できることをお見せしました。この手順を行う際は、以下の点に注意することが重要です。

mRNAまたはモルフォリノのいずれかが高濃度であると、モルフォリノを導入した胚に非特異的な致死性が生じる可能性があります。それぞれについて経験的に検証する必要がありますが、通常、200から500 micromolarの濃度であれば、全体の致死性を引き起こすことなく、特異的に遺伝子活性をノックダウンできます。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。