Name: 遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクション技術。Danio rerioの1細胞期胚にモルフォリノまたはmRNAを注入し、遺伝子発現を操作して発生過程における遺伝子機能を解析する方法を解説します。

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我々は彼らの技術支援のためにマブリーラボとNarieのStorerのメンバーを認識し、米国心臓協会（NCRPサイエンティスト開発グラント0635363N）と資金調達のための国立心臓、肺、血液研究所（グラントSCCOR RFA HL02 - 027）。

パート1：卵の生産とコレクション<ol><li>注射前に夜、場所の仕切​​りでタンクを繁殖で魚をセットアップする。必要に応じて総産卵数を増やすために、魚は1つの男性に女性2の比率で設定することができます。 </li><li>次の朝は、部屋の点灯後、電源をオンにいくつかのタンクから仕切りを引き出し、邪魔されずに嵌合時の約20分間できます。 </li><li>ストレーナーを使用して、繁殖ケージから卵を収集し、卵の水ですすいでください。卵を水でペトリ皿に卵を注ぐと、転送ピペットで未受精卵や破片を取り除く。魚は、注射のために卵の追加のラウンドを生産する大規模なタンクに再グループ化することができます。それらが単一の細胞の段階を通過させることなく生産される卵の最大数を可能にするために採卵のタイミングを調整します。 </li><li> 100ミリメートルペトリ皿の倒立蓋の顕微鏡スライドを置きます。単一の列を形成するスライドの側面に卵を整列するために、転送ピペットを使用してください。卵反対側に対してキムワイプを押すことで、スライドから過剰な卵水を取り外します。 （図1A） </li></ol>パート2：引っ張ってニードル、ロード、および準備<ol><li>マイクロピペットプラーで、愚かなパテのランプを介して敷設して、2つの針および150mmシャーレ内ストアにキャピラリー1.0ミリメートルODのガラスを引き出します。針は、事前にプルアップすることができます。 </li><li> microloaderピペットを用いて注入材料の3μLと積み込む針。残りのほとんどまたはまったく気泡がなくなるまで、針の先端に向かってボーラスを振る。 </li><li>空気源とマイクロインジェクターをオンにします。微量注入器に針を挿入し、ハウジング内に密封を保証する。マイクロマニピュレータの運動と調整の広い範囲を可能にするために適切な位置にあることを確認してください。ステージから高い顕微鏡の視野の平面、、、チップの薄地域を中心に針の先端をもたらす。ピアス絨毛膜と卵黄に十分な針は、細い葉が一貫性のあるビーズの大きさを提供する能力がまだある時点で針をピンチオフする鋭いピンセットを使用してください。マイクロメータでのミネラルオイルを一滴は、各注射の量を計算するために使用することができます。オイルに注入すると、0.1mmの直径を持つビーズは、注入材料の500 PL（図1b）が含まれ、500 PLまたは1nLの注入量は、一般的に使用されています。フットペダルを踏むと針をトリミングし、必要に応じて射出圧力を調整しながらビーズの大きさを監視します。理想的な注入量は、卵の体積の約10％を記入します。針先の品質は、注入の容易さと結果の質と一貫性の両方にとって非常に重要です。 </li></ol>パート3：インジェクション<ol><li>胚は、4細胞期を過ぎて開発していないことを確認します。理想的には、胚は1細胞期になっているはず。 </li><li>あなたの反対側の片手で料理を持って、卵の列に向かって針を下ろします。 </li><li>ピアースは、絨毛膜の表面および卵黄嚢の破砕または引き裂くために見ている間の滑らかなストロークで卵黄を入力してください。卵黄（図1C）への注入材を注入します。気泡を注入するかのどちらかの胚に致死となることができるように卵黄をストレッチすることは避けてください。行を下に向かって、ピペットチップを使用して一貫性のあるビーズのサイズとを、維持するために必要な圧力を調整し、未受精卵を見たり、射出プロセス中に破棄される卵を除去する。 </li><li>卵の列が完了した後、きれいなペトリ皿に注入卵を移動するために卵の水の穏やかな流れを使用してください。必要に応じて繰り返します。対照として、いくつかのuninjected胚を保管してください。初日の終わりには、死亡胚を除去し、注入された胚の数を記録。感染の機会を減らすために定期的に皿の中で卵の水を交換してください。 </li></ol>パート4：代表的な結果注入されているものに応じて、胚は、彼らのuninjected兄弟よりも低いレートで生き残ることができる。幸いなことに、それはそれらの膨大な数字を入れることは容易であるので、これはほとんど問題になりません。それはわずかに発育の遅れを示すことがmorphantsのは正常です。 マイクロインジェクションの結果を説明するために、我々は、ガラスのタンパク質のハート（HEG）のレベルを操作するためにこのプロトコルを使用していました。 HEGは、正常な心臓の開発に必要な膜貫通タンパク質である。その不在では、胚は巨大な流入の器官とチャンバー1の心を開発する。我々は、500μMの濃度で、heg_e3i3_egfr1とheg_e4i4_egfr2、HEGに対して2以前に未記載モルフォを注入した。 2日後の受精では、uninjected兄弟のコントロールは、（図2AおよびB）期待される、正常に表示されます。 heg_e3i3_egfr1を注入された胚は、脳浮腫（図2C）を持っている。これらmorphantsのほとんどの心は、形態を変更したものの、彼らのチャンバーは（図2D）は通常サイズです。胚の注入heg_e4i4_egfr2展示変数心臓欠陥を持つ。他の人が大規模な流入の広大と適度に拡大した心房（図2E及びF）を持っている一方、一部では、正常に表示されます。 HEGの変異体、以前に1を報告したが、非常に拡大した流入路およびアトリウム（図2GおよびH）があります。 我々はまた、完全長cDNA HEGから転写された400 ng /μLのmRNAと野生型胚を注入した。 uninjectedコントロールが（図3AおよびB）正常に発達しながら、HEG mRNAを注入された胚は、本体の軸の短縮野生外観から厳しい単眼症に至るまで表現型のスペクトル、、頭と体の壊死、及び正中線欠陥（図3Cに示すおよびD）。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" />注入されるように図1。胚をシャーレ（）で顕微鏡のスライドに対して、並んでいる。注入量は、マイクロメートルに置かれた鉱物油中に注入することによって決定されます。一般的に使用される500 PL、、の注入量は0.1 mm（B）の直径を有している。すぐに注入した後、モルホリノまたはmRNAは卵黄（C）で中断させるスポットとして表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> 図2：2日後の受精では、uninjected胚は、肉眼的欠陥（）または心臓の表現型（B）を持っていません。モルホリノheg_e3i3_egfr1を注入された胚は、脳浮腫（C、矢印）が、通常サイズの心腔（D）を持っている。モルホリノheg_e4i4_egfr2を注入いくつかの胚は肥大流入地帯と心房（E、F）を持っている。 HEG変異が著しく拡大した流入地帯と心房（G、H）を持っている。 （）、（C）、（E）、及び（G）4X DICイメージです。、（D）、（B）（F）及び（H）20 × DICイメージです。 =アトリウム、それ=流入路。 <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> 図3。24時間後の受精で、胚は、それらの（B）の間に神経管となく壊死や正中欠損（）と2つの明確に定義された目で長く、まっすぐなボディを持っているuninjected。 HEG mRNAを注入されたいくつかの胚は、対照的に、短縮された体軸、壊死、misshaped体節（C）、及び単眼症（D）を示す。 （A）と（C）4X DICイメージです。（B）と（D）20 × DIC画像です。

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

ゼブラフィッシュのモデルシステムの強みの一つは、特定の遺伝子産物が追加されたり、マイクロインジェクションによる胚から除去することができる容易さです。普遍的に特定のタンパク質を過剰発現するように、コードするmRNAは、それは、1細胞期における卵黄中に注入される。胚のその後の開発中に、RNAは生物全体に分散して変換されます。逆に、特定のタンパク質を除去するために、モルフォが使用されます。モルフォは、特定のRNAのアンチセンス相補性で設計された合成オリゴヌクレオチドである。のmRNAと同様に、モルフォは、1細胞期における卵黄中に注入されています。胚の内部に、彼らは翻訳を防止する、彼らのターゲットRNAをバインドします。 各モルホリノまたはmRNAのために作られる必要がある主な変更は、注入された物質の濃度である。あまりにモルホリノまたはmRNAのどちらかの高濃度は、非特異的毒性を引き起こす可能性があります。各モルホリノが、その最適濃度を決定するために経験的にテストしなければならない一方、200μMと500μMの間で一般的にモルホリノ濃度は、非固有の欠陥を引き起こすことなく効果的に遺伝子の活性をノックダウン。針の開口部の正確なサイズは重要ではありません。針のサイズは、噴射圧力と噴射時間の範囲内で適切なボリュームのボーラスを生成するために調整することができます。 モルフォは、蛋白質内ドメインの機能解剖を含む多くのアプリケーションを持っている。特定のエクソン - イントロン接合部を標的とするように設計するときに、モルフォが発生スプライシングを防止します。我々は、HEGのpre - mRNAの二つモルフォそのバインドエクソン-イントロン接合部の影響を調べた。モルホリノheg_e3i3_egfr1は、成熟した成績証明書にエクソン3を組み込んだからスプライシング機構を防止する、エクソン3とイントロン3の間の接合部を結合する。モルホリノheg_e4i4_egfr2は、同様にエクソン4を削除します。エクソン3と4の両方がEGF様リピートを含むドメインをエンコードする。いくつかの胚はheg_e4i4_egfr2適度に模写変異体を注入し、さらに実験は、心臓の開発にエクソン4をHEGの役割を理解する必要があります。驚いたことに、heg_e3i3_egfr1を注入胚では、脳浮腫、HEG変異体では見られない特徴を持っている。これにより、接合子の変異体では影響を受けないであろう母親の成績証明書をバインドするモルフォの能力に起因する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>ツール</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>ツール</td><td>ナリシゲ</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td>ツール</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>ツール</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーピペット</td><td>ツール</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ツール</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

ゼブラフィッシュを研究することの利点の一つは、胚のタンパク質レベルの操作の容易さと速度です。標的RNAに対するアンチセンス相補性を有する合成オリゴヌクレオチドであるモルフォは、、特定の遺伝子産物の発現を減らすために胚に追加することができます。逆に、処理されたmRNAは、遺伝子産物のレベルを高めるために胚に追加することができます。胚へのmRNAまたはモルホリノのいずれかを追加するための車両は、マイクロインジェクションです。マイクロインジェクションは、時間あたりの胚数百の注入を可能にする、効率的かつ迅速です。このビデオでは、マイクロインジェクションに関係するすべてのステップを示しています。簡単に言えば、卵は敷設後すぐに採取し、ペトリ皿で​​顕微鏡のスライドに対して、並んでいる。次に、注入材料がロード先の細い針は、インジェクターと空気源に接続されており、インジェクターコントロールが望ましい注入量を生成するために調整されます。最後に、針は、胚の卵黄に突入されており、モルホリノまたはmRNAが排出されます。

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。

ゼブラフィッシュを研究する利点の一つは、胚におけるタンパク質レベルの操作が容易かつ迅速に行えることです。モルフォリノは、合成された...

ゼブラフィッシュの雌雄をブリーディングケージ内で交配させ、受精卵を底に沈ませて容易に回収できるようにします。次に、ペトリ皿の中で受精卵を顕微鏡スライドガラスに沿って並べます。続いて、充填済みの注入針をカットし、マイクロメーターで測定した際に注入量が目的のサイズになるよう、注入設定を調整します。最後に、卵を一つずつ順番に注入します。こんにちは、ボストン子供病院循環器科、John MA研究室のJonathan Rosenです。そして、同じくVY研究室のMichael Sweeneyです。本日は、ゼブラフィッシュ胚にmRNAまたはモルフォリノ（morpholino）を注入する方法を実演します。当研究室では、特定の遺伝子産物のノックダウンまたは過剰発現による影響を調べるために、この手順を用いています。それでは始めていきましょう。まず、総産卵数を増やすため、注射の前夜に仕切りを設置した魚用タンクおよび繁殖タンクを準備します。必要に応じて、雌2匹に対して雄1匹の割合で魚を配置してください。翌朝、室内の照明が点灯した後、いくつかのタンクから仕切りを取り除き、約20分間妨げられない状態で交配させます。ストレーナーを用いて繁殖ケージから卵を回収し、卵用保存水で洗浄した後、ペトリ皿に注ぎ入れます。卵水を用いることで、魚をより大きなタンクにまとめ直し、注入用の卵をさらに数回分採取させることが可能です。卵が単細胞期を過ぎないように注意しながら、最大数の卵を採取できるよう、採取のタイミングを調整してください。最後に、100 mmのペトリ皿の倒立させた蓋の中に顕微鏡スライドガラスを配置します。転写ピペットを使用して、卵をスライドの端に沿って一列に並べます。その後、卵とは反対側のスライド端にキムワイプを押し当て、余分な卵水を拭き取ります。次に、マイクロピペットプラーを用いてマイクロインジェクション針を作製します。外径1 mmのガラスキャピラリーを引いて2本の針にし、これらの針を150 mmのペトリ皿に保管します。シリコンパテのランプの上に置くことで、針を事前に作製しておくことが可能です。以下の設定を使用します。Heat 6、45 pole 60、velocity 80に設定します。マイクロローダーピペットを用いて、注入試料 3 µL をニードルの広い端にロードします。気泡がほとんど、あるいは全くなくなるまで、ボラスを針先に向かって振ります。次に、エアソースとマイクロインジェクターの電源を入れます。針をマイクロインジェクターに挿入し、ハウジング内でしっかりと密閉されていることを確認してください。マイクロマニピュレーターが、広範囲にわたる移動と調整が可能な適切な位置にあるか確認します。針先を顕微鏡の視野内に移動させます。ステージから高く持ち上げ、針先の最も細い領域に焦点を合わせます。鋭いピンセットを用いて、卵黄およびcorry onを貫通できる十分な細さを維持しつつ、一定のビーズ径を供給できる位置で針を切り取ります。1回あたりの注入量を算出するために、マイクロメーター上にミネラルオイルを1滴垂らし、針をオイルに挿入してフットペダルを押し、オイル中に溶液のビーズを注入します。オイルへの注入を行いながら、必要に応じて針の調整や注入圧の調整を行い、ビーズの大きさをモニターします。直径0.1 millimeterのビーズには、500 picolitersの注入材料が含まれています。通常、500 picolitersまたは1 nanoliterの注入量を使用します。理想的な注入量は、卵体積の約10%を満たす量になります。針先の品質は、注入のしやすさと、結果の質および一貫性の両方にとって極めて重要です。それでは、注入手順を開始するために注入を行います。胚が4細胞期を超えて発達していないことを確認してください。理想的には、胚は1細胞期である必要があります。次に、針を卵の列に向かって下ろし、観察しながら、絨毛膜の表面を突き破り、1回のスムーズな動作で卵黄内に進入させます。卵黄嚢に潰れや破れが生じた場合は、注入物を卵黄内に注入してください。気泡が注入されないように注意し、注入作業を進める中で、目視で損傷が確認された胚がないか監視してください。一定のビーズサイズを維持するために必要に応じて圧力を調整し、ピペットチップを用いて、未受精に見える卵や注入過程で破壊された卵を除去します。卵の1列分の処理が完了したら、卵水を用いて注入済みの卵を慎重にきれいなペトリ皿へ移動させ、必要に応じてこの操作を繰り返します。コントロールとして、注射を行っていない胚を数個保持しておきます。初日の後半に、死滅した胚を取り除き、注射した胚の数を記録します。感染のリスクを軽減するため、ディッシュ内の卵水を定期的に交換してください。注入する物質によって、胚の生存率が非注入の個体よりも低くなる場合があることに注意してください。幸いなことに、大量の胚に注入することは容易であるため、これが問題になることは滅多にありません。次に、モルフォリノ注入とmRNA注入の両方の代表的な結果を示します。受精後48時間の未注入コントロールは、期待通り正常な外見を呈しています。しかしながら、2つのEEG様リピートのうちの1つ目を含むHGアイソフォームをノックダウンするmorpho HG E three i three eeg FFR oneを注入した胚では、脳浮腫と心臓ガラスの注入が見られます。また、heart glass mRNAの注入によっても、受精後24時間で明らかな表現型が誘導されました。非注入のコントロール群の頭部は正常に見えました。対照的に、M NNAを注入した胚の一部には無眼症が認められました。このように、1細胞期の段階でモルフォリノやmRNAを注入することで、その後の発生過程における特定の遺伝子の発現を増強または抑制できることをお見せしました。この手順を行う際は、以下の点に注意することが重要です。mRNAまたはモルフォリノのいずれかが高濃度であると、モルフォリノを導入した胚に非特異的な致死性が生じる可能性があります。それぞれについて経験的に検証する必要がありますが、通常、200から500 micromolarの濃度であれば、全体の致死性を引き起こすことなく、特異的に遺伝子活性をノックダウンできます。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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