遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

ゼブラフィッシュのオスとメスのゼブラフィッシュは、受精卵が簡単に採取できる底に落ちる繁殖ケージで交配されます。次に、卵をペトリ皿の顕微鏡スライドに並べます。次に、装填した注射針をクリップし、マイクロメータで測定したときに注射ボーラスが所望のサイズになるように注射設定を操作します。

最後に、卵子は一度に1つずつ注入されます。こんにちは、ボストン小児病院心臓病科のジョン・マサチューセッツ研究所のジョナサン・ローゼンです。そして、私はマイケル・スウィーニーで、同じくVYラボにいます。

今日は、mRNAまたはmorph Felloをゼブラフィッシュの胚に注入する方法を実演します。私たちの研究室では、この手順を使用して、特定の遺伝子産物のノックダウンまたは過剰発現の影響を研究しています。それでは始めましょう。

まず、注入の前夜に魚と繁殖用の水槽を仕切りを設置して、総産卵量を増やす必要があります。魚は、必要に応じて2人の女性と1人の男性の比率で設定できます。翌朝、部屋の照明が点灯した後、いくつかのタンクから仕切りを引き出し、約20分間邪魔されない交配時間を確保しますストレーナーを使用して、繁殖ケージから卵を収集し、卵水ですすいでからペトリ皿に注ぎます。

卵の水を使用すると、魚をより大きなタンクに再グループ化して、注射用の卵を追加で生成できます。卵子が単一細胞段階を通過せずに最大数の卵子が生産されるように、卵子収集のタイミングを調整します。最後に、100mmのシャーレの逆さまの蓋に顕微鏡スライドを置きます。

トランスファーピペットを使用して、卵をスライドの側面に並べて1列を形成し、次にキムワイプを卵の反対側に押し付けてスライドから余分な卵の水分を取り除きます。次に、マイクロピペットポーラーを使用してマイクロインジェクション針を準備します。外径1mmのガラスキャピラリーを2本の針に引っ張り、150mmのペトリ皿に収納します おかしなパテランプの上に置くことで、事前に針を引っ張ることができます。

以下の設定を使用します。ヒート 6 45 ポール 60 速度 80。マイクロローダーピペットを使用して、針の幅の広い端に3マイクロリットルの注射材料をロードします。

ボーラスを針先に向かって振って、気泡が少し残るかなくなるまで待ちます。次に、エアソースとマイクロインジェクターをオンにします。針をマイクロインジェクターに挿入し、ハウジング内にしっかりと密閉されていることを確認します。

マイクロマニピュレーターが、広範囲の動きと調整を可能にするために適切な位置にあることを確認してください。針先を顕微鏡の視界に持ってきます。ステージから高く、先端の最も細い領域に焦点を合わせます。

鋭い鉗子のペアを使用して、針がコリーと卵黄を突き刺すのに十分なほど狭くなるポイントで針をつまみながら、それでも一貫したビーズサイズを提供できます。各注入の量を計算するには、マイクロメーターに鉱油を一滴垂らし、針をオイルに挿入し、フットペダルを踏んでオイルに溶液のビーズを注入します。針をトリミングしながらビーズのサイズを監視し、オイルに注入するときに注入圧力を調整する必要があります。

直径0.1ミリメートルのビーズには、500ピコリットルの注入材料が含まれています。通常、500ピコリットルまたは1ナノリットルの注入量が使用されます。理想的な注入量は、卵子の量の約10%を満たします。

針先の品質は、注入の容易さと結果の品質と一貫性の両方にとって重要です。さて、いよいよ注入手順を開始するための注入です。胚が4細胞期を超えて発達していないことを確認してください。

理想的には、胚は1つの細胞段階にあるべきです。次に、針を卵の柱に向かって下げ、コリオンの表面を突き刺して、見ながらなめらかに卵黄を一気に入ります。卵黄袋をつぶしたり引き裂いたりする場合は、注入材料を卵黄に注入します。

気泡の注入を避け、注入によって目に見えて損傷を受けた胚に注意してください。圧力を調整するには、ビーズのサイズを一定に保つ必要があり、ピペットチップを使用して、受精していないように見える卵子や注入プロセス中に破壊された卵子を取り除きます。卵の列が完成したら、卵の水を穏やかに流して、注入した卵をきれいなシャーレに移し、必要に応じて繰り返します。

コントロールとしていくつかのunin注入胚を保持します。最初の日の後半に、死んだ胚を取り出し、注入された胚の数を記録します。感染の可能性を減らすために、皿の中の卵水を定期的に交換してください。

注入されるものによっては、胚は注入された兄弟よりも生存率が低くなる可能性があることに注意してください。幸いなことに、大量のものを注入するのは簡単なので、これが問題になることはほとんどありません。次に、morpho注入とmRNAの両方の代表的な結果を示します。

受精後48時間で注入されたコントロールは、予想通り正常に見えます。しかし、モルフォHG E3 i 3 脳波FFR oneを注入した胚は、2つの脳波flikeリピートのうちの1つを含むHGアイソフォームをノックダウンし、脳浮腫、心臓ガラスの注入を呈する。Mr.NA また、受精後24時間で明らかな表現型を生み出しました。

unin注入されたコントロールの頭部は正常に見えました。逆に、M NNAを注入した胚の一部はオピアを示しますが、1つの細胞段階でmorphosまたはmRNAを注入すると、後の発生中に特定の遺伝子の発現が増減する方法を示しました。この手順を実行するときは、それも覚えておくことが重要です。

高濃度のmRNAまたはモルフォは、モルフォを持つ胚に非特異的な致死を引き起こす可能性があります。それぞれを経験的にテストする必要がありますが、通常は200〜500マイクロモルのノックダウン遺伝子活性の濃度で、全体的な致死性を引き起こさずに特異的にテストする必要があります。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。