Name: 人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶ 膵島単離法：膵組織をコラゲナーゼ溶液で自動灌流し消化・採取する方法。高品質なヒト膵島を効率的に分離し、移植治療に応用する技術を解説します。

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イリノイ大学シカゴ校だけでなく、膵島細胞リソースセンターNIHの助成金（RFA - RR 05から003）、クリストファー財団、Efroymson財団、およびテラブス財団からの資金によって支え。

1。ファシリティのセットアップ<ol><li>人間の膵島分離には、チームワークを含む時間に敏感な手順であり、それゆえ、4人は、この手順を行うことが必要である。チームは、膵臓の解剖とcannulates外科医によるリードです。 </li><li>膵島分離は、チームはUIC膵島分離施設に入る分を開始します。チームメンバーは、必要なすべての計測機器が、遠心分離機のように、チェックされており、電源が入っていることを確認してください。彼らはまた、すべてのフードとの表面を適切にサニタイズしてください。 </li><li>二人は、カニューレ挿入のテーブル、スラッシュ自販機、消化回路、灌流装置、COBE浄化機、および外科テーブルを設定します。 </li><li>同時に、他の2つのチームのメンバーは、分離時に必要なメディアを準備します。 </li><li>次に、細菌学のチューブ（ボトル、チューブ、フォームおよび袋）、サンプリングチューブ（洗浄とプレ充填）、及び評価のチューブとプレートが用意されています。 </li><li>次のように設定された浄化チューブを準備します：第1回チューブ、空、150 mlでマーク、チューブ2-12は、ヒトアルブミン（洗浄ソリューション）を添加したM199培地200mlで埋め、230 mlでマークされ、そして最終的に1つ50 mlコニカルチューブ洗浄溶液50mlでいっぱい。これらの準備ステップが完了すると我々は、膵臓を作製し、灌流を開始する準備ができました。 </li></ol> 2。膵臓の準備と血流<ol><li>膵臓の準備と灌流を開始するには、演算子は、滅菌テクニックを使用してパッケージから臓器を削除します。外科医は、汚染除去のテーブルに膵臓を転送します。 </li><li>外科医はそれは準備された&quot;調達&quot;細菌学のボトルを埋めるために、それを使用する演算子、にオリジナルの膵臓保存液と手を使用すると、ワン60mlのシリンジを満たします。 </li><li>臓器は、膵島分離（膵臓が調達ま​​たは解剖学的に異常な中に破損している場合、それは膵島分離に使用されていない可能性があります）に適しているかどうかを判断するために目視検査の後、外科医は、コラゲナーゼを準備するためにオペレータが要求されます。この再懸濁の時間が異なる酵素のブランドと多くの間で変化することに注意してください。 </li><li>外科医の準備が整うと、汚染除去のテーブルに（Betadine、Fungizone /セファゾリンおよびHBSS）除染ソリューションを持参し、適切なコンテナにそれらを注ぐ。外科医は、分間除染液の各々に膵臓を洗浄する膵臓の汚染除去を行います。膵臓は、それは重量を測定されるに小さい殺菌した瓶に入れられます。重量は、バッチレコードに入力された後、膵臓は、いくつかの保存液とカニューレのパンに配置されます。 </li><li>外科医は、公開と部分的に主膵管を切開すると、カニューレと膵臓の各半分をカニューレを挿入するでしょう。カニューレは、縫合によって固定されます。膵臓を灌流するには、まず血流のユニットに移動し、流域に酵素液を注ぐ。総灌流時間は約10分、5分では80 mmHgの時、その後5分間で180 mmHgの時です。膵臓は灌流後に膨張した。 </li><li>脂肪組織が慎重に膵臓からトリミングされているカニューレのパンへの灌流膵臓を、移動する。その後10から12の部分に膵臓をカットし、消化のためにRicordiの商工会議所に移す。 </li></ol> 3。膵臓の消化<ol><li> 、消化のステップを開始する空のRicordiのチャンバーに膵臓を転送、Pulmozymeの1つの2.5 mlのバイアルを追加するには、（チャンバーを組織ブロックの大きな塊を避けるために）画面に置かれた、チャンバーを閉じ、システムをいっぱいに。 </li><li> 5分間のソリューションをポンピング開始。ゆっくりと均等に全体の温溶液を分散させるためにチャンバーを揺らし。 5分後、軽く全体の消化の段階のためのチャンバーを振る。 ˚Cで37℃の温度を維持する</li><li>温度が37℃に達するまでゆっくりとチャンバーを揺する、その後チャンバーを振る。サンプルを2分ごとに乗り、無料の島が、スコープの下に発見された場合に検出。バッチ記録の消化テーブル内の膵島評価情報を記録します。そのうちの50％が溶液中に遊離し、分離されたフローティングがあるまで、膵島の割合を監視し続ける。 </li></ol> 4。組織のコレクション<ol><li>かつて島の50％がサンプル中の遊離発見された、消化が回路内にコールドRPMI希釈液を加えることによって停止されます。組織を、500mlコニカルチューブヒトアルブミン30mlで事前入力で収集されます。一度チューブは、スピン清オフ吸引と冷洗浄溶液でペレットを洗浄している。 1分、4˚Cの、1100 RPM（毎分回転数）でコニカルチューブをスピン</li><li>シングル500ミリリットルコニカルに消化された膵臓の組織で中断されたすべてのコレクションチューブを組み合わせる。チューブは洗浄された組織の一杯になると、スピンし、すべての組織が複数回洗浄されるまで、洗浄工程を繰り返します。このチューブをスピンし、単一の250ミリリットルコニカルチューブに組織を移す。 250mlにボリュームをで持ち出すM199洗浄ソリューションでは、HAを補充し、サンプリングの準備。 </li><li>ピペットで1 mlのサンプルを取り、15 mlコニカルチューブ洗浄溶液9 mlをあらかじめ入力して追加します。その後、皿を数える直接グリッドに1ミリリットルからのサンプル、15 mlコニカルチューブゆるやかに転倒によって、本から混ぜる。細胞をカウントし、2500（10x250）の希釈係数を用いて細胞数を計算する。 </li><li> 250ミリリットルコニカルチューブをスピンし、UW（ウィスコンシン大学）は、通常、臓器温存のために使用する溶液の150mlを加える。 UWが追加されたときに、ピペットを用いて細胞懸濁液を混ぜる。 UWの開始時刻を記録し、精製のオペレータに通信する。氷と時折渦巻きにチューブ（s）を残す。今すぐ島をさらに精製することができる。 </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

分離の結果9,10に影響を与える要因はさまざまです。その中で、膵組織の消化は、重要な役割を果たしている。私たち自身の人間の膵島分離の経験に基づいて、我々は潜在的に膵島の収量と品質に影響を与えうる重要なポイントは、以下の要約。 <ol><li>酵素の様々なタイプが使用されると消化時間が異なっている。 </li><li>早く完全に腺房組織から分離膵島の40〜50％として、消化が希釈溶液を添加し、組織を冷却することによって直ちに停止する必要があります。 </li><li>穏やかな収集組織の処理、洗浄、そして混合。 </li><li>収集された組織とUW液の混合物が良い精製結果を得るために少なくとも30分間氷上に置く必要があります。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>氷スラッシュメーカー</td><td>設備</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>滅菌氷の作製</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>設備</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>MZ6倒立顕微鏡 TLBD4.1</td><td>設備</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>2 mmグリッド付き細胞培養ディッシュ</td><td>設備</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>膵島計数</td></tr><tr><td>デジタルウォーターバス EX7</td><td>設備</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>設備</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>MonoBloc天秤 AB 104-S</td><td>設備</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>膵臓重量の測定</td></tr><tr><td>MasterFlex IIスピードコントローラー</td><td>設備</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>消化中の流速調整</td></tr><tr><td>デジタルサイト DS L1</td><td>設備</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>灌流ユニット</td><td>設備</td><td>カスタムメイド</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>灌流ユニット用クーラー</td><td>設備</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>リコルディチャンバー</td><td>設備</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>RPMI希釈液</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>ウィスコンシン大学 (UW) 液</td><td>試薬</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>25% ヒトアルブミン</td><td>試薬</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>M199培地（洗浄液）</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ NB1 GMPグレード</td><td>試薬</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>中性プロテアーゼ NB1 GMPグレード</td><td>試薬</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>試薬</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>セファゾリン</td><td>試薬</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>ジチゾン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

人間の膵島単離：パートi：膵組織の消化とコレクション

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

1型糖尿病の管理は、年間1,000億ドルで、個人と社会の両方に、厄介です。グルコースモニタリングと新しいインスリン製剤の普及にもかかわらず、多くの個人はまだ壊滅的な二次的合併症を開発する。膵島移植は、糖尿病患者における正常血糖コントロールの近くに復元することができます<sup&gt; 1</sup&gt;、集中的なインスリン療法に関連付けられている重篤な低血糖エピソードのリスクなし。十分な膵島質量を提供することに成功した膵島移植のために重要です。しかし、ドナーの特性、臓器の調達と保存には、分離結果に影響を及ぼす<sup&gt; 2</sup&gt;。イリノイ大学シカゴ校（UIC）で我々は改善された精製勾配で成功した分離プロトコルを開発している<sup&gt; 3</sup&gt;。プログラムは、2004年1月に開始し、300人以上のアイソレーションは、2008年11月までに実施された。膵臓は冷たい保存液（UW、ウィスコンシン州またはHTKの大学、ヒスチジン - トリプトファンケトグルタル酸）に送られ、<sup&gt; 4月7日</sup&gt;膵島分離のためのUICにおける細胞分離の研究室へ。膵島は、もともとRicordiの記載された方法を改変したものですUIC方法を、用いて単離された<em&gt;ら</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;。簡単に言えば、周囲の組織から膵臓をクリーニングした後、それは酵素溶液（Servaコラゲナーゼ+中性プロテアーゼまたはシグマV酵素）で灌流した。膨張した膵臓は、その後、Ricordiの消化槽に移し、変更、閉鎖循環配管システムに接続し、37℃まで加温した。消化中に、チャンバーを穏やかに振とうした。サンプルは、消化の進行状況を監視するために連続して撮影した。無料の島が顕微鏡下で検出された一度、消化酵素を希釈する循環システムへのコールド（4℃）RPMI希釈液（Mediatech、ハーンドン、バ​​ージニア州）をフラッシュして停止した。収集し、ヒトアルブミンを添加したM199培地で洗浄した後、組織は、事前に精製数をサンプリングし、精製前のUW液でインキュベートした。ヒト膵島の精製と​​文化：精製工程は、第II部で説明される。

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。このビデオでは、我々は段階的に説明し、人間の膵島を分離するための手順：変更された自動化法を用いて（パートI消化および膵組織のコレクション）。

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

1型糖尿病の管理は、個人にとっても社会にとっても負担が大きく、年間1,000億ドル以上の費用がかかっています。...の広範な使用にもかかわらず、

この手順は、まず正常なドナーの膵臓組織を入手することから始まります。簡潔なトリミング工程の後、拡張した膵臓を均等な大きさに切断し、消化チャンバーに移動させます。膵臓にカニューレを挿入し、自動灌流装置を用いてカニューレからコラゲナーゼ溶液を注入します。最後に、膵臓組織を容量の大きい円錐形チューブに回収し、その後、次回のビデオで紹介する膵島移植に向けてさらに精製します。こんにちは、私はイリノイ大学シカゴ校外科部のHuman Islet Programラボのアメリカン・チーフです。こんにちは、バーバラ・バルベロです。私もHuman Islet Programに所属しています。本日は、ヒト膵島分離の手順について解説します。当施設では、臨床利用に向けた高品質なヒト膵島を回収するためにこの手順を採用しています。それでは始めていきましょう。ヒト膵島（アイレット）の分離は時間に制約がある手順であり、チームワークが必要となるため、この操作を行うには4名の人員が必要です。チームは、膵臓の解剖およびカニュレーションを行う外科医によって率いられます。膵島分離の手順は、チームがUIC膵島分離施設に入った瞬間から始まります。チームメンバーは、遠心分離機などの必要な機器がすべて点検され、電源が入っていることを確認します。また、すべてのフードおよび表面を消毒します。2名の担当者が、カニューレ挿入テーブル、スラッシュマシン消化装置、回路灌流装置、ユニットコープ精製装置、および手術台を設置します。同時に、他のチームメンバー2名が分離に必要な培地を調製します。次に、細菌学用試験管、サンプリングチューブ、評価用チューブおよびプレートを準備します。精製チューブセットを次のように準備します。まず、1本目のチューブを空にし、150 millilitersの位置に印を付けます。2番から12番のチューブにM1 99培地を200 milliliters充填します。この培地にはヒトアルブミンまたは洗浄液を添加し、230 millilitersの位置に印を付けます。最後に、50 milliliterのコニカルチューブ1本に洗浄液を50 milliliters充填します。これらの準備ステップが完了したら、膵臓の準備および灌流を開始します。膵臓の準備および灌流を始めるため、操作者は梱包から臓器を取り出します。外科医は無菌操作を用いて、膵臓を除染テーブルに移します。外科医は60 ccシリンジ1本に元の膵臓保存液を満たし、それを操作者に渡します。操作者はその溶液を用いて、準備済みの調達用細菌学ボトルを満たします。臓器がアイレット分離に適しているかを目視で検査した後、外科医は操作者にコラゲナーゼを準備するよう指示します。Prepareはchoateです。摘出時に膵臓が損傷しているか、解剖学的な異常がある場合は、アイレット（

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ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。修正された自動化された方法を使用して：このビデオでは、我々は人間の膵島の分離（ヒト膵島の精製と​​文化部II）の手順をステップバイステップで説明します。...

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マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

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生存可能な単一細胞を単離するための膵臓組織解剖

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

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このプロトコルは、ルイスラット膵島の外科的収穫、酵素的消化、密度勾配精製のための標準化された方法を説明し、移植や in vitro...

酵素による消化および密度-勾配分離を用いたルイスラットからの膵島の分離と精製

学ぶ 膵島単離法：膵組織をコラゲナーゼ溶液で自動灌流し消化・採取する方法。高品質なヒト膵島を効率的に分離し、移植治療に応用する技術を解説します。

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

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