ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

簡単な方法は、小さな組織サンプルから複数の植物ホルモンの迅速抽出と分析ができるようにその提供されています。手順は、厳粛な精製工程として気相の抽出を使用しています。サンプルは主に生成する化学イオン化（M +1）とGC / MS +イオンによって分析されます。

この手順は、セラミックビーズを使用した植物材料の均質化と、それに続くジクロラールメタン抽出から始まり、有機相が得られます。遠心分離後、サンプルを空気中で乾燥させ、気相抽出のために準備します。気相抽出フィルターからellucianを経た後、質量分析とガスクロマトグラフィーを使用して植物ホルモン分析に進むことができます。

こんにちは、ここサンアントニオにあるテキサス大学生物学部のJUエンゲルバーグ研究室のマリー・エンゲルバーグです。今日は、重要な植物ホルモンの同時定量のための簡単な手順をご紹介します。私たちはこの方法を日常的に使用して、これらのホルモンの変化を監視し、昆虫の報酬技術を計画しています。

また、脂肪酸組成の変化を監視することもできます。それでは始めましょう。抽出のためには、最初に2ミリリットル、スクリューキャップバイアルを準備する必要があります。

これを行うには、400マイクロリットルの抽出溶液と10マイクロリットルのそれぞれの内部標準液を10ナノグラム/マイクロリットルでバイアルに加えます。次に、バイアルを液体窒素で凍結します。凍結後、セラミックビーズをバイアルに加えます。

バイアルがまだ液体窒素に配置されている間に、50〜200ミリグラムの植物材料を追加します。追加された植物材料の重量は、後で新鮮な重量に基づいて正確に定量化できるように、さらに処理する前に推定する必要があることに注意してください。キャップでバイアルをしっかりと閉じる前に、すべての液体窒素が蒸発

均質化中に溶剤や抽出された化合物がこぼれるのを防ぐために、キャップにゴム製のシールが付いていることを確認してください。高速調製またはPSUビーズグラインダーで組織を均質化します。PSUの速度6, 000で30秒間のホモジナイザー。

均質化したら、ホモジナイザーからバイアルを個別に取り出し、キャップを慎重に開けて各サンプルに1ミリリットルのジクロラールメタンを追加し、バイアルを再度しっかりと閉じて均質化し、均質化後6,000で10〜15秒間均質化し、バイアルを卓上遠心分離機に移し、10で水相から有機相を分離します。 000回です。G を 60 秒間押します。相分離後、個々のバイアルから下部の緑色の層をきれいな4ミリリットルのガラスバイアルに移します。

これは、ホルモンと内部標準を含む有機相です。水や上相の移動を避け、マニホールドを介して空気で溶媒を約10〜25分間吹き飛ばします。時間の長さはサンプルによって異なります。

1つのエアフローチップでチェックし、サンプルが乾燥しているかどうかを注意深く確認します。サンプルを過度に乾燥させないように注意してください。サンプルが乾燥すると、サンプル中のカルボン酸含有化合物のメチル化を開始できます。

まず、100マイクロリットルのDエチルエーテルメタノール混合物を各バイアルに9〜1容量加えます。次に、ヘキサンに2モルのトリメチルシルディアスメタン溶液を4マイクロリットル加えます。テフロンで裏打ちされたシリコンセプタムを取り付けたオープントップスクリューキャップでバイアルをすぐに閉じ、バイアルを静かに振って、室温で25〜30分間インキュベートします。

加熱ブロックをオンにして、希望の収集温度に設定します。メチル化化合物の揮発性は、そのサイズと極性基の数によって異なります。温度は80〜200度の範囲であり、30分間のインキュベーション後、ヘキサン中の2モル酢酸溶液を各バイアルに4マイクロリットル添加することにより、メチル化反応を停止します。

これは、望ましくない二次反応を避けるために行われます。気相抽出に使用されるフィルターは手作りです。テフロン管でできています。

片側からは、長さ約4センチのぴったりとしたガラス管が挿入されています。約20〜30ミリグラムの吸収剤を保持するステンレス鋼メッシュの2つのディスクが見えます。メチル化および揮発性植物ホルモンの収集に使用されるフィルターを、200マイクロリットルのメタノールを使用して洗浄します。

次に、フィルターを200マイクロリットルで2回洗浄します ジクロラールメタン。各空気は、フィルターから残った溶媒を乾燥させます。フィルターは、気相抽出による揮発性ホルモンの捕捉に使用できるようになりました。

サンプルの30分間のインキュベーション後、4ミリリットルのバイアルキャップのゴム製セプタムをメスで切断します。これで、抽出された材料を収集して、気相抽出によって植物ホルモンを収集する準備が整いました。洗浄されたフィルターは、毎分約800ミリリットルの流量で個々の真空ラインに接続されます。

次に、フィルターを切断されたセプタムを通してバイアルに挿入します。小さなピペットチップも挿入され、吸気口として機能します。この手順の最初の部分では、フィルターが挿入されたバイアルを直立位置に保持して、バイアル内の液体がフィルターチップに接触してフィルターを汚染しないようにする必要があります。

その後、GCMSは、すべての液体がフィルターを通して蒸発するまで、バイアルを手で保持します。次に、フィルターが取り付けられたバイアルを加熱ブロックに置き、熱蒸発した化合物を3分間収集します。この最後の気相抽出ステップの後、フィルターを取り付けたままのバイアルをラックに置き、冷まします。

フィルターが室温に達したときにインサートが取り付けられた1.5ミリリットルのGCバイアルを準備します。再び、バイアルにジクロラールメタンの150マイクロリットルを入れたループ。フィルターから残りの溶媒を吹き飛ばした後、バイアルはキャップされ、ガスクロマトグラフィー質量分析で分析できるようになります。

分析には、化学イオン化モードで作動する質量分析計にインターフェースされたスプリットスプリットリストインジェクターを備えたガスクロマトグラフを使用し、注入化合物を40°Cに保持したHP one MSカラムで1分間分離します。温度は毎分15°Cから2°Cまで50°Cで10分間、ヘリウムをキャリアガスとして毎分0.7ミリリットルの一定流量でプログラムされています。MSベースの分析では、クワッドベースの質量分析計とイオントラップベースの質量分析計の両方をCIガスとして使用できます。

イソブタンまたはメタノールのいずれかを使用できます。ただし、いずれの場合も、選択したイオンカウントプログラムを作成する前に、イオン化反応のフラグメントを確認する必要があります。CI試薬として、Saturn MS 2200質量分析計とメタノールを組み合わせたバリアントGC 3、900ガスクロマトグラフシステムを使用しています。

私たちのプログラムの説明については、書面によるプロトコルをご覧ください。すべての化合物が、市販されている真正な標準物質との比較によって同定されていることを確認してください。JA、SA、および A BA の定量は、抽出されたピーク面積イオンとそれぞれの内部標準の抽出イオンのピーク面積を相関させることによって行われ、また、使用する植物材料の新鮮重量にも基づいています。

GCM Sファイルからデータを抽出し、いくつかの計算を行った結果、未処理の対照と比較して、エチンはサリチル酸、モン酸、およびアビン酸のかなりの蓄積を誘発することがわかりました。各ホルモンのデータは 1 回の分析から得られたもので、この分析法のマルチプレックスホルモン分析の能力を示しています。ここでは、重要な植物ホルモンやその他のシグナル伝達化合物を抽出し定量するための簡単で効果的な手順をお見せしました。

実行は簡単で、これまでに見たほとんどのツールは、標準的な実験室の材料から簡単に作成できます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。