ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

この手順は、セラミックビーズを用いた植物試料のホモジナイズから始まり、続いてジクロロメタン抽出を行うことで有機相を得ます。遠心分離後、試料を風乾させ、気相抽出の準備をします。気相抽出フィルターから溶出させた後、ガスクロマトグラフィー質量分析法を用いて植物ホルモンの分析に進みます。

こんにちは。テキサス大学サンアントニオ校生物学部のJU Engelberg研究室のMarie Engelbergです。そして、私はJu Engelbergです。本日は、重要な植物ホルモンを同時に定量するための簡便な手順をご紹介します。私たちは、昆虫の報酬系におけるこれらのホルモンの変化をモニタリングするために、日常的にこの手法を用いています。

脂肪酸組成の変化をモニタリングすることも可能です。それでは、始めていきましょう。抽出には、まず2 mLのスクリューキャップ付きバイアルを用意してください。

この操作を行うには、バイアルに抽出液 400 µL と、10 ng/µL の各内部標準物質 10 µL を加えます。次に、バイアルを液体窒素で凍結させます。凍結後、バイアルにセラミックビーズを加えます。

バイアルを液体窒素に浸したまま、植物試料を50から200 mg添加します。後の正確な定量は生重量に基づいたものであるため、さらなる処理に進む前に、添加した植物試料の重量を推定しておく必要があることに注意してください。バイアルにキャップをしっかりと閉める前に、液体窒素が完全に蒸発していることを確認してください。

ホモジナイズ中の溶媒および抽出化合物の漏れを防ぐため、キャップにゴムシールが付いていることを確認してください。FastPrepまたはPSUsビードミルを使用して組織をホモジナイズします。PSUsの場合、速度6,000で30秒間ホモジナイズしてください。

ホモジナイズ後、バイアルをホモジナイザーから個別に外し、キャップを慎重に開けて各サンプルに1 mLのジクロロメタンを加えます。バイアルを再びしっかりと密閉し、6,000 rpmで10〜15秒間ホモジナイズします。ホモジナイズ後、バイアルを卓上遠心機に移し、10,000 ×gで60秒間遠心分離して有機相と水相を分離します。相分離後、各バイアルの下層にある緑色の層を、清潔な4 mLガラスバイアルに移します。

これはホルモンと内部標準物質を含む有機相です。水または上層が混入しないように注意しながら、マニホールドを用いて空気で約10～25分間溶媒を飛ばします。時間はサンプルによって異なります。

単一のエアフローチップを用いて、サンプルが乾燥しているかを慎重に確認します。化合物の損失を招く恐れがあるため、サンプルを乾燥させすぎないように注意してください。サンプルが乾燥したら、サンプル中のカルボン酸含有化合物のメチル化を開始します。

まず、各バイアルにジエチルエーテルとメタノールの混合液（容量比9:1）を100 µL加えます。次に、ヘキサンに溶解した2 Mのトリメチルジアゾメタン溶液を4 µL加えます。直ちにテフロンライナー付きシリコンセプタムを備えたオープントップスクリューキャップでバイアルを密閉し、バイアルを軽く振って室温で25〜30分間インキュベートします。

ヒーティングブロックの電源を入れ、目的の回収温度に設定します。メチル化された化合物の揮発性は、そのサイズや極性基の数によって異なります。温度設定は80から200度の範囲で調整してください。30分間のインキュベーション後、各バイアルに2 Mの酢酸ヘキサン溶液を4 µL添加し、メチル化反応を停止させます。

これは、不要な二次反応を避けるために行われます。気相抽出に使用するフィルターは手製です。これらはテフロンチューブで作られています。

一方の側から、長さ約4cmの適合したガラス管を挿入します。ステンレスメッシュの2枚のディスクが見え、そこには約20～30mgの吸着剤が保持されています。メチル化された揮発性植物ホルモンの回収に使用するフィルターを、200 µLのメタノールで洗浄してください。

次に、フィルターを200 µLのジクロロメタンで2回洗浄します。フィルターから残存する溶媒を風乾させます。これで、フィルターを気相抽出による揮発性ホルモンの捕捉に使用することができます。

サンプルを30分間インキュベートした後、4 mLバイアルキャップのゴムセプタをメスで切り取ります。これで、気相抽出法により植物ホルモンを回収するための抽出物の準備が整いました。洗浄済みフィルターを、流量約800 milliliters per minuteの個別の真空ラインに接続します。

次に、フィルターを切り込みを入れたセプタムを通してバイアルに挿入します。また、空気入口として機能させるために、小さなピペットチップも挿入します。この操作の初期段階では、バイアル内の液体がフィルターチップに接触してフィルターが汚染されるのを防ぐため、フィルターを挿入したバイアルを直立状態で保持する必要があります。

続いて、フィルターを通して液体がすべて蒸発するまで、GC-MS用バイアルを手で保持します。その後、フィルターを装着したままのバイアルを加熱ブロックに載せ、加熱蒸発させた化合物を3分間回収します。この最終的な気相抽出ステップの後、フィルターを装着したままのバイアルをラックに置き、冷却させます。

フィルターが室温に達した時点で、インサート付きの1.5 milliliter GCバイアルを準備します。再び、150 microlitersのジクロロメタンをループを用いてバイアルに注入します。フィルターから残りの溶媒を吹き出した後、バイアルにキャップを閉め、ガスクロマトグラフィー質量分析により分析します。

分析には、化学イオン化モードで動作する質量分析計に接続された、スプリット注入装置を備えたガスクロマトグラフを使用します。注入された化合物は、40 °Cで1分間保持されたHP-1 MSカラムで分離されます。温度プログラムは、ヘリウムをキャリアガスとして0.7 mL/minの一定流量で流しながら、毎分15 °Cずつ250 °Cまで昇温し、その後10分間保持します。MSベースの分析では、四重極型およびイオントラップ型のいずれの質量分析計もCIガスとして使用可能です。

イソブタンまたはメタノールのいずれかを使用できます。ただし、いずれの場合においても、選択イオンカウントプログラムを作成する前に、イオン化反応のフラグメントを確認する必要があります。本手法では、Saturn MS 2200質量分析計を接続したvariant GC 3, 900ガスクロマトグラフシステムを使用し、CI試薬としてメタノールを用います。

プログラムの詳細については、書面によるプロトコルをご参照ください。すべての化合物が、市販の真正な標準品との比較によって同定されていることを確認してください。JA、SA、およびA BAの定量は、抽出イオンのピーク面積をそれぞれの内部標準の抽出イオンのピーク面積と相関させることで行い、また、使用した植物材料の生重量に基づいて算出します。

GCM Sファイルからデータを抽出し、計算を行った結果、未処理のコントロールと比較して、エチンによってサリチル酸、モノニック酸、およびアビック酸が大幅に蓄積することがわかりました。個々のホルモンのデータは1回のランから得られたものであり、本手法がマルチプレックスホルモン分析に有効であることを示しています。以上で、重要な植物ホルモンおよびその他のシグナル伝達化合物を抽出および定量するための、簡便ながら効果的な手順について説明しました。

この手法は簡便に実施でき、これまでにご紹介したツールのほとんどは、標準的な実験器具を用いて簡単に作製することが可能です。以上で解説を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。