Name: ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-15T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶ植物ホルモンの迅速抽出とGC/MSによる定量分析法。セラミックビーズを用いたホモジナイゼーションと気相抽出を組み合わせ、少量組織サンプルから複数の植物ホルモンを同時にモニタリングできます。

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<ol><li>まず、抽出のために2ミリリットルのスクリューキャップ付きバイアルを準備する必要があります：400ul抽出バッファーを加え（1 - プロパノール：H2O：濃塩酸2:1:0.002体積/体積/体積）とそれぞれの内部標準の10μlのは（10ng/μl ）バイアルに。液体窒素で凍結し、セラミックビーズを追加。 </li><li>バイアルがまだ液体窒素内に位置している間（50〜200mgの間）植物材料を追加します。追加された植物材料の重量は、生体重に基づいて正確な定量化、のために後で可能にするためにさらに処理する前に推定する必要があることに注意してください。 </li><li>すべての液体窒素がしっかりとキャップでバイアルを閉じる前に蒸発されていることを確認します。溶剤の流出を防ぐためにキャップがゴム製のシールを持っている必要があることに注意して、したがって、均質化中に化合物を抽出した。 </li><li> 30秒のための6000の速度（Precellys用）でFastPrepまたはPrecellysビードのグラインダーのホモジナイザーで組織をホモジナイズ。 </li><li>個別にホモジナイザーからバイアルを取り外し、慎重にキャップを開き、各試料にジクロロメタンの1mlを加える。しっかりと再びバイアルを閉じて、6000（Precellys）で10 - 15秒のために再度ホモジナイズする。 </li><li>卓上型遠心機にバイアルに移し、60秒のための10.000xgで水相から有機相を分離。 </li><li>相分離の後にクリーンな4ミリリットルガラスバイアルに、個々のバイアルから下の緑色の層（有機相、ホルモンおよび内部標準を含む）を転送する。水（上相）の転送を避ける。また、酢酸エチル、ジクロロメタンの代わりに使用できます。その場合、ethyacetateフェーズでは、上位層（緑色）になると、今削除して、新鮮な4ミリリットルガラスバイアルに移し方が簡単ですでしょう。前と同様に、水の移動を避ける。 </li><li> 10月25日分程度（サンプルに依存）のためのマニホールドを通して空気と溶剤を吹き飛ばす、サンプルが乾燥している場合（慎重に）単一の気流の先端に確認してください。これは化合物の損失を引き起こす可能性のための過乾燥するサンプルは、しないでください。 </li><li>サンプルは乾燥されると我々は、カルボン酸含有我々のサンプル中の化合物のメチル化を開始できます。最初に、diethyether /メタノール混合物（9:1 vol / vol）の100μlの2Mトリメチルシリルジアゾメタン溶液（ヘキサン、シグマアルドリッチで）の4μlに続く各バイアルに添加されています。バイアルは直ちにテフロンライニングシリコンセプタムを装備したオープントップスクリューキャップで閉じられます。穏やかに振盪し、25〜30分間室温でインキュベートする。 </li><li>手順9を終えた後、目的のコレクションの温度で加熱ブロックとセットの電源を入れます。メチル化化合物の揮発性は、その大きさではなく、= O、- OH、及び- NHのような他の、より多くの極性基に依存する。ジャスモン酸とサリチル酸のメチルエステルのコレクションの温度に対して約80 ° Cで十分である、一方、例えば、C18脂肪酸のような他の化合物、ジャスモン酸 - アミノ酸複合体、コロナチン、および12 ​​- オキソ- phytodienoic酸メチルエステルの間の温度を必要とする180から200 ° Cを効果的に揮発する。 </li><li> 30分インキュベーションした後にメチル化反応は、不要な副反応を避けるために停止する必要があります。これは、各バイアルに2M酢酸-溶液（ヘキサン中）4μlを加えることにより行われます。キャップと短いボルテックスでバイアルを閉じた後、サンプルは別の30分間インキュベートされている。 </li><li>この気相抽出に使用されるフ​​ィルタは、ハンドメイドと表示されるフォームで市販されていない。彼らは、片側から約4cm長さのよくフィットガラス管が挿入されている外側のテフロンチューブ（7〜8センチメートル長い約）、で構成されています。それは内側のガラス管に到達するまでテフロンチューブの反対側にステンレスメッシュディスクは、管の内部に押されていることへの約20 - 30mgの吸着剤（SuperQ 100分の80（販売終了）またはHayeSep ® Q80/100のどちらか）追加されます。別のステンレス鋼のメッシュディスクが挿入され、最終的にガラスチップは、それによって慎重に吸収剤でステンレスメッシュディスクを押して、テフロンチューブにプッシュされています。詳細な画像フィルタを図1に示されています。 <img src="/files/ftp_upload/1127/1127fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 </li><li>ステップ11のインキュベーション時間の間に、このようにメチル化し、揮発性の植物ホルモンのコレクションのためのフィルタは、200ulのジクロロメタン各2回洗浄後、メタノールの最初の200ulを使用して洗浄す​​る必要があります、と。フィルタ内の残りの溶剤を空気で吹き飛ばします。フィルタは、今気相抽出を通じて揮発性ホルモンの捕捉に使用することができます。 </li><li>インキュベーションの30分後に4ミリリットルバイアルキャップのラバーセプタムをメスでカットされます。気相抽出によって植物ホルモンを収集するにはクリーニングフィルターは約800ml/minの流量で、個々の真空ラインに接続されています。次に、フィルターをカットセプタムバイアルに挿入されます。小さなピペットチップは、空気入口として機能するように挿入されます。この手順の最初の部分の間に挿入されたフィルタを使用したバイアルは、保持する必要がその後、フィルタともGC / MSを汚染するフィルターチップ、と接触して得るためにバイアル内の液体のいずれかを避けるために、直立位置。すべての液体がフィルターを介して蒸発するまで、バイアルを手で保持されています。その後、付属のフィルター付きバイアルを加熱ブロック上に配置し、熱蒸発化合物は、3分のために収集されます。システムの基本コンポーネントと同様にセットアップを図1に示されている。この最後の蒸気相抽出工程の後にまだ接続されているフィルタを使用してバイアルをラック上に配置し、クールダウンに許可されています。 </li><li>フィルタは、再び室温に達したときは、インサートを装着した1.5​​ mlのGC -バイアルにジクロロメタンの150ミリリットルで溶出されています。バイアルに蓋をし、GC / MSによって分析されているフィルタから、残りの溶剤を吹き変える。 </li></ol>スプリット/化学イオン化モード（CI）で動作質量分析計とのインターフェーススプリットレスインジェクター（スプリットレスモード250℃、注入量1μ）の分析に使用する必要がある装備、ガスクロマトグラフ）。化合物は、40で開催されたHP - 1MS列（30M X 0.25ミリメートルX025μm）·キャリアとしてヘリウム注入後1分間、C、およびその後15でプログラムされた温度° C / minで250℃まで（10分間）、上で分離されていますガス（定流量0.7ml/min）。 MSベースの分析の両方の場合は、quadropole（例えば、アジレントHP5973）とイオントラップベース（例：バリアンサターン2200）質量分析計を使用することができます。 CIガスイソブタン（ガスのタンクに来る）やメタノール（液体タンクからの蒸気が使用されている）のどちらかを使用することができますよう、しかし、それぞれのケースでイオン化反応のフラグメントは、選択されたイオン数（SIC）プログラムの前にチェックしてください作成されます。我々は、CIの試薬 ​​としてバリアンGC 3900/Saturn MS 2200のシステムおよびメタノールについては、次のプログラムに使用されている：5.00 - 11.30minイオン（M +1）+ 153〜158（サリチル酸メチル153、メチル2 H 5 -サリチル酸）; 11.30 - 13.30minイオン（M +1）+ 207〜228（ジャスモン酸メチル207と225、メチルジヒドロジャス209および227）、13.30 - 16.30minイオン（M +1）+ 237〜300（メチルアブシジン酸261、メチル2 H 6 -アブシジン酸267（アブシジン酸は、主に[MH 2 O +1] +イオンを生成する）。すべての化合物は、本物の市販の標準との比較によって識別されるべきである。JA、SA、およびABAの定量はピーク面積を相関させることによって行われます。それぞれの内部標準のピーク面積（抽出されたイオン）と（イオンを抽出）し、また使用される植物材料の生体重に基づいている。

<ol><li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vapor+phase+extraction+in+metabolic+profiling+of+phytohormones+and+other+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites.</a> Plant Journal. 39, 790-808 (2004).</li>
<li>Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+signals+prime+plants+against+insect+herbivore+attack%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Airborne signals prime plants against insect herbivore attack.</a> PNAS. 101, 1781-1785 (2004).</li>
<li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O&acute, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+phytohormones%2C+phytotoxins%2C+and+volatile+organic+compounds+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants.</a> PNAS. 100, 10552-10557 (2003).</li>
<li>Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Jasmonic+acid+and+Salicylic+acid+by+Vapor+Phase+Extraction+and+Gas+Chromatography+-+Chemical+Ionization-Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).</li>
</ol>

ここで紹介する方法は、化合物のメチル化、サイズおよび化合物の化学的性質が抽出されることを防ぐしないことを提供し、気化をシグナリング植物の広い配列のために確実に動作することが実証されています。また、それは、本明細書に記載されているメチル化法は、誘導体化の唯一の方法ではありません。 Silyllationとアセチル化は、別の方式とプロトコルであり、簡単にオンラインで見つけることができます。 質量分析計は、プロセスからあまりにも多くの不要なイオンを排除するために、実行中に記録されている限定すべき質量範囲を監視する単一イオンに対応していない場合。例えば、ジャスモン酸（JA）とその内部標準ジヒドロジャスモン酸（dhJA）は、2つのメジャー（M +1）+イオン、JAのための207と225、およびメタノールと化学イオン化時のdhJAのための209及び227を生成する。これら2つの主要な（M +1）+の質量（JA用207、225、dhJAのための209および227は）ので、同じ豊富rationfor JAとdhJAを持っていない、彼らは両方の抽出および定...

ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

植物ホルモンと関連するシグナリング化合物は、種々の環境刺激やストレスに対する植物の応答の調節に重要な役割を果たす。最も深刻なストレスの中で昆虫草食、病原体感染、および乾燥ストレスがあります。これらのそれぞれについて、その特定のホルモンのセットおよび/またはそれらの組み合わせを強調することにより、植物の生存を確保する、微調整応答することが知られています。これらの応答の調節に関与する主要なホルモンは、ジャスモン酸（JA）、サリチル酸（SA）、およびアブシジン酸（ABA）です。より個々のホルモンの役割だけでなく、これらの応答の間に彼らの潜在的な相互作用を理解するには、空間的な形でだけでなく、時間的にそれらの存在量の変化を監視する必要があります。これらおよび他のシグナリング化合物の、簡単で、感度が高く、再現性の定量化のために我々は気相抽出とガスクロマトグラフィー/質量分析（GC / MS）分析（1、2、3、4）に基づく方法を開発した。酸性水溶液、1 - プロパノールによる植物組織からこれらの化合物を抽出した後、ジクロロメタンと混合カルボン酸含有化合物は、メチル化熱で揮発し、高分子吸収剤で収集されます。サンプルバイアルに溶出後の検体は、ガスクロマトグラフィーによって分離され、化学イオン化質量分析法で検出。適切な内部標準の使用は、分析対象物と内部標準のピーク面積を関連付けることによって、単純な定量が可能になります。

簡単な方法は、小さな組織サンプルから複数の植物ホルモンの迅速抽出と分析ができるようにその提供されています。手順は、厳粛な精製工程として気相の抽出を使用しています。サンプルは主に生成する化学イオン化（M +1）とGC / MS +イオンによって分析されます。

植物ホルモンおよび関連するシグナル伝達化合物は、さまざまな環境刺激やストレスに対する植物の応答調節において重要な役割を果たしている。...

この手順は、セラミックビーズを用いた植物試料のホモジナイズから始まり、続いてジクロロメタン抽出を行うことで有機相を得ます。遠心分離後、試料を風乾させ、気相抽出の準備をします。気相抽出フィルターから溶出させた後、ガスクロマトグラフィー質量分析法を用いて植物ホルモンの分析に進みます。こんにちは。テキサス大学サンアントニオ校生物学部のJU Engelberg研究室のMarie Engelbergです。そして、私はJu Engelbergです。本日は、重要な植物ホルモンを同時に定量するための簡便な手順をご紹介します。私たちは、昆虫の報酬系におけるこれらのホルモンの変化をモニタリングするために、日常的にこの手法を用いています。脂肪酸組成の変化をモニタリングすることも可能です。それでは、始めていきましょう。抽出には、まず2 mLのスクリューキャップ付きバイアルを用意してください。この操作を行うには、バイアルに抽出液 400 µL と、10 ng/µL の各内部標準物質 10 µL を加えます。次に、バイアルを液体窒素で凍結させます。凍結後、バイアルにセラミックビーズを加えます。バイアルを液体窒素に浸したまま、植物試料を50から200 mg添加します。後の正確な定量は生重量に基づいたものであるため、さらなる処理に進む前に、添加した植物試料の重量を推定しておく必要があることに注意してください。バイアルにキャップをしっかりと閉める前に、液体窒素が完全に蒸発していることを確認してください。ホモジナイズ中の溶媒および抽出化合物の漏れを防ぐため、キャップにゴムシールが付いていることを確認してください。FastPrepまたはPSUsビードミルを使用して組織をホモジナイズします。PSUsの場合、速度6,000で30秒間ホモジナイズしてください。ホモジナイズ後、バイアルをホモジナイザーから個別に外し、キャップを慎重に開けて各サンプルに1 mLのジクロロメタンを加えます。バイアルを再びしっかりと密閉し、6,000 rpmで10〜15秒間ホモジナイズします。ホモジナイズ後、バイアルを卓上遠心機に移し、10,000 ×gで60秒間遠心分離して有機相と水相を分離します。相分離後、各バイアルの下層にある緑色の層を、清潔な4 mLガラスバイアルに移します。これはホルモンと内部標準物質を含む有機相です。水または上層が混入しないように注意しながら、マニホールドを用いて空気で約10～25分間溶媒を飛ばします。時間はサンプルによって異なります。単一のエアフローチップを用いて、サンプルが乾燥しているかを慎重に確認します。化合物の損失を招く恐れがあるため、サンプルを乾燥させすぎないように注意してください。サンプルが乾燥したら、サンプル中のカルボン酸含有化合物のメチル化を開始します。まず、各バイアルにジエチルエーテルとメタノールの混合液（容量比9:1）を100 µL加えます。次に、ヘキサンに溶解した2 Mのトリメチルジアゾメタン溶液を4 µL加えます。直ちにテフロンライナー付きシリコンセプタムを備えたオープントップスクリューキャップでバイアルを密閉し、バイアルを軽く振って室温で25〜30分間インキュベートします。ヒーティングブロックの電源を入れ、目的の回収温度に設定します。メチル化された化合物の揮発性は、そのサイズや極性基の数によって異なります。温度設定は80から200度の範囲で調整してください。30分間のインキュベーション後、各バイアルに2 Mの酢酸ヘキサン溶液を4 µL添加し、メチル化反応を停止させます。これは、不要な二次反応を避けるために行われます。気相抽出に使用するフィルターは手製です。これらはテフロンチューブで作られています。一方の側から、長さ約4cmの適合したガラス管を挿入します。ステンレスメッシュの2枚のディスクが見え、そこには約20～30mgの吸着剤が保持されています。メチル化された揮発性植物ホルモンの回収に使用するフィルターを、200 µLのメタノールで洗浄してください。次に、フィルターを200 µLのジクロロメタンで2回洗浄します。フィルターから残存する溶媒を風乾させます。これで、フィルターを気相抽出による揮発性ホルモンの捕捉に使用することができます。サンプルを30分間インキュベートした後、4 mLバイアルキャップのゴムセプタをメスで切り取ります。これで、気相抽出法により植物ホルモンを回収するための抽出物の準備が整いました。洗浄済みフィルターを、流量約800 milliliters per minuteの個別の真空ラインに接続します。次に、フィルターを切り込みを入れたセプタムを通してバイアルに挿入します。また、空気入口として機能させるために、小さなピペットチップも挿入します。この操作の初期段階では、バイアル内の液体がフィルターチップに接触してフィルターが汚染されるのを防ぐため、フィルターを挿入したバイアルを直立状態で保持する必要があります。続いて、フィルターを通して液体がすべて蒸発するまで、GC-MS用バイアルを手で保持します。その後、フィルターを装着したままのバイアルを加熱ブロックに載せ、加熱蒸発させた化合物を3分間回収します。この最終的な気相抽出ステップの後、フィルターを装着したままのバイアルをラックに置き、冷却させます。フィルターが室温に達した時点で、インサート付きの1.5 milliliter GCバイアルを準備します。再び、150 microlitersのジクロロメタンをループを用いてバイアルに注入します。フィルターから残りの溶媒を吹き出した後、バイアルにキャップを閉め、ガスクロマトグラフィー質量分析により分析します。分析には、化学イオン化モードで動作する質量分析計に接続された、スプリット注入装置を備えたガスクロマトグラフを使用します。注入された化合物は、40 °Cで1分間保持されたHP-1 MSカラムで分離されます。温度プログラムは、ヘリウムをキャリアガスとして0.7 mL/minの一定流量で流しながら、毎分15 °Cずつ250 °Cまで昇温し、その後10分間保持します。MSベースの分析では、四重極型およびイオントラップ型のいずれの質量分析計もCIガスとして使用可能です。イソブタンまたはメタノールのいずれかを使用できます。ただし、いずれの場合においても、選択イオンカウントプログラムを作成する前に、イオン化反応のフラグメントを確認する必要があります。本手法では、Saturn MS 2200質量分析計を接続したvariant GC 3, 900ガスクロマトグラフシステムを使用し、CI試薬としてメタノールを用います。プログラムの詳細については、書面によるプロトコルをご参照ください。すべての化合物が、市販の真正な標準品との比較によって同定されていることを確認してください。JA、SA、およびA BAの定量は、抽出イオンのピーク面積をそれぞれの内部標準の抽出イオンのピーク面積と相関させることで行い、また、使用した植物材料の生重量に基づいて算出します。GCM Sファイルからデータを抽出し、計算を行った結果、未処理のコントロールと比較して、エチンによってサリチル酸、モノニック酸、およびアビック酸が大幅に蓄積することがわかりました。個々のホルモンのデータは1回のランから得られたものであり、本手法がマルチプレックスホルモン分析に有効であることを示しています。以上で、重要な植物ホルモンおよびその他のシグナル伝達化合物を抽出および定量するための、簡便ながら効果的な手順について説明しました。この手法は簡便に実施でき、これまでにご紹介したツールのほとんどは、標準的な実験器具を用いて簡単に作製することが可能です。以上で解説を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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ストレス応答時には植物ホルモンのモニタリング

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