Name: シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶシナプス電位の光刺激法。ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部でChannelrhodopsin2を用いてシナプス生理を研究・教育に活用する簡便で低コストな手法を解説します。

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この作品は、健康補助RO1GM - 33205およびLCグリフィスへMH - 067284の国民の協会によっておよびNJホーンスタインのブランダイス大学の夏学部研究奨学金によってサポートされていました。ウッズホール、マサチューセッツ州：このテクニックのための予備実験は、2008年ニューラルシステムと行動のサマーコース（R25 MH059472 NIMH助成金）の一環として、海洋生物学研究所で実施した。

パート1：動物のケアと遺伝的交雑<ol><li> UAS - ChR2と標準のフライのメディア8を含む別のボトルにOK371 - GAL4フライラインを維持する。 </li><li> OK371 - GAL4フライラインとUAS - ChR2行の男性の処女を収集する。 </li><li> 1mMの全トランスレチナール（ATR）と混合標準フライメディアを含むバイアルに雄と雌の両方を置く。 ATR食べ物は〜1分間電子レンジで最初の溶融、通常のフライのメディアによってなされるべきである。一度溶けた、1分間に約30秒間の冷却し、ハエのメディアのすべての10 mlの100％EtOH中100mMのATRの100μlを追加することができます。その後、氷上に置きますバイアル、4で暗いエリアで店舗℃に</li><li>ハエの仲間を聞かせて22から25に暗いエリアで産卵℃に</li><li> 3齢幼虫が見えるようになるまで3-4日待って、その時点で、成人のハエ処分する。 </li></ol>パート2：リグのセットアップ<ol><li>青色LEDへの10倍解剖スコープアイピース（我々の場合で、カールツァイス社、www.zeiss.com、ソーンウッド、ニューヨーク州から）、ヒートシンクの光源（トールラボ、www.thorlabs.com、ニュートン、ニュージャージー州を取り付けます）。ポストとクランプ付きマグネットベースに取り付けます。光源によって生成された電気的ノイズを減らすために電気的に接地されたシールドとヒートシンクをカバーしています。 </li><li>電気生理学リグのエアテーブル上に光源のある場所マグネットベース。 </li><li>回路を制御し、外部電圧源（Powerlab 4月30日、ADInstruments、www.adinstruments.com、コロラドスプリングズ、コロラド州）に制御回路を接続するための光源を接続してください。 </li><li>青色光をアクティブにする回路を制御するために1 - 5Vのパルスを与える。 </li><li>青色光ビームは幼虫の解剖によって占有される領域に焦点を当てされるまで、マグネットベースと光源を調整します。 </li></ol>パート3：解剖<ol><li> sylgardが並ぶ料理の床にカ所0.1ミリメートル虫ピン。 </li><li>ペトリ皿、プラスチックへの食品のメディアや場所から第3齢幼虫を削除します。 </li><li>食べ物を削除するには生理食塩水で幼虫を洗浄します。 </li><li>プルピンの近くに皿を解剖し、½レベルに生理食塩水追加の場所の幼虫。 </li><li>オリエント幼虫は動物の背側表面に沿って実行している2つの銀色のチューブ（気管）を参照できるようにする。 </li><li>気管チューブの間に尾に直接大きなピンを挿入します。縦に体を伸ばして確認してから、幼虫を押しながら、その頭に第二大ピンを配置します。 </li><li>尾の近くに小さな切開を加える、と体の長さをそれを継続する。誤って腹神経および/または体壁の筋肉を切断しないようにハサミの先端がそのよう提起していることを確認します。 </li><li>動物の四隅に置いて4本のピンは、現在開いている中央部です。フィレット動物をするように解剖皿にそれらを設定します。ピンの準備が出教えた。 </li><li>鉗子やハサミを使用して、動物の内臓、気管および脂肪体を除去。 </li><li>生理食塩水で準備をすすぐ。 </li><li>前頭葉（図Aに見られる）と準備の腹側神経節を見つけます。 </li><li>マイクロはさみを使用して、慎重にちょうど前頭葉の後ろの腹側神経節を介してカット。 </li></ol>パート4：筋肉の記録と青色光の刺激<ol><li>電子電極プラー（サッタインスツルメンツ）を使用して10月20日μω電極を引き出します。 </li><li> 3 M KClで引っ張ら電極を埋める。 </li><li>場所は、電気生理学リグ上で解剖顕微鏡下で幼虫の予備校の近くにマイクロマニピュレータと電極ホルダーと操縦電極の先端に電極を埋め。 </li><li>任意の体の壁のセグメント（図A）に筋6（M6）を識別する。 </li><li>慎重にM6に電極を挿入し、迅速な過分極を監視します。筋肉静止膜電位は-30 mVから-70 mVにどこにする必要があります。 </li><li>解剖準備が光ビームの中央になるように青い光を調整します。 </li><li>回路を制御するために20から100ミリ秒の電圧パルスを与える。段階的に回路を制御するために供給される電圧を増加させる。筋細胞（図1B）における興奮性接合部電位を監視。 </li></ol>代表的な結果： 図1Aは、レコーディングのセットアップとフィレット作成の概略を示しています。図1Bは、短い光パルスにより誘発される典型的なEJPを示しています。示すように、EJPの振幅は、支配するM6の両方に知られている2つの運動ニューロンから振幅が​​加算される。より低い光強度のみアクティブに1つのモータユニット（データは示さず）。 <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="図1" width="600" height="373" /> 図1：細胞内記録のリグのと青色LED付き）一般的な回路図。脳（BR）は、腹側神経節（VG）のリズミカルな活性を阻害するために削除されます。 ChR2は、GAL4 - UASシステムを使用して運動ニューロンに発現している。 M6筋肉からB）細胞内記録。 40ミリ青色の光パルスは、（127μW/ mm 2の時）確実にM6に大きなシナプス電位（アスタリスク）を呼び起こす。

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

我々は、開示に関心の競合はありません。

重要なステップは、筋細胞の初期の解剖と入力の両方を含む。最初の解剖中に神経が切断されたり、筋肉が損傷している場合には、実験の残りを継続することは困難である。解剖時に、1つは、背側切開中に可能な限り上方解剖ハサミを角度に非常に慎重でなければならない。筋細胞に入る第二の重要なステップ、中に、1つは、過去の過分極〜30 mVのために監視しなければなりません。 -30 mVの上記の値は、電極が筋肉の細胞内でまたは不健康な細胞に正しくどちらかではないことを示している。

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Minutens ピン</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neuroprobe 細胞内増幅器およびヘッドステージ</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Powerlab 4/30 データ収集システム&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Grass スティミュレーター</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>デスクトップコンピュータ</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>解剖用顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>光源</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-Trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; ハエ</td><td>Bloomington Stock center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; ハエ</td><td>Fiala lab, Griffith lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED コントローラ回路</td><td>Griffith labにて自作</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;構成部品： &lt;br/&gt;1. 200 mA Buck Puck&lt;br/&gt;2. 青色 LED&lt;br/&gt;3. 絶縁電線&lt;br/&gt;4. 回路ブレッドボード&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>LED ヒートシンク</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>エアテーブル</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>Griffith labにて自作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Leitz M マイクロマニピュレーター</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>電極プラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>0.8mM Ca2+ 添加 HL 3.1 生理食塩水</td><td></td><td></td><td>組成 (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0.8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:4 Sucrose:115&lt;br/&gt; NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;: 10 Trehalose: 5 HEPES</td></tr><tr><td>微小解剖器具</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

シナプス電位のchannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋標本では、シナプスの生理学を研究するための有用なツールであることが実証されています<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;。現在のところ、これだけの準備で興奮接合部の電位（EJPsを）呼び起こす可能なことを意味吸引電極の使用を含む。研究と教育研究所の両方で、学生はしばしば困難刺激電極のこのタイプを操縦し、操作している。本研究では、我々は、リモートで吸引電極を使用せず幼虫のNMJでのシナプス電位を刺激する方法を示します。 channelrhodopsin2（ChR2）を発現することにより<sup&gt; 4,5,6</sup&gt;の<em&gt;ショウジョウバエ</em使用して&gt;運動ニューロン<em&gt; GAL4 - UAS</em&gt;システム<sup&gt; 7</sup&gt;、および基本的な電気生理学のリグにマイナーな変更を加える、我々は、青色光のパルスでEJPsを確実に喚起することができた。この手法は、学生のリグの練習時間と資源が限られている神経生理学の教授のラボで特定の使用の可能性があります。

このプロシージャは、神経筋接合部（NMJ）の光パルスでシナプス電位を惹起する青色光活性化藻類チャネルと細胞特異的遺伝子発現のツールを使用しています<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫。この手法は、安価で研究と教育研究所のシナプス生理学研究のための吸引電極の刺激に代わる使いやすいです。

シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部

ショウジョウバエ幼虫の神経筋標本は、シナプス生理学を研究するための有用なツールであることが証明されています1,2,3。現在、利用可能な唯一の手法は...

この手順は、まずショウジョウバエを育成することから始めます。all-transレチノールを含む餌を用いて、適切なジェノタイプを持つ3齢幼虫を育てます。各幼虫の頭部と尾部をピンで固定します。次に、FLAを平らにします。その後、リズム的な運動活動を停止させるため、脳と後神経を切断します。続いて、コントロールボックス付きの青色LED光源を調整し、標本に焦点を合わせます。最後に、鋭い電極を使用して筋肉6を刺します。次に、電圧源を用いて光パルスを照射します。こんにちは。ブランダイス大学生物学部のLeslie Griffith博士の研究室のNicholas Marsteinです。こんにちは、GriffithラボのStefan Pulverです。本日は、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部において、channel root absent twoを用いてシナプス電位を誘発させる手順をご紹介します。当研究室では、ショウジョウバエのシナプス生理学を研究するためにこの手法を用いています。また、これを学生へのシナプス生理学の指導や教育実習にも利用しています。それでは、始めていきましょう。このプロトコルの準備として、UAS channel redsin twoと3 7, 1 gal fourのショウジョウバエ系統を、標準的なショウジョウバエ培地を入れた個別のボトルで維持してください。UAS channel redsinの2系統から、処女 flies および雄を、3 7、1 gal、four fly linesから採取します。次に、1 mMのall trans retinol（ATR）を混合したフライ培地を作製します。そのためには、通常のフライ培地を電子レンジで約1分間加熱して溶解させます。培地を融解させた後、30〜60秒ほど冷却し、ショウジョウバエ培地10 mLあたり、100%エタノールに溶解した100 mMのa TRを100 µL添加します。a TR培地を入れたバイアルの準備が整ったら、収集したオスとメスをそれぞれのバイアルに入れます。バイアルを22〜25 °Cの暗所に置き、ハエに交配させ卵を産ませ、3齢幼虫が確認できるまで4〜5日間待ちます。この時点で、成虫のハエを処分できます。これで、電気生理学装置のセットアップに進む準備が整いました。解剖顕微鏡の接眼レンズを、ヒートシンク付きの青色LED光源に取り付けます。ポストとクランプを使用して、接眼レンズとLED光源にマグネットベースを取り付けます。マグネットベースを電気生理学装置のエアテーブル上に配置します。次に、光源を制御回路に接続し、その制御回路を外部電源に接続します。AD Instruments社製のPowerLab電気生理学データ収集システムからの電圧出力を利用します。電圧源に接続したら、制御回路に1〜5 Vのパルスを与えて青色光を点灯させ、青色光のビームが幼虫の解剖部位に集中するように、マグネットベースと光源を調整します。適切に調整した後、幼虫の解剖に移行します。解剖を始めるには、 agarをライニングしたディッシュの底に0.1 millimeterのピンを6本刺します。食餌培地からstar larvaeを3匹取り出し、プラスチック製のペトリ皿に移します。幼生に付着している餌を取り除くため、生理食塩水で幼生を洗浄します。次に、幼虫を解剖皿のピンの近くに置き、皿の半分まで生理食塩水を満たします。ここで、動物の背面Cに沿って走る2本の銀色の管が見えるように幼虫の向きを調整してください。この銀色の管が気管です。大きなピンを、気管の間から尾部に直接刺します。幼虫を固定し、2本目の大きなピンを頭部に刺します。この際、ピンを刺しながら体を縦方向に伸ばしてください。ハサミを使用して、尾の近くに小さな切開を加えます。そのまま体の長さに沿って切開を続けます。この際、腹側神経や体壁筋を傷つけないよう、ハサミの先端を浮かせて切開してください。動物の四隅に4本のピンを刺します。次に、中央部分を開きます。動物をフィレ状に広げるようにして、ピンを解剖皿に固定します。また、ピンセットとハサミを用いて操作することを教えるため、標本を固定します。動物の消化管、気管、および脂肪体を摘出します。その後、標本を生理食塩水で洗浄します。洗浄後、マイクロシザーを用いて、サンプルの前脳葉および腹側神経節を確認します。前脳葉の直後にある腹側神経節を慎重に切断します。解剖が完了したら、青色光刺激と筋肉記録に進みます。筋記録を行うために、抵抗値が10から20 MΩの電極を引き出します。電子電極プラーを用いて、引き出した電極内に3 MのKClを満たします。充填した電極を電極ホルダーに装着します。次に、リグ上の解剖顕微鏡下に幼虫の標本を配置します。青色光を調整し、解剖した標本が光線の中心にくるようにします。マイクロマニピュレーターを用いて、幼虫の体壁セグメントのいずれかにある第6筋（M6）を特定し、電極をM6に慎重に挿入して、筋肉の急速な過分極を確認します。静止膜電位は-30 mVから-70 mVの範囲内である必要があります。電極が適切に挿入されたら、制御回路に20〜100 msの電圧パルスを与えます。制御回路に供給する電圧を段階的に増加させてください。筋細胞における興奮性接合後電位を確認します。ここでは、短時間の光パルスによって誘発された興奮性接合後電位を示す代表的な結果を提示します。ここに示されている興奮性接合後電位の振幅は、共に活動していることが分かっている2つの運動ニューロンからの合計振幅です。M 6。光の強度を低くするか、照射時間を短くすることで、単一の運動ニューロンからの振幅がより小さい興奮性接合後電位を抽出できます。ここでは、カエル（oph）の神経筋接合部において、チャネルロドプシン2を介したシナプス電位の刺激を行う方法を示しました。この手順を行う際は、解剖中に標本の体壁を傷つけないように注意することが重要です。また、解剖直後は標本が過剰に興奮している場合がありますが、時間が経過するにつれて静まり、良好な記録が可能になることを覚えておいてください。筋肉に電極を刺入する際は、第一層の筋肉を超えて体壁まで達しないよう注意してください。電極が体壁に刺さっている場合、超分極電位が観察されることがありますが、実際には筋細胞内にいない可能性があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

channelrhodopsin2-mediated-stimulation-synaptic-potentials-at

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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