シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部
2009年3月16日
このプロシージャは、神経筋接合部（NMJ）の光パルスでシナプス電位を惹起する青色光活性化藻類チャネルと細胞特異的遺伝子発現のツールを使用していますショウジョウバエ幼虫。この手法は、安価で研究と教育研究所のシナプス生理学研究のための吸引電極の刺激に代わる使いやすいです。
この手順は、ショウジョウバエの成長から始まります。第三に、すべてのトランスレチノールを含む食品に適切な遺伝子型を持つインスターウジ。各ウジは頭と尾にピンで留められています。
次にFLAフラット。次に、脳と後神経を切断して、リズミカルな運動活動を停止します。次に、コントロールボックス付きの青色LED光源を調整し、準備に集中します。
最後に、鋭利な電極を使用してマッスル6を突き刺します。次に、電圧源を使用して光パルスを送達します。こんにちは、ブランダイス大学生物学部のレスリー・グリフィス博士の研究室のニコラス・マースタインです。
こんにちは、同じくグリフィス研究所のステファン・パルバーです。今日は、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部に2つのチャネルルートが存在しないシナプス電位を呼び起こす手順を示します。私たちの研究室では、この手順を使用してシナプス生理学とショウジョウバエを研究しています。
また、シナプス生理学やティーチングラボの教育にも使用しています。それでは始めましょう。このプロトコルを開始するには、UASチャネルを2つおよび3、7、1ガロンの4つのフライラインで、標準的なフライメディアを含む別々のボトルに維持します。
UASチャネルredsinから、大丈夫、3 7、1ガロン、4つのフライラインとオスから処女を収集します。2行。次に、1ミリモル、すべてのトランスレチノールまたは TR.To と混合されたフライ培地を作成し、この溶融レギュラーフライ培地を電子レンジで約1分間行います。
溶かしたら、培地を約30〜60秒間冷まし、次にフライ培地10ミリリットルごとに100%エタノール中のTR100マイクロリットルを100ミリリットル加えます。TR培地を含むバイアルの準備ができたら、採取したオスとメスを各バイアルに入れます。バイアルを摂氏22〜25度の暗い領域に置き、ハエが交尾して卵を産むのを、スターラルバスティックの3番目が見えるまで4〜5日待ちます。
この時点で、成虫のハエを処分することができます。これで、電気生理学リグのセットアップを進める準備が整いました。解剖スコープの接眼レンズをヒートシンク付きの青色LED光源に取り付けます。
ポストとclを使用しますamp 接眼レンズとLED光源に磁気ベースを取り付けます。磁気ベースを電気生理学リグのエアテーブルに置きます。次に、光源を制御回路に接続し、次に制御回路を外部電圧源に接続します。
AD機器製のPower Lab Electrophysiology Data Acquisition Systemから出力される電圧を利用しています。電圧源に接続したら、制御回路に1〜5ボルトのパルスを与えて青色光を活性化し、青色光ビームが幼虫の解剖によって占められる領域に集中するまで磁気ベースと光源を調整します。適切な調整を行った後、幼虫の解剖に進む準備が整いました。
解剖を開始するには、6本の0.1ミリメートルピンをソガーで裏打ちされた皿の床に配置します。スター幼虫の3分の1を食品媒体から取り出し、プラスチック製のペトリ皿に入れます。幼虫を生理食塩水ですすいで、幼虫に付着している食物をすべて取り除きます。
次に、引っ張ったピンの近くの解剖皿に幼虫を置き、皿の半分を生理食塩水で満たしました。次に、動物の背側の表面に沿って走る2本の銀色のチューブが見えるように、幼虫の向きを変えます。この銀色の管が気管です。
気管チューブの間の尾部に大きなピンを直接挿入します。幼虫を押さえつけて、2本目の大きなピンを頭に入れます。ピンを差し込むときは、必ず本体を縦に伸ばしてください。
ハサミを使って、尻尾の近くに小さな切開をします。体の長さまで切開を続けます。腹側神経や体壁の筋肉を切らないように、はさみの先端が上がっていることを確認してください。
動物の四隅に4本のピンを置きます。今、中央部を開きます。動物をさらくためにピンを解剖皿にセットします。
また、鉗子やハサミを使って教えられるように、準備をピンで留めます。動物の体、消化器官、気管、脂肪体を取り除きます。生理食塩水で準備をすすいでください。
すすぎ後、マイクロハサミを使用して、準備の前頭葉と腹側神経節を見つけます。前頭葉のすぐ後ろの腹側神経節を慎重に切り取ります。解剖が完了したら、ブルーライト刺激と筋肉記録を進めます。
筋肉の記録を行うには、10〜20メガオームの抵抗電極を引っ張ります。電子電極プーラーを使用して、引っ張られた電極に3モルのKCLを充填します。充填された電極を電極ホルダーに入れます。
次に、幼虫の準備をリグの解剖顕微鏡の下に置きます。解剖した調製物が光線の中央にくるように、青色のライトを調整します。マイクロマニピュレーターを使用して、幼虫の任意の体壁セグメントのマッスルシックスまたはM シックスを特定し、電極をM シックスに慎重に挿入し、急速な過分極筋を観察します。
静止膜電位は、負の30ミリボルトから負の70ミリボルトの範囲である必要があります。電極が正しく挿入されたら、制御回路に20〜100ミリ秒の電圧パルスを与えます。電圧を段階的に増やしますtage制御回路に供給されます。
筋細胞のエキシジャンクション電位に注意してください。これは、短い光パルスによって誘発される励起接合電位を示す代表的な結果です。ここに示されている励起接合電位振幅は、どちらも食べることが知られている2つの運動ニューロンからの合計振幅です。
Mシックス。光の強度が低いか、光の持続時間が短いと、単一の運動ニューロンからより小さな振幅の興奮性接合電位が露出する可能性があります。oph神経筋接合部でのシナプス電位の2つの媒介刺激がない場合にチャネルロードを実行する方法を示しました。
この手順を行うときは、解剖中にプレップの体壁を傷つけないように注意することが重要です。また、解剖直後はプレップが興奮しすぎるかもしれませんが、時間が経つにつれて静かになり、良好な録音が可能になることを覚えておくことも重要です。筋肉を突き刺すときは、筋肉の最初の層の下から体壁に入らないように注意してください。
電極が体壁に突き刺さっているとき。過分極した電位を得ることはあっても、実際には筋細胞の中にいるわけではありません。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この手順では、青色光で活性化される藻類チャネルと細胞特異的な遺伝子発現ツールを使用して、ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部（NMJ）で光パルスによるシナプス電位を誘発します。この技術は、研究や教育のための神経生理学研究における吸引電極刺激の代替として、費用が少なく使いやすい方法です。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- シナプス生理学
- 遺伝子発現
背景
- ショウジョウバエの幼虫は神経科学研究で一般的に使用されています。
- 光で活性化されるチャネルは、シナプス活性を研究するための非侵襲的な方法を提供します。
- 吸引電極刺激のような従来の方法は複雑で費用がかかる可能性があります。
- この手順は、シナプス電位を誘発するプロセスを簡素化することを目的としています。
研究目的
- 光刺激を用いたシナプス生理学研究方法を開発すること。
- 教育および研究目的のためのアクセスしやすい代替手段を提供すること。
- NMJにおけるシナプスメカニズムの理解を深めること。
使用された方法
- 特定の餌でショウジョウバエ幼虫を育てること。
- 刺激の準備のために幼虫をピンで固定すること。
- 運動活動を停止するために脳と後方の神経を切断すること。
- 青色LED光源を使用してシナプス電位を誘発すること。
主な結果
- 光パルスを用いてシナプス電位の成功的な誘発。
- 青色光で活性化される藻類チャネルの有効性の実証。
- 従来の技術に対する信頼できる代替手段としての方法の検証。
- シナプス生理学研究におけるより広範な応用可能性。
結論
- 光で活性化される方法は、NMJ生理学の研究に効果的です。
- このアプローチは神経科学における研究と教育を促進する可能性があります。
- 将来の研究では、この技術のさらなる応用を探る可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables non-invasive, light-based stimulation of synaptic activity in a genetically tractable model, reducing technical barriers in neurophysiology workflows. It supports reproducible data generation for target validation in early discovery, particularly where manual electrode manipulation limits throughput or training efficiency. The approach enhances predictive confidence by providing a standardized, scalable alternative to suction electrode stimulation in Drosophila neuromuscular junction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic transmission mechanisms through precise, light-controlled neuronal activation.
- Operational Value: Reduces reliance on technically demanding suction electrode manipulation, improving assay consistency across users.
- Strategic Value: Supports high-fidelity phenotypic screening of genetic or pharmacological modifiers of synaptic function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable excitatory junctional potentials (EJPs) as a direct readout of neuromuscular transmission efficacy.
- Operational Value: Enables standardized stimulation parameters via blue LED pulse control, improving inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Facilitates assay miniaturization and adaptation for compound screening in Drosophila-based neurotoxicity or neurotherapeutic screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying conserved synaptic pathways with genetic accessibility.
- Operational Value: Allows longitudinal tracking of synaptic phenotypes in larval models with minimal preparation variability.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in neuromuscular transmission or neurotransmitter release.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a stimulation modality for assessing synaptic function prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal excitability and synaptic vesicle release mechanisms via controlled light pulses.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable EJP amplitudes suitable for evaluating genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Produces continuous voltage trace outputs enabling amplitude, rise time, and frequency analysis of synaptic events.
- Translational Research: Connects to conserved synaptic mechanisms relevant to human neuromuscular disorders through genetic orthology.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable stimulation platform adaptable across multiple larval genotypes and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing measurement variability from electrode placement artifacts.
- Operational Value: Improves lab throughput and training efficiency in teaching and research settings through simplified stimulation setup.
- Strategic Value: Lowers technical barriers to synaptic physiology assays, enabling broader team access and cross-functional collaboration.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions in target prioritization by providing reliable, high-fidelity synaptic readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, electrophysiology, and optical stimulation systems.
- Needs blue LED light source, voltage control circuit, and saline-based electrophysiology rig.
- Demands standardization of retinal feeding, larval staging, and dissection protocols across users.
- Limited to superficial muscle targets due to light penetration constraints in intact preparations.
- Dependent on functional ChR2 expression and co-factor (all-trans retinal) availability in motor neurons.
