筋原培養組織コンストラクトの作製

本手順は、新生児ルイス・ラット（Neonatal Lewis Wraths）からの骨格筋組織の採取から始まります。この組織から筋芽細胞を単離します。これらの筋芽細胞を組織培養皿で2日間培養した後、回収してコラーゲンベースの組織構築混合物に混ぜ合わせます。

この混合液を、培地に浸したモールドに注意深くピペットで分注し、37 °Cでインキュベートします。こんにちは、ボストン子供病院およびハーバード大学医学部麻酔科学教室のDouglas Cowan研究室のChristina Pesachです。本日は、筋原性エンジニアリング組織を作製する手順をご紹介します。

この手順を用いて、心臓に挿入するためのエンジニアリング組織を作製します。私たちの目的は、完全房室ブロックを持つ小児に対する心ペースメーカー植え込み術に代わる治療法として、心臓の上室と下室の間に電気的な接続を構築することです。それでは始めましょう。

本構成において、キャスティングモールドは、外科的に植え込み可能なコラーゲンベースの組織構成体に形状を与えるために使用されます。このビデオでは、骨格筋芽細胞を含むエンジニアリング組織構成体の作製プロセスについて解説します。また、本プロトコルで作成した細胞化組織の心臓への植え込みについても実演します。

組織用モールドは、設計対象となる心臓の生理学的要件に合わせて、事実上どのような形状やサイズでも作成することが可能です。本デモンストレーションでは、成体ラット心臓のAV溝に適合するようにスライス可能な組織片を形成するモールドを作成します。まず、カミソリを用いてシリコンチューブを3 cmの長さに切り、各ピースを縦方向に半分に切断してモールドの構築を開始します。

ポリエステルメッシュを小さく切り取ります。次に、チューブの末端の内側に、インプラントグレードのRTVシリコン接着剤を1滴滴下します。接着剤は培養細胞に対してある程度の毒性があるため、塗布量は最小限に留めるようにしてください。

ポリエステルメッシュの小さな断片をシリコン接着剤のドロップの上に素早く置き、チューブの端に合わせます。これにより、構築物を固定するための、わずかに盛り上がった平坦な表面が形成されます。チューブのもう一方の端についても、同様の手順を繰り返します。

型を室温で3日間乾燥させます。これらの型は基本的に使い捨てであるため、一度に20〜30個作成しておくと便利です。接着剤が完全に乾燥したら、型を滅菌するために、使用するまで70%ethanolを満たした容器に保存します。

次に、細胞分離の準備として、必要なすべての溶液が使用可能な状態にあるかを確認します。1 mgのラミニンを、抗生物質と抗真菌剤を含む0.2 µmフィルター滅菌PBS 250 mLに溶解し、希釈ラミニン溶液を調製します。

次に、150 mmの組織培養プレートに希釈したラミネート溶液を4 mLずつ添加し、使用前に37 °Cで少なくとも4時間インキュベートします。また、筋芽細胞培地と骨格筋消化溶液の2つの溶液も準備する必要があります。

調製方法については、プロトコルの本文を参照してください。10 mLシリンジに取り付けた0.2 µmフィルターディスクを用いて、消化バッファーをろ過滅菌します。消化バッファーは分注して-20 °Cで保存可能です。

ラット（Lewis系）の1産子あたり5 mLの消化バッファーが必要と見積もります。規定量の組織消化バッファーと10 mLの筋芽細胞培地を37 °Cでインキュベートします。その後、新生仔ラットの解剖に進みます。

まず、ピンセットと小鋏を用いて、犠牲にした新生子ルイスラットを少なくとも1腹分採取します。死後新生子ルイスラットの脊髄に沿って背中を切り開き、皮膚と筋膜層を剥離した後、筋肉を切り出すことで、脊柱起立筋を除去します。切り出した筋肉を、40 mLの1X HBSSを満たし、氷上に置いた50 mLコニカルチューブに入れます。

筋肉片をチューブの底に沈ませ、滅菌済みのパステュールピペットを用いて、培養液中の液体と血液の残渣を吸引除去します。次に、回収した筋肉片を150 mmの培養皿に移し、残っている液体を可能な限り吸引します。2枚の片刃カミソリを使用して、組織を厚みのあるペースト状になるまで細かく刻みます。

筋組織ペーストを、あらかじめ温めておいた消化液で消化します。消化液を筋組織ペーストに少量注ぎ、その混合物を新しい50 milliliterチューブに移します。3 litersのLewis Ratから採取した筋肉を効率的に消化させるため、通常は10 milliliterピペットを用いて、10 to 15 millilitersの溶液を使用します。

チューブをロッキングプラットフォームに設置し、37 °Cで約30分間消化させます。酵素消化の間、気泡が入らないように注意しながら、組織を時々トリトゥレートします。コードレスピペットに取り付けた10 mLピペットを用いて行います。

筋肉を液状化した後、溶液を70 µmのセルストレーナーに通します。次に、ろ過した細胞を室温で600 G、10分間遠心分離し、パスツールピペットと吸引器を用いて上清を可能な限り除去した後、ペレットを10 mLの加温したmyoblast Mediumで再懸濁します。線維芽細胞は筋芽細胞よりも接着速度が速いため、これを除去するために、非コーティングの150 mm組織培養プレート上で細胞を15分間プレプレートします。

プレートを、37°C、5% carbon dioxideに設定した加湿インキュベーターに入れます。インキュベーターからプレートを取り出し、Laminコーティングされた培養基にまだ付着していない細胞を回収します。それらをmyoblast mediumで希釈し、ラットの幼仔1〜2匹につき1枚のプレートとなるように調整してください。

細胞を過密に播種すると、筋管へと分化してしまいます。最後に、37°C、5% CO2の加湿条件下で細胞を培養します。1〜2日間のインキュベーション後、細胞を組織構築物にキャストする準備が整います。

1〜2日間インキュベートした後、150 mmの筋芽細胞組織培養プレートを4枚、インキュベーターから取り出します。48時間以上放置しないでください。放置しすぎると、線維芽細胞が筋芽細胞の集団を圧倒してしまいます。細胞から培地を吸引して除去します。

次に、37°Cに加温したXPBSで細胞を2回洗浄し、各プレートに加温した0.05% Trypsin EDTA溶液4 mLを加えて、プレートをインキュベーターに戻して5分間放置し、筋芽細胞をプレートから剥離させます。クリーンベンチ内で筋芽細胞を回収し、液体を50 mLチューブに集めます。10 mLの筋芽細胞培地を用いてすべてのプレートを洗浄し、これを遠心管内の細胞と合わせます。

室温で600 G、10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を可能な限り吸引して除去します。次に、筋芽細胞を1.4 mLの筋芽細胞用培地で再懸濁し、氷上に置きます。ピンセットを用いて、エタノールバスからコンストラクト用モールドを注意深く取り出し、1×PBSに2回浸して洗浄します。パステールピペットでPBSを完全に吸引した後、モールドを6ウェル組織培養プレートの空のウェルに配置します。

ここで、溶液を調製する必要があります。以下の試薬を氷上で準備してください。10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin。

I型コラーゲン細胞を、筋芽細胞用培地、重曹、およびゲルで再懸濁します。記載されたプロトコルに従って試薬を混合します。混合物を20秒間ボルテックスします。溶液がピンク色に変わります。

市販されている1型コラーゲンの種類によって、混合、凝固、および最終製品の整合性に及ぼす影響が異なることに注意してください。気泡を取り除くため、チューブを数分間氷バケットに戻します。

1型コラーゲンは、照射を行わない限りゼラチン化しません。ここでは、卵の皮膚由来の製品を使用します。混合物が凝固する前に、培養プレート内のモールドに慎重にキャストしてください。

各モールドには、粘性液を約1 mLずつ注入します。この操作中、気泡が混入しないように注意してください。コンストラクトモールドを配置したプレートを、慎重に37 °Cのインキュベーターに移します。

混合物が凝固するにつれて、色は濃いピンク色から薄いピンク色へと変化します。型が凝固する間に、筋芽細胞培地を37 °Cに加温しておきます。約30分間インキュベートした後、各組織構築物を加温した筋芽細胞培地に慎重に浸し、プレートをインキュベーターに戻します。このプロトコルが適切に実行されれば、筋芽細胞を含む組織構築物は、in vivo 移植またはさらなる解析に使用可能な状態になります。

2日間のインキュベーション後、筋組織工学的な構築物を作製する方法を解説しました。この手順を行う際は、構築物溶液に必要なすべての試薬を氷上で保持し、早期に凝固することを防ぐことが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。