Name: 筋原培養組織コンストラクトの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: 学ぶ筋原培養組織コンストラクトの作製法。骨格筋芽細胞を用いたコラーゲンベースの組織構築体を作製し、房室伝導ブロック修復のための電気的導管として心臓治療に応用する技術を解説する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

、スラッシャーの研究基金からの新しい研究賞、ボストン小児病院で心臓伝導基金への拠出、この作品は、国立衛生研究所から研究助成金（HL088206 HL068915）によってサポートされています。

パート1：鋳型を構築アセンブル<ol><li>シリコンチューブ（VWR）を半減、3 cmの長さの部分にカットするためにカミソリの刃を使用してください。 </li><li>チューブの各端の内側にインプラントグレードのRTVシリコーン接着剤（ローディア社）のドロップを置きます。 </li><li>すぐにシリコーン接着剤のドロップにポリエステルメッシュ（マクマスター - カー）の小片（1センチメートル× 1cmを）置き、チューブの端に合わせて取り付けます。これは、構造、添付ファイルのためのわずかに隆起し、平坦な表面を提供します。もう一方の端について、この手順を繰り返します。 </li><li>金型は3日間室温で乾燥することができます。これらは基本的に使い捨てなので、時間20〜30金型を作っておくと便利です。 </li><li>接着剤が完全に乾燥したら、必要になるまで、70％エタノールを入れたビーカー内でこれらの型を格納します。このステップでは、カビを殺菌するのに役立ちますし、完成品を図1に示されています。 </li></ol>パート2：筋芽細胞を分離するための準備<ol><li> 250に1 mgのラミニン（シグマ）を希釈液0.22μmのはフィルター滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社）と1％のFungizone（Invitrogen）を含む。 </li><li> 4手順1.1から希釈ラミニン溶液1mlと主要骨格筋芽細胞を播種する前に少なくとも4時間、37℃でインキュベートするとコート150mmの組織培養プレート（BDファルコン）。 </li><li> （20％FBS（アトランタバイオロジカル）、5 ng / Lの塩基性線維芽細胞増殖因子（プロメガ社製）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社）、及び1％FungizoneとハムのF - 10栄養混合物（Sigma）を混合することにより、筋芽細胞の培地を作るインビトロジェン）。 </li><li> 100mLの2.4 U / mLのディスパーゼ- 2（Roche社）で〜295 U / mgのコラゲナーゼ2（ワーシントン）1gを溶解することにより骨格筋の消化溶液を調製。 0.037グラムのCaCl 2を加え、よく混ぜる。 -20℃で10mLのシリンジとストアのアリコートに装着0.2μmのフィルターディスクを使用して消化バッファーを滅菌フィルタリング° C筋芽細胞のメディアと一緒に37組織の消化に必要な量を置きます。 </li></ol>パート3：骨格筋からの筋芽細胞の分離<ol><li>鉗子と小さなハサミを用いて、脊髄に沿って背中を下にスライス皮膚と筋膜層に戻って剥離し、筋肉を切り出すことによりデッド新生児Lewisラットから傍脊柱筋を取り除く。 </li><li>組織培養フードの中で、氷上で1 ×ハンクス平衡塩溶液の40 mLの（HBSS）（Invitrogen社）を充填した50mLのコニカルチューブ（BDファルコン）で摘出した筋肉を置きます。筋肉片がチューブの底に沈降し、慎重に文化のフード（ベイカー）で滅菌パスツールピペットを用いて真空吸引によって液と血液の残りの大部分を除去することができます。 </li><li> 150 mmの培養皿上に回収筋肉片を注ぎ、吸引で可能な限り残留液をできるだけ多く削除します。 2個のシングル両刃かみそりの刃を使用すると、厚いペースト状に組織をミンチ。ペーストを予め温め消化溶液を注ぐと10 mLのピペットを使用して新鮮な50 mlチューブに混合物を移す。酵素消化中に、組織は時折コードレスピペットエイド（ドラモンド）の上に取り付けた10 mLのピペットを用いて（バブリングなし）摩砕しています。再び、組織が余分な液体を解決し、削除することができます。 </li><li>ロッキングプラットフォーム上にチューブを置き、約30分間37℃で消化。 </li><li>筋肉が液化されると、600 XG（ベックマンGP）で10分間室温で70μmのセルストレーナー（BDファルコン）と遠心分離によるソリューションを渡します。パスツールピペットや吸引で、できるだけ液体の限りを削除し、暖かい筋芽細胞の培地の10mLでペレットを再懸濁します。 </li><li>プレ板15分間コーティングされていない150mmの組織培養プレート上で細胞が線維芽細胞を取り除く手助けをする。 </li><li>まだラミニンコートculturewareに接続されていると、1〜2仔ラット用のプレートがあるように希釈していないセルを転送する。 37 ° Cで5％CO 2の加湿インキュベーターセットにプレートを置きます。 </li></ol>第4部：鋳造工学、組織構造（5mL）を<ol><li> 1〜2日後、、インキュベーターから150 mmの筋芽細胞の組織培養プレートの10を削除して37℃の1 × PBSで2回それらを洗い流して、各プレートに温かい0.05％トリプシン- EDTAを4mLを追加します。 5分間インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>文化のフードにプレートから分離された筋芽細胞を収穫し、50 mlチューブ（BDファルコン）で液体を集める。プレートのすべてをリンスし、遠沈管内の細胞とこれを組み合わせることが筋芽細胞の培地10mLを使用してください。ペレットは600 xgで10分間室温で細胞（ベックマンGP）と、ステップ3.5で説明したように余分な液体を取り除く。 </li><li>氷の上に筋芽細胞の培地と場所溶液1.6mLに筋芽細胞を再懸濁します。 </li><li>鉗子を使用して、慎重にステップ1.5から4構造の金型を削除し、1X PBSで2回、それらを洗い流してください。 6ウェル組織のCuの各金型を配置する前にパスツールピペットでPBSのすべての痕跡から真空吸引ltureプレート（BDファルコン）。 </li><li>氷の上に構造の準備に必要な他の試薬 ​​を（10XハムのF10、抗生物質、1型コラーゲン[3.9 mg / mLの] [6]およびマトリゲル™）を収集し、37℃での筋芽細胞のメディアを保持する100μLペニシリン/ストレプトマイシン、100μLFungizone、1.6 mLのコラーゲン、15 mLコニカルチューブに750μLのマトリゲル™、500μL10XハムのF10を組み合わせる。 10秒、氷の上を10に設定ミニボルテックス（VWR）と場所を使用するためのソリューションを混ぜる。 </li><li>次に、ステップ3.5からステップ3.3から混合物を80のNaHCO 3のμLと筋芽細胞懸濁液を加える。 10秒間ボルテックスする全体の混合物を、気泡のソリューションをクリアするために数分間、氷のバケツにチューブを返します。 </li><li>それは10 mLのピペットを用いて固化し始める前に、金型に混合物を慎重にキャスト。各金型は、粘性液体の約1 mLを開催します。この手順の実行中に気泡を導入しないようにしてみてください。 </li><li>インキュベーターにキャストの構文を含むプレートを慎重に移す。 〜30分後、インキュベーターから固化したコンストラクトを削除し、慎重に組織構築をカバーするために各ウェルに筋芽細胞の培地を加える。インキュベーターにプレートを返す（図2）。 </li></ol>パート5：代表的な結果このプロトコルが正しく実行されると、筋芽細胞を含む組織の構造は、 生体移植のために（すなわち、金型から除去するとき）または2日後にin vitroでの解析でさらにできるようになります。 <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" alt="" /> 図1完成した構造型の例（ステップ1.5参照）。 <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" alt="" width="400" height="321" /> 図2。固化した筋芽細胞を含む組織には、[1]を構築する。 <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" alt="" /> 図3筋芽細胞を含む組織のH＆E染色切片の構築。 &quot;&quot;縦断面を表し、&quot;B&quot;は断面を示しています。

<ol><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li>
<li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li>
</ol>

動物実験は、ボストン小児病院での動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

組織の構造がキャストされるの金型は、任意の形状と大きさで行うことができますが、添付ファイルの少なくとも2点がなければなりません。そうでなければ、マトリックスと細胞は球状構造を形成し、細胞が死ぬ。現在のプロトコルでは、我々はこの目的のためにポリエステルメッシュを使用することを記載し、まだ我々はまた、正常にステンレスメッシュを使用している。明らかに、より大きな金型は、より多くの細胞や他の成分の大きなボリュームが必要になります。金型を作るとき、それは使用されるシリコーン接着剤の量を最小限に抑えるために、それがチューブの非常に両端に配置されていることを確認することが重要です。接着剤に近い筋芽細胞は、さらに硬化の数日後、生きていけることではない傾向があるためです。さらに、それは汚染線維芽細胞が急速に増殖し、最終的には文化の筋原性成分を圧倒されるように組織構造を準備する前にだけ一日か二日のためのプレート筋芽細胞をすることが賢明です。互いに接触の細胞が融合して筋管に分化し始めるので、同様に、筋芽細胞が密に播種してはいけません。組織構造の製造に関しては、1型コラーゲンの市販のソースの数がありますが、それぞれの凝固の速度と最終製品の一貫性の違いを示してい...

<table><tbody><tr><td>シリコーンチューブ</td><td>VWR international</td><td>60985-724</td><td></td></tr><tr><td>シリコーン接着剤</td><td>Rhodia Silicones</td><td>MED ADH 4300 RTV</td><td></td></tr><tr><td>ポリエステルメッシュ</td><td>McMaster-Carr</td><td>93185T17</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Mixture F-10 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6908</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Dispase-2</td><td>Roche Group</td><td>10295825001</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>46H8863</td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子</td><td>Promega Corp.</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 組織培養ディッシュ</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>0.05% (1X) Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>1X ハンクス平衡塩溶液</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m セルストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m フィルター</td><td>Nalge Nunc international</td><td>194-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

筋原培養組織コンストラクトの作製

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

電子ペースメーカーは、医療機器を救命しているという事実にもかかわらず、小児患者における長期的なパフォーマンスは、子供の小さいサイズと彼らの必然的な成長により課される制限には問題によりすることができます。その結果、心臓のリズム障害を有する小児患者のために特別に設計された革新的な治療のための真の必要性がある。我々は提案することを含むコラーゲンベースのマトリックスで構成される導電性の生物学的代替細胞が良く、成長に適応再発手術の必要性を削減し、大幅にこれらの患者の生活の質を向上させることができるautologously由来。本研究では、我々は、ファッションにハイドロゲルマトリックス内に心臓の上部および下部チャンバーの間の電気コンジットとして動作する外科的に移植可能な組織構造を主骨格筋芽細胞の細胞培養を組み込むための手順を説明します。最終的に、我々は、完全心ブロック児の房室の電気伝導を復元するために設計された組織のこのタイプを使用して期待しています。そのビューでは、我々は、確立されたプロトコルの修正バージョンを使用して、ラミニンコートした組織培養皿の上に新生児のLewisラットやプレート、それらの骨格筋から筋芽細胞を分離<sup&gt; [2、3]</sup&gt;。 1〜2日後、培養細胞は、抗生物質で1型コラーゲン、マトリゲル™、およびNaHCOを収集し、混合され<sub&gt; 3</sub&gt;。その結果、ほぼ任意の形状と大きさの金型にキャストすることができる粘性、均一な溶液です。<sup&gt; [1、4、5]</sup&gt;。私たちの組織構造の場合、我々は標準的な手順を用いてヒツジ胎仔の皮膚から単離された1型コラーゲンを採用<sup&gt; [6]</sup&gt;。いったん組織は37強化しています°コンストラクトが水没するまでC、文化メディアは慎重にプレートに追加されます。設計組織は、それがために準備が整った時点で、さらに2日間の脱水によってさらに凝縮して許可されています<em&gt; in vitroで</em&gt;評価または外科的移植。

ここで、我々は、骨格筋芽細胞を含むコラーゲンベースの、組織構造の作製を実証する。これらの3次元設計された構造は、組織を交換または修復するために使用されることがあります<em&gt; in vivoで</em&gt;。我々の目的のために、我々は、完全心ブロックの修復のための房室の電気コンジットとしてこれらを設計している<sup&gt; [1]</sup&gt;。

電子ペースメーカーは生命を救う医療機器であるものの、小児患者における長期的な性能は、…に起因して問題となる可能性があります。

本手順は、新生児ルイス・ラット（Neonatal Lewis Wraths）からの骨格筋組織の採取から始まります。この組織から筋芽細胞を単離します。これらの筋芽細胞を組織培養皿で2日間培養した後、回収してコラーゲンベースの組織構築混合物に混ぜ合わせます。この混合液を、培地に浸したモールドに注意深くピペットで分注し、37 °Cでインキュベートします。こんにちは、ボストン子供病院およびハーバード大学医学部麻酔科学教室のDouglas Cowan研究室のChristina Pesachです。本日は、筋原性エンジニアリング組織を作製する手順をご紹介します。この手順を用いて、心臓に挿入するためのエンジニアリング組織を作製します。私たちの目的は、完全房室ブロックを持つ小児に対する心ペースメーカー植え込み術に代わる治療法として、心臓の上室と下室の間に電気的な接続を構築することです。それでは始めましょう。本構成において、キャスティングモールドは、外科的に植え込み可能なコラーゲンベースの組織構成体に形状を与えるために使用されます。このビデオでは、骨格筋芽細胞を含むエンジニアリング組織構成体の作製プロセスについて解説します。また、本プロトコルで作成した細胞化組織の心臓への植え込みについても実演します。組織用モールドは、設計対象となる心臓の生理学的要件に合わせて、事実上どのような形状やサイズでも作成することが可能です。本デモンストレーションでは、成体ラット心臓のAV溝に適合するようにスライス可能な組織片を形成するモールドを作成します。まず、カミソリを用いてシリコンチューブを3 cmの長さに切り、各ピースを縦方向に半分に切断してモールドの構築を開始します。ポリエステルメッシュを小さく切り取ります。次に、チューブの末端の内側に、インプラントグレードのRTVシリコン接着剤を1滴滴下します。接着剤は培養細胞に対してある程度の毒性があるため、塗布量は最小限に留めるようにしてください。ポリエステルメッシュの小さな断片をシリコン接着剤のドロップの上に素早く置き、チューブの端に合わせます。これにより、構築物を固定するための、わずかに盛り上がった平坦な表面が形成されます。チューブのもう一方の端についても、同様の手順を繰り返します。型を室温で3日間乾燥させます。これらの型は基本的に使い捨てであるため、一度に20〜30個作成しておくと便利です。接着剤が完全に乾燥したら、型を滅菌するために、使用するまで70%ethanolを満たした容器に保存します。次に、細胞分離の準備として、必要なすべての溶液が使用可能な状態にあるかを確認します。1 mgのラミニンを、抗生物質と抗真菌剤を含む0.2 µmフィルター滅菌PBS 250 mLに溶解し、希釈ラミニン溶液を調製します。次に、150 mmの組織培養プレートに希釈したラミネート溶液を4 mLずつ添加し、使用前に37 °Cで少なくとも4時間インキュベートします。また、筋芽細胞培地と骨格筋消化溶液の2つの溶液も準備する必要があります。調製方法については、プロトコルの本文を参照してください。10 mLシリンジに取り付けた0.2 µmフィルターディスクを用いて、消化バッファーをろ過滅菌します。消化バッファーは分注して-20 °Cで保存可能です。ラット（Lewis系）の1産子あたり5 mLの消化バッファーが必要と見積もります。規定量の組織消化バッファーと10 mLの筋芽細胞培地を37 °Cでインキュベートします。その後、新生仔ラットの解剖に進みます。まず、ピンセットと小鋏を用いて、犠牲にした新生子ルイスラットを少なくとも1腹分採取します。死後新生子ルイスラットの脊髄に沿って背中を切り開き、皮膚と筋膜層を剥離した後、筋肉を切り出すことで、脊柱起立筋を除去します。切り出した筋肉を、40 mLの1X HBSSを満たし、氷上に置いた50 mLコニカルチューブに入れます。筋肉片をチューブの底に沈ませ、滅菌済みのパステュールピペットを用いて、培養液中の液体と血液の残渣を吸引除去します。次に、回収した筋肉片を150 mmの培養皿に移し、残っている液体を可能な限り吸引します。2枚の片刃カミソリを使用して、組織を厚みのあるペースト状になるまで細かく刻みます。筋組織ペーストを、あらかじめ温めておいた消化液で消化します。消化液を筋組織ペーストに少量注ぎ、その混合物を新しい50 milliliterチューブに移します。3 litersのLewis Ratから採取した筋肉を効率的に消化させるため、通常は10 milliliterピペットを用いて、10 to 15 millilitersの溶液を使用します。チューブをロッキングプラットフォームに設置し、37 °Cで約30分間消化させます。酵素消化の間、気泡が入らないように注意しながら、組織を時々トリトゥレートします。コードレスピペットに取り付けた10 mLピペットを用いて行います。筋肉を液状化した後、溶液を70 µmのセルストレーナーに通します。次に、ろ過した細胞を室温で600 G、10分間遠心分離し、パスツールピペットと吸引器を用いて上清を可能な限り除去した後、ペレットを10 mLの加温したmyoblast Mediumで再懸濁します。線維芽細胞は筋芽細胞よりも接着速度が速いため、これを除去するために、非コーティングの150 mm組織培養プレート上で細胞を15分間プレプレートします。プレートを、37°C、5% carbon dioxideに設定した加湿インキュベーターに入れます。インキュベーターからプレートを取り出し、Laminコーティングされた培養基にまだ付着していない細胞を回収します。それらをmyoblast mediumで希釈し、ラットの幼仔1〜2匹につき1枚のプレートとなるように調整してください。細胞を過密に播種すると、筋管へと分化してしまいます。最後に、37°C、5% CO2の加湿条件下で細胞を培養します。1〜2日間のインキュベーション後、細胞を組織構築物にキャストする準備が整います。1〜2日間インキュベートした後、150 mmの筋芽細胞組織培養プレートを4枚、インキュベーターから取り出します。48時間以上放置しないでください。放置しすぎると、線維芽細胞が筋芽細胞の集団を圧倒してしまいます。細胞から培地を吸引して除去します。次に、37°Cに加温したXPBSで細胞を2回洗浄し、各プレートに加温した0.05% Trypsin EDTA溶液4 mLを加えて、プレートをインキュベーターに戻して5分間放置し、筋芽細胞をプレートから剥離させます。クリーンベンチ内で筋芽細胞を回収し、液体を50 mLチューブに集めます。10 mLの筋芽細胞培地を用いてすべてのプレートを洗浄し、これを遠心管内の細胞と合わせます。室温で600 G、10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を可能な限り吸引して除去します。次に、筋芽細胞を1.4 mLの筋芽細胞用培地で再懸濁し、氷上に置きます。ピンセットを用いて、エタノールバスからコンストラクト用モールドを注意深く取り出し、1×PBSに2回浸して洗浄します。パステールピペットでPBSを完全に吸引した後、モールドを6ウェル組織培養プレートの空のウェルに配置します。ここで、溶液を調製する必要があります。以下の試薬を氷上で準備してください。10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin。I型コラーゲン細胞を、筋芽細胞用培地、重曹、およびゲルで再懸濁します。記載されたプロトコルに従って試薬を混合します。混合物を20秒間ボルテックスします。溶液がピンク色に変わります。市販されている1型コラーゲンの種類によって、混合、凝固、および最終製品の整合性に及ぼす影響が異なることに注意してください。気泡を取り除くため、チューブを数分間氷バケットに戻します。1型コラーゲンは、照射を行わない限りゼラチン化しません。ここでは、卵の皮膚由来の製品を使用します。混合物が凝固する前に、培養プレート内のモールドに慎重にキャストしてください。各モールドには、粘性液を約1 mLずつ注入します。この操作中、気泡が混入しないように注意してください。コンストラクトモールドを配置したプレートを、慎重に37 °Cのインキュベーターに移します。混合物が凝固するにつれて、色は濃いピンク色から薄いピンク色へと変化します。型が凝固する間に、筋芽細胞培地を37 °Cに加温しておきます。約30分間インキュベートした後、各組織構築物を加温した筋芽細胞培地に慎重に浸し、プレートをインキュベーターに戻します。このプロトコルが適切に実行されれば、筋芽細胞を含む組織構築物は、in vivo 移植またはさらなる解析に使用可能な状態になります。2日間のインキュベーション後、筋組織工学的な構築物を作製する方法を解説しました。この手順を行う際は、構築物溶液に必要なすべての試薬を氷上で保持し、早期に凝固することを防ぐことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

fabrication-of-myogenic-engineered-tissue-constructs

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

脱細胞組織から注射マトリックスのゲルを調製し、ラット心筋にそれを注入するための方法...

心筋組織工学のための生物由来注射用材料の作製

仕組まれた筋肉組織は、疾患モデルとして、また肉の代替源として、再生医療における大きな可能性を秘めている。ここでは、マウス筋芽細胞の前駆細胞、及び電気パルスによる刺激からこのケースでは、筋肉の構造物の工学を記述します。...

電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。...

マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成

このモデルシステムは、非破壊における内因性コラーゲン（再）組織実時間を研究するために使用することができる筋線維芽細胞にポピュレートフィブリンゲルから始まる。モデル系は、それが別のセルソース、媒体添加剤と共に使用することができるように、非常に可変であり、特定のニーズに容易に適合させることができる。...

エンジニアリングフィブリンベースの組織の筋線維芽細胞と制約の適用からの構築と細胞とコラーゲン（再）組織を誘導するためにひずみ

複雑な組織の高度に組織化された構造を作成するためには、複数の材料と細胞タイプを統合された複合材料に組み立てる必要があります。...

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

この研究では、コラーゲン、平滑筋細胞、内皮細胞を直接培養することにより、生体血管組織を迅速に作製する技術を紹介します。さらに、人工血管組織の機械的特性評価のための新しいプロトコルについて説明します。...

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

今日まで、厚い組織の欠陥は通常、自家組織フラップまたは人工組織を適用することによって再構築されています。このプロトコルでは、自家皮弁の代わりとして機能するために、自家椎弓根を持つ血管新生組織皮弁をエンジニアリングするための新しい方法を提示します。...

操作された血管柄マッスルフラップ

このプロトコルでは、カスタマイズされた 3 D プリントのプラスチック金型を使用して可変サイズの自己生成組織リングを製造するためのプラットフォームについて説明します。3 D プリントされた鋳型の硬化 PDMS ネガアガロースは硬化の PDMS ネガのキャストになります。セルがどこ彼らは組織リングに集計結果の agarose...

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

本稿は、収縮力やカルシウム処理分析を含む機能の機能アッセイにおいて、3Dヒト骨格筋微小組織および低侵襲下流部のアレイを生成するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価

我々は、ヒト工学的骨格筋組織および光遺伝学的運動ニューロンを用いて神経筋接合機能を特徴付けるための、再現可能で自動化された、偏りのないイメージングシステムについて記載する。このシステムは、経時的な神経筋接続性の機能的定量化を可能にし、神経毒および重症筋無力症患者血清によって引き起こされる神経筋機能の低下を検出する。...

ヒト神経筋接合部の光遺伝学的モデルの工学と特徴付け

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。...

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

学ぶ筋原培養組織コンストラクトの作製法。骨格筋芽細胞を用いたコラーゲンベースの組織構築体を作製し、房室伝導ブロック修復のための電気的導管として心臓治療に応用する技術を解説する。

筋原培養組織コンストラクトの作製

さらに動画を探す