Name: ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学マッピング法。ポテンショメトリック色素di-8-ANEPPSを用いて心表面の活動電位伝導を高時空間分解能で可視化し、不整脈メカニズムの解明に活用します。

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とボストン小児病院で心臓伝導基金への拠出、この作業は、研究の国立衛生研究所からの補助金（HL088206 HL068915）によってサポートされています。

パート1：準備のソリューションと分離された灌流心臓システム<ol><li>以前に[5、6]を説明するように実験の朝に、クレープス-ヘンゼライト溶液の4.0 Lが用意されています。 </li><li> 11ミリモル/ L 2,3 - ブタンジオンmonoxime（BDM）は手順1.1で作成した灌流液からデカントクレープス - ヘンゼライト溶液の1.0 Lに溶解させる。 </li><li>クレブス - ヘンゼライトの追加の150mLの手順1.1で作成した灌流液から除去し、5モル/ Lジ- 8 - ANEPPS（ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10ミリモル/ Lストックから希釈）と混合される。 </li><li> 5％のCO 2ガスを、これらの3ソリューションは、それらが41.0℃に予め温めておいたし、0.2μm、フィルタ処理された95％O 2を用いて水中バブラー（ラド）と酸素化されている水ジャケット付きガラスリザーバー（ラド）に転送されます。 3ストック貯水池からのソリューションは、MasterFlex™L / S蠕動ポンプと低吸収シリコーンチューブ（コール - パーマー）と壁掛けランゲンドルフシステムに圧送されています。 </li><li>組立て前に、ランゲンドルフシステムガラス製品（ラド）は細心の注意を払って、E - TOXA - CLEAN試薬（Sigma - Aldrich社）で洗浄し、徹底的に0.1 M / LのHCl、100％エタノール、蒸留水でリンスする。 </li><li>非循環ランゲンドルフ装置は、水ジャケット加熱コイルとバブルトラップ（ラド）[7]で心臓から分離される3つの別個の酸素貯蔵所、約70ミリメートルHg定圧を提供するために構築した。 3つの独立した灌流ラインは私達が正確に1.3〜ステップ1.1で作成したソリューションの配信を制御できるように、2つの3ウェイコックで心臓の上に収束する。水ジャケットガラス製品はMasterFlex PharMed BPTチューブ（コール - パーマー）と直列に接続し、℃の蒸留水で2 E100サーキュレータ（ラウダ）を使用して39に加温する。加熱コイルとバブルトラップに圧力ヘッドタンクを接続する白金硬化シリコンチューブ（コール - パーマー）による熱損失は、37℃灌流液が心臓に到達するまでになりました。 </li></ol>パート2：収穫ラットの心臓とセットアップランゲンドルフ灌流<ol><li> 200〜250グラムのルイスラットで深い全身麻酔を誘導するために、100 mg / kgのケタミンおよび10 mg / kgのキシラジンを腹腔内腔に注入される。この混合物に、我々は、植手順の実行中に血液凝固や心筋虚血を防ぐために、500 U / kgのヘパリンを追加します。 </li><li>心臓や大血管へ簡単にアクセスするには、前胸壁が削除されます。その後、周囲の組織は注意深く切開し、心膜袋が開かれます。 </li><li>下大静脈の同定に続いて、この容器は、5から0絹（エチコン）と連結されており、全体の心肺ブロックは、外植されています。組織はすぐに氷上に50 mLのビーカーに含まれる氷冷クレブス - ヘンゼライト溶液中に配置されます。 </li><li>上行大動脈を素早く特定し、周囲の組織から解剖される。適切なサイズのカニューレは、（ハーバード装置）大動脈基部に遠くカニューレを挿入することによって冠状動脈の義務灌流を中断しないように注意しながら、大動脈に挿入されます。カニューレは、5から0絹（エチコン）で上行大動脈に固定されている。 </li><li>ラットの心臓は、カニューレ内に気泡を導入することなく、ランゲンドルフ装置上に配置されます。逆行性冠血管灌流は、現在のステップ1.6に説明した圧力ヘッドから暖かい、酸素クレブス - ヘンゼライト溶液を用いて確立されます。 </li><li>肺を含む余分な組織が、、今削除され、心臓は、機能の回復を可能にし、リズムを安定させるために20分間灌流される。この時間の間に、非常に薄い熱電対温度プローブ（コール - パーマーは）左室内腔に導入し、5から0 Prolene縫合糸（エチコン）で所定位置に縫合。プローブは、心臓の温度が水の循環ポンプの設定を調整することによって37℃に維持されるようにサーモコントローラー（Digi - Keyはセンス）に接続されています。心尖​​部から滴り落ちる灌流液からの動きは、排水容器にガーゼを配置することによって最小化されます。 </li></ol>パート3：電位差色素で心臓をロードし、電子写真、光信号を取得する<ol><li>ジ- 8 - ANEPPS（Invitrogen）を三方活栓を用いて蛍光色素を混合したクレブス - ヘンゼライトを含む灌流ラインに切り替えることで、心臓にロードされます。さらに、18Gカニューレは、左及び/または右心房に配置され、それらが十分に冠状動脈を介して導入された染料で灌流されていないため、色素溶液の追加の50mLを徐々にこれらのチャンバーのそれぞれに投与される。 </li><li>ロード手順3 ECGのリード線（ハーバード装置）の間に穏やかにマッピングするのに使用される光学系を向いていない心臓の表面に配置されます。電極N O 1は、後部尖左心室の一部、N左心房のO 2、およびN上に位置している<su>大動脈基部（図1）の参照電極としてp&gt; O 3。心房と心室の電子写真信号はその後、増幅、デジタル化、およびソフトウェア（留年選手イメージング）（図2）を用いた光信号の横に表示されています。オシロスコープ（テクトロニクスモデルTDS 1002）もリアルタイムで表面ECGのを視覚化すると、適切なペーシングを保証するために使用されます。 </su></li><li> ECGアンプ（ヒューゴサックスElektronik社）の設定：ハイパスフィルター：0.1 Hzの ローパスフィルタ：150Hzの</li><li> CMOSカメラ（留年選手イメージング）とmacroscopeは、心臓の表面に焦点が合っていると買収のフレームの中央になるようにXYZの調整を使用して配置されている。カメラと光学系は共振周波数を最小限に抑えるために（マイナスKテクノロジー）防振テーブル上に搭載されています。それと同時に、同軸ペーシング電極（ハーバード装置）は、隔離された、S48電気刺激装置（グラス）で制御右心房上に配置され、心臓は毎分300ビート（図1）でのペースです。 </li><li>電気刺激（グラス）の設定： レート：1秒あたり5パルス ディレイ：0.2ミリ秒 期間：2ミリ ボルト：6月12日V モード：リピート パルス：シングル</li><li>収縮からのモーションアーチファクトを欠いている光学録音の場合、心臓に電気機械的に非結合する必要があります。我々は再び11ミリモル/ LのBDMを含むクレブス - ヘンゼライト溶液に灌流ラインを切り替えることによってこれを行います。買収の間に、心臓は、準備の生存を守るために純粋なクレブス - ヘンゼライトで灌流される。 </li><li>記録パラメータは、次の買収の設定でソフトウェア（留年選手のイメージング）を使用して設定されます。 設定：2,000 Hzの、128 × 128ピクセルの配列 フレームの間隔：0.5ミリ秒 カメラのアンプ利得：5倍 オンチップゲイン：8X - 12Meウェル シャッター：500ミリ秒の遅延 フレーム数：4000 期間：2000ミリ秒</li><li>すべてのお部屋と設備のライトがオフになっているか、録音中にバックグラウンドノイズを除去するためにシールドされています。 LEDライトは光退色と色素の毒性を軽減する唯一の光記録中に、心を照らす。光源のシャッターは、コンピュータのD -対基板（留年選手イメージング）の方法でコントロールパネルを介して配信5 Vのパルスで制御されます。 </li></ol>パート4：赤シャツ党員のイメージングソフトウェアを使用して取得する情報を分析<ol><li>買収後、データが異なるフィルタ設定を使用して処理されます。我々は一般的にバンドが44.0で左の境界と98.0で右の境界に設定されているフィルタを、ストップ/合格調整する場合を除いてデフォルト設定を使用します。その後記録された情報が処理され、ムービーが（留年選手の画像）が生成されます。 </li><li> 1回の収集からのデータは2秒の期間にわたって心臓の表面上の16384のサイトで地元の電気的活性化に対応しています。ソフトウェアは、これらのローカル信号を直接互いにと心房と心室の電子写真記録と比較することができます。データは、色に地元の電気的活性化をマッピングし、心臓の表面上に時空間の電気的活性化を示すアニメーションとしてこの情報をレンダリングにより可視化です。このようなアニメーションを作成するために、我々はソフトウェアを使用します。 <ul><li>時間的および/または空間的にデータをフィルタ</li><li>アニメーションの開始時刻と終了時刻を選択</li><li>各ピクセルの静止光強度に基づいて、色にマップされた光信号</li><li>心臓の絵と結果の色のデータをオーバーレイ</li><li>アニメーションを生成する</li></ul></li></ol>パート5：代表的な結果灌流心臓標本の記録中に静止していた場合、光信号は、ジ- 8 - ANEPPSの発光強度の変化に関係するすべてのピクセルの1つの異なるピークを示す。対応する動画（図3および4）心臓の心外膜面だけでなく、同​​時に取得した電子写真記録（図2）を介して伝播する励起波の前面を示す。 <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="心臓ペーシング研究のためのランゲンドルフ心臓セットアップ図、番号付きコンポーネントを強調表示。" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="図1"> 図1。ランゲンドルフ灌流心臓標本の写真は、右心房のペーシング電極の位置を描いたとECGは、ステップ3.2で説明つながります。 <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="信号付きの生物学的プロセス図。蛍光顕微鏡検査結果のデータ解析" border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="図2"> 図2。灌流ルイスラットの心臓からの代表的な光信号と電子写真記録。パネルは、光学イメージングに使用心外膜面の像を示しています。パネルBの時間をかけて蛍光発光の変化を示すために選択した画素の位置は、色付きの矢印で示されている。電子写真の信号は心房興奮及び心室の信号に対応するライトブルーのラインを示す赤い線とパネルCに示されています。してくださいve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg"&gt;この図の拡大バージョンを見るにはここをクリックしてください。

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

動物実験は、ボストン小児病院での動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

麻酔ラットから心臓の除去は、心筋虚血を避けるために迅速に実行する必要があります。虚血または不十分な冠灌流が発生した場合、心臓はおそらく不整脈を開発し、梗塞になることがあります。さらに、これらの心は有益なレコーディングとその後の分析のための不十分な蛍光発光が表示されます。色素をロードする前に、心筋細胞は電気的な刺激の安定のための生理的電解質の環境を確立および維持するために十分にクレブス - ヘンゼライト溶液で灌流する必要があります。灌流液の正確な製剤は、適切な臓器の生存能力と機能を維持するために必要です。電解質の濃度または灌流の不十分なフィルタリングの違いは、おそらく致命的な心筋機能障害、心臓のリズム障害につながる。光学録音の場合は、心臓が完全に膜電位感受性色素をロードする必要があります。これらのチャンバーは冠状動脈が十分に灌流されていないので、これは心房心筋のために特に重要です。我々は、心房の追加の内空洞のある血流が良い光信号を確立することを見出した。さらに、最高品質の電圧のトレーシングの買収は、潅流心臓が動かないことが必要です、そうでない場合、蛍光発光の変化は確実に信号ドリフトに起因するアーチファクトに起因する高忠実度と膜電位の変化を...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>機器</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CardioPlex ソフトウェア</td><td>機器</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUXEON LED 光源 460-490 nm </td><td>機器</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>ECG アンプ Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>機器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー 505 nm</td><td>機器</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>エミッションフィルター 605 nm ロングパス</td><td>機器</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT サイドウェイズ</td><td>機器</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>ミニボールジョイントホルダー</td><td>機器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>小型刺激電極セット</td><td>機器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>BM-6 ベンチトップ除振台</td><td>機器</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>単極ECG電極</td><td>機器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>ローラーポンプ SCI 400</td><td>機器</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>ローラーポンプ MasterFlex Easy Load II</td><td>機器</td><td>Cole-Parmer</td><td>Model 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>チューブ Marprene #14</td><td>機器</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex チューブ</td><td>機器</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>S48 スクエアパルス刺激装置</td><td>機器</td><td>Grass Technologies</td><td>Model S48</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF トランスフォーマー絶縁ユニット</td><td>機器</td><td>Grass Technologies</td><td>Model SIU5</td><td></td></tr><tr><td>5 リットル ウォータージャケッテッドリザーバー</td><td>機器</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>2 リットル ウォータージャケッテッドリザーバー</td><td>機器</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>0.5 リットル ウォータージャケッテッドリザーバー</td><td>機器</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>0.25 リットル ウォータージャケッテッドリザーバー</td><td>機器</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 加熱コイル</td><td>機器</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>コンプライアンスバブルトラップ</td><td>機器</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>ルアー切り離しカニューレ</td><td>機器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>3方活栓、FLL to MLT、ポートカバーなし</td><td>機器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>熱電対温度計</td><td>機器</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine IT-Series フレキシブルマイクロプローブ </td><td>機器</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ Tektronix TDS 1002</td><td>機器</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオンモノオキシム </td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン HCl</td><td>試薬</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>試薬</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

電位感受性蛍光色素による心臓の表面の光学的マッピングは、実験モデルでの電気的励起を調べるために重要なツールとなっているその細胞培養物からの全体の臓器へのスケールの範囲<sup&gt; [1、2]</sup&gt;。最先端の光学イメージングシステムを使用して、正常な心臓のリズムの間にまたは不整脈の開始と維持を通して活動電位の発生と伝播はほぼ瞬時に可視化することができます。<sup&gt; [1]</sup&gt;。最新の市販のシステムは非常に高い時空間分解能で情報を提供することができますし、当初より、従来の電気生理学的方法によって課される障害を克服するために開発された特注の機器に基づいていた<sup&gt; [1]</sup&gt;。高解像度と高速相補型金属酸化膜半導体（CMOS）カメラと極度に明るい、発光ダイオード（LED）だけでなく、電位感受性色素、光学、およびフィルタの進歩は、電気信号​​の取得を行うために始めているより多くの顕微鏡での作業に慣れている心血管細胞の生物学者のための実用的。 CMOSカメラの最新世代は、試料調製の種類に応じて、16,384ピクセルのアレイ上にフォトダイオードアレイ、レーザースキャニングシステム、および冷却電荷結合素子（CCDなどの老舗蛍光取得の技術を毎秒10,000フレームを取得することができますが、 ）カメラはまだダイナミックレンジに関しては、信号対雑音比を持ついくつかの明確な利点を持っている、と量子効率<sup&gt; [1、3]</sup&gt;。本研究では、ルイスラットの心臓を灌流した<em&gt;生体外で</em&gt; 37晶質灌流液（クレブス - ヘンゼライトソリューション）°変更ランゲンドルフ装置上にCと。 20分の安定期間の後、心臓を断続的に画像取得時の収縮に関連した動きを排除するために11ミリモル/ L 2,3 - ブタンジオンmonoximeで灌流した。光学マッピングでは、高速応答電位差プローブジ- 8 - ANEPPSと心をロードし<sup&gt; [4]</sup&gt;（5マイクロモル/ L）と簡単には475 ± 15 nmの励起光で準備を点灯。照明の典型的な2番目の期間中に、心の準備から放射される&gt; 605 nmの光は水平macroscopeに接続された高速のCMOSカメラで撮像した。このデモでは、心が分離された電気刺激装置に接続される同軸電極を毎分300ビートでペースだった。同時バイポーラ電子写真記録は、容易に利用可能なソフトウェアを使用して電圧信号と一緒に取得し、分析した。このように、ランゲンドルフ灌流ラット心臓の表面の活動電位は可視化と電子写真の信号に登録することができます。

この記事では、電位差色素（ジ- 8 - ANEPPS）を使用してランゲンドルフ灌流ラット心臓の表面に光学的に画像のアクション潜在的な動きに高い時間および空間分解能のテクニックを説明します。

電位感受性蛍光色素を用いた心臓表面の光学マッピングは、...における電気的な興奮を調査するための重要なツールとなっています。

こんにちは。私はChildren's HospitalおよびHoward Medical School麻酔科学科のDr. Cohenの研究室のYon Zivです。本日は、灌流したラットの赤色心における光学マッピングの手順について説明します。当研究室では、心表面における電気活動の伝播を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めましょう。実験当日の朝に、Krebs Hensel light溶液を4リットル調製します。溶液を調製した後、真空ろ過を用いて200 µmのフィルターで未溶解の粒子を取り除きます。まず、調製したKrebs Henzel lite溶液1Lを用いて、11mmolのBDMを溶解させます。次に、別のKrebs Henzel lite溶液100mLを取り、DMSOに溶解した10mMのD8-NFSを加え、最終濃度が5µMのD8-NFS溶液になるように混合します。ここで使用しているウォータージャケット付きガラスリザーバー、バブラー、およびガラス器具はすべてred.Naughty社製です。2つの溶液を41 °Cに予熱したリザーバーに移します。0.2 micronフィルターを通したガスを用いて溶液に酸素を供給し、沈降式バブラーを使用します。3つのストックリザーバーから、壁掛けのLangendorff装置、ペリスタルティックポンプ、および低吸着シリコンチューブを介して溶液をポンプ輸送し、ラットの心臓を採取します。まず、200〜250 gのLewisラットにケタミンとキシラジンを腹腔内投与して深い全身麻酔を誘発し、摘出中の血液凝固および心筋虚血を防ぐためにヘパリンを投与します。ラットが完全に麻酔状態となり、足指のつまみ刺激に反応しなくなったことを確認した後、心臓の摘出に進みます。まず、心臓および大血管に容易にアクセスできるよう、前胸壁を取り除いて手術を開始します。次に、周囲の組織を慎重に剥離し、心膜嚢を切開します。下大静脈を特定した後、この血管を5-0 Proline縫合糸で結紮し、心肺ブロック全体を摘出します。直ちに組織を氷上の50 milliliterビーカーに入れた氷冷Krebs Henseleit溶液に浸し、速やかに上行大動脈を特定して周囲の組織から剥離します。大動脈に適切なサイズのカニューレを挿入します。カニューレを大動脈根に深く挿入しすぎて、冠動脈への必須灌流を妨げないように注意してください。カニューレを上行大動脈に固定します。その後、カニューレ内に気泡が入らないように注意しながら、ラットの心臓をLing Endorf装置に設置します。温めて酸素化したKrebs Hensel lite溶液を用いて、逆行性冠血管灌流を行います。Ling Endorf装置の圧力ヘッドから、肺を含む余分な組織を清掃後に除去し、心機能を回復させ、灌流中にリズムを安定させるため、20分間心臓を灌流します。非常に細い熱電対温度プローブを左心室腔に挿入します。5-0 Prolene縫合糸を用いてプローブを固定し、心臓の温度を維持するように水循環ポンプの設定を調整します。37 °Cにおいて、心尖部から滴下するPerfuse 8による動きを最小限に抑えます。流出液受容器にガーゼを配置することで、心臓に電位計色素を導入し、電気的および光学的信号を取得する準備が整いました。電位計色素であるdye 8 NEPsを心臓に導入します。Krebs液および蛍光染料を混合した灌流ラインに切り替えます。冠動脈から導入した染料では心房への灌流が不十分であるため、左心房または右心房に18ゲージのカニューレを挿入します。そして、各心房に染料溶液をさらに50 millilitersずつゆっくりと投与します。ローディング手順において、心臓の表面に3本のECGリードを慎重に配置します。その際、マッピングに使用する光学系に向かないようにしてください。最初の電極は、左室の後方心尖部に配置します。2本目を左心房に配置し、3本目を大動脈基部の参照電極として使用します。その後、心房および心室の電位信号を増幅・デジタル化し、ソフトウェアを用いて光学信号として表示させます。また、オシロスコープを使用して表面ECGをリアルタイムで可視化し、適切なペーシングが行われているかを確認します。ECGアンプのハイパスフィルターを0.1 hertzに、ローパスフィルターを150 hertzに設定し、X、Y、Z調整を用いてCMOsカメラを配置します。カメラの焦点面に配置されたガラス片を心臓表面に置き、関心領域がピントが合った状態でキャプチャフレームの中心にくるようにします。共振周波数を最小限に抑えるため、カメラと光学系は除振台の上に設置されています。同時に、右心房に絶縁されたS 48電気刺激装置で制御される同軸ペーシング電極を配置します。これにより、心拍数を分速300拍でペーシングします。電気刺激の設定は以下の通りに行います。刺激速度は1秒間に5パルス、遅延時間は0.2 milliseconds、刺激持続時間は2 milliseconds、強度は6～12 voltsとし、モードはrepeatおよびsingle pulseに設定してください。収縮によるモーションアーチファクトのない光学的記録を行うには、心臓を電気機械的に脱共役させる必要があります。そのためには、再び灌流ラインを11 millimolar BDM含有Krebs Hensel溶液に切り替えてください。データ取得の間、プレパラートの生存能を維持するため、不純物のないKrebs HENSEL溶液で心臓を灌流させます。ソフトウェアの記録パラメータを、2000 hertz、128 by 128ピクセルのアレイに設定します。フレーム間隔は0.5 millisecondsに設定し、ゲインはカメラアンプを5x、オンチップゲインを8xに設定します。また、オンチップゲインは12にも設定してください。ソフトウェアのカメラコントロールでシャッター遅延を500 millisecondsに設定し、2000 millisecondsの期間で4,000フレームを記録します。記録中のバックグラウンドノイズを排除するため、室内の照明および装置のライトをすべて消灯するか、遮光してください。LEDライトは光学記録中のみ心臓を照射します。フォトブリーチングと色素毒性を低減するため、データ取得後、コンピュータのD/Aボード経由でコントロールパネルから送られる5 Vのパルスを用いて光源シャッターを制御します。異なるフィルター設定を用いてデータを処理してください。バンドストップパスフィルターを調整する場合を除き、通常はデフォルト設定を使用します。フィルターの調整では、左境界を44.0、右境界を98.0に設定します。その後、記録された情報を処理し、動画を生成します。1回のデータ収集は、心臓表面の16,384箇所の部位における2秒間の局所的な電気的活性化に対応しています。このソフトウェアでは、局所的な電気的活性化を色にマッピングし、心臓表面における時空間的な電気的活性化をアニメーションとして描画することで、これらの局所信号を互いに、また心房および心室の電図記録データと直接比較することができます。このようなアニメーションを作成するには、まず、ソフトウェアを使用してデータを時間的および／または空間的にフィルタリングします。次に、アニメーションの開始時間と終了時間を設定します。第三に、各ピクセルの安静時の光強度に基づいて、光学信号を色にマッピングします。第四に、得られたカラーデータを心臓の写真に重ね合わせ、灌流心臓標本が記録中に静止していた場合は、最終的にアニメーションを作成します。記録中、光学信号はD eight anepの放出強度の変化に関与するすべてのピクセルに対して、1つの明確なピークを示します。これらのリアルタイムイメージング動画は、心外膜表面を伝播する興奮波面と、同時に取得された電気生理学的記録を示しています。Alanor Perfuse Red Heartの表面における活動電位の移動を高解像度で光学的にイメージングする手法を実演しました。この手順を行う際は、麻酔をかけた個体から心臓を迅速に取り出すことが重要です。心筋虚血を避けるため、心筋細胞に十分な灌流を行い、心臓に水溶性色素を完全に充填させる必要があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

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