Name: 初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ 初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング手法。広視野蛍光顕微鏡を用いてオルガネル輸送動態を可視化し、神経細胞の機能理解に貢献する実験プロトコルです。

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我々は、この原稿の彼らの注意深い読書のためにハラルドヒュ​​ッターとヘレナデッカーに感謝。我々はまた、彼の技術的な専門知識のためにライカマイクロシステムズからREG Sidhuに感謝。この研究は、国立科学及びカナダの技術評議会、賞＃327100から06、及び科学のサイモンフレーザー大学の学部によってサポートされていました。

パート1：リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて神経細胞のトランスフェクション機器のセットアップ： ラットまたはマウスの海馬ニューロンをKaechとバンカー、2006 [4]に従って培養されています。トランスフェクションのために使用される典型的な細胞密度は、250,000 cells/6-cm皿です。必要な試薬と装置は、50mMのキヌレン酸、定期的なベンチトップ型のチューブホルダー、ベンチトップクーラーを（最高のリポフェクトアミン試薬の寒さを保つために）、含まれています リポフェクタミン試薬、MEM、マイクロチューブ、micropipetters、および滅菌ピンセット。 手順： <ol><li>各トランスフェクションのラベルのための2つの1.5 mLチューブ、プラスミドDNA、トランスフェクション試薬を含む1つを含む1つ。以下のインキュベーションは、室温で進むことができます。 <ol><li>つのチューブに100μLMEMでプラスミドDNA 1.0μgを組み合わせる（あらゆるタイプのサプリメントなしで、MEMは、平衡pHの温度である必要はありません）。 </li><li>他の1.5 mlチューブに100μLMEMを6.0μLリポフェクタミンを組み合わせる。 <ol><li> DNAの比がこのような場合には半減されます：ダブルトランスフェクションのための調整はリポフェクタミンがいても必要ありません。リポフェクタミンの比率：DNAは、製造業者の提案の中ではまだです。最適な発現のためにそれぞれのプラスミドに対して0.5〜1.0μgのをテストするのが最善です。 </li><li>リポフェクタミン試薬の貯蔵寿命を維持するために、それは可能な限り短い時間のために冷蔵庫から取り出し、使用していないときは、ベンチトップクーラーに配置する必要があります。 冷蔵庫の合計時間は最小限に抑える必要があります。 </li></ol></li></ol></li><li>室温で5分間チューブをインキュベートします。 </li><li>脂質チューブにDNAインMEM液を移し、ゆっくりと室温で30分間インキュベートし、ピペットで混ぜる。 </li><li> 25分後、カバースリップを反転する前に、培養神経細胞のディッシュにexcitoxic被害を最小限に抑えるために50mMのキヌレン酸60μLを加える。 <ol><li>慎重にフリップカバースリップは、足側を上向きにして、滅菌ピンセットを用いて、それらが重複しないように手配する。ニューロンでコーティングされたカバースリップの表面または皿のグリアコーティングされた表面をこすり取るように注意してください。 </li></ol></li><li> 6cmシャーレから培地の約0.5 mLをとり、軽くチューブにDNAを混ぜ、培地の表面に均一に滴下皿に戻ってDNA溶液を移す。 </li><li>渦巻きにはない、しかし優しく一方向に前後に料理をスライドさせ、その後、均等にDNA -リポフェクタミン複合体を配布するために垂直方向に停止し、繰り返します。組織培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で90分間インキュベートする。 </li><li>彼らは重複しないようにフリップカバースリップは、足側のダウン、および手配。式が48時間に一般的に一晩、希望の時間を進行することができます。 </li></ol>パート2：培養海馬神経細胞におけるGFP -タグ付き高密度コア小胞のライブイメージング機器のセットアップ： <ol><li>生細胞のイメージングは​​、CCDカメラを装備した蛍光顕微鏡が必要です我々は、ライカの変数を装備したライカDMI 6000B倒立顕微鏡、蛍光灯を使用してください。また、温度コントローラと客観的なヒーターの撮像室がある必須。我々は、ワーナーインスツルメンツRC - 21BRは（カタログ番号TC324B）プラットフォームのヒーターに加えて、直径18mmのカバースリップのために変更（カタログ番号PH2）と温度コントローラを使用してください。チャンバーは開いているポート、チャンバーを注文するときに含めることができる修正が含まれていません。客観的なヒーターは非常にカバースリップの温度を維持し、温度変化によるフォーカスの変化を最小限に抑えることをお勧めします。画像は、買収のドロップインの&quot;ストリーミング&quot;モードを含む、Metamorph（Molecular Devices社）のソフトウェアを使用して、浜松オルカ- ERで取得されています。注 - 我々は全体の顕微鏡を囲む気象室を使用しないでください。このほか、高価とここで説明する短期的なイメージングのための必要はありません。 </li><li>他の機器と試薬は、作りたてのライブイメージングの培地（1XのCa 2ハンクス+およびMg 2 +、0.6％グルコース、および10mMのHEPES）、さらに18 mmのカバーガラス、滅菌ピンセット、非滅菌ピンセット、キムワイプ、真空グリースが含まれています、およびグリースを適用すると注射器（針なし、または変更されたワイドボア針付き）。 </li></ol>手順： <ol><li> （1XのCa 2ハンクス+およびMg 2 +、0.6％グルコース、および10mMのHEPES）、新鮮なライブイメージングの培地を準備します。使用しないときに我々は通常、4℃で、時間と店舗で50mls準備。一度に1週間以内に十分な準備をするのが最善です。約5〜10 mLをニューロンの皿ごとに使用されています。 </li><li>顕微鏡、カメラ、蛍光灯、および画像集録ソフトウェアを起動します。またチャンバーのプラットフォームと客観のヒーターの電源を入れます。 </li><li>想像を準備グラムチャンバー。 <ol><li>ワーナーチャンバーは、カバースリップをマウントするためのテフロンインサートが含まれています。永久的なマーカーを含むINSERT&quot;トップ&quot;の操作、ラベル一面の容易さのため。 </li><li> &quot;トップ&quot;とラベルされたチャンバーの側面に穴を囲む溝にグリースのリングを適用する。それはチャンバーに入ると観察可能な領域を削減するように過剰な使用は避けてください。 </li><li>鉗子を使用して、チャンバーの&quot;上&quot;側にきれいな、未使用の18 - cmのカバーを取り付け、チャンバーの凹溝内に密封を作成するには、その端にカバースリップに穏やかな圧力を与える。 </li><li>チャンバーを裏返しにして、チャンバーの反対側（下）側の溝にグリースの同じようなリングを適用する。 </li><li>理想的なチャンバーの所有者である50 - mLのチューブの蓋のアップで、準備室から下側に置きます。 </li><li>チャンバーにイメージング培地750μLを加える。これは過剰な量ですが、グリースが溢れ出るの培地を防ぐ必要があり、過剰の細胞で覆われたカバースリップが適用されるときにトラップされる気泡を防ぐことができます。 </li><li>必要になるまで組織培養インキュベーターで準備室を維持する。イメージング培地が蒸発し、組成物中に変更されるように長時間のインキュベーションは、〜1時間は避けてください。 </li></ol></li><li>最終的なチャンバーの組立と生細胞イメージングを実行します。 <ol><li>準備室やインキュベーターからの組織培養フードにトランスフェクトされたカバースリップの皿を移動します。 </li><li>最後のチャンバアセンブリは、細胞を培地にし、℃で連続して37℃で浸漬されたまま確保するために迅速に実行する必要があります。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、慎重にトランスフェクトされた皿から一カバーを取り外し、増殖培地を離れて描画するキムワイプにカバースリップの端に触れる。 </li><li>準備室の上にカバースリップのニューロンサイドダウン置きます。第一グリースにカバースリップの片側をタッチし、気泡をトラップせずにフラットなカバースリップを持って来るためにエッジの周りの圧力を適用する。過剰イメージング媒体は期待通りにこぼれるでしょう。 </li><li>過剰イメージング培地を拭き取ったが、位置からカバーグラスをスライドさせしないように注意してください。 </li><li>予備加熱プラットフォームのヒーターにチャンバーを移動し、場所でチャンバーを固定します。 </li><li>ステージにチャンバーを転送する。 </li><li>退色とphotoxicityを減らすために、トランスフェクションされた細胞を見つけるために必要な強度の最小量にランプを調整する。 </li><li>低倍率の油浸対物（40倍速）で目的の細胞を見つける。それは右に向かって、最大のスキャンとダウン、、カバースリップの左上の最大のカバースリップのカバレッジを確保するために、冗長な画像の取得、などを避けるために計画された検索パターンに固執することは有益である。 </li><li>目的のフィールドが配置された後、高倍率の油浸対物（60〜100倍）に切り替えます。 </li><li>蛍光標識タンパク質のダイナミクスの映像を記録する&quot;ストリームの取得&quot;またはイメージングソフトウェアの同等の機能を使用してください。 </li><li>後の分析とプレゼンテーションのための位相画像及びその他の付随する画像（例えば可溶性GFP）を取る。 </li><li>さらにカバーを探索し、次のビデオを記録する前にすべての画像を保存します。 </li><li>一般に、1つのカバースリップ3から5のビデオは成功したとみなされます。トランスポートが損傷を受けた細胞で減少すると光毒性と一般的な細胞の健康を心に留めておく必要があります。細胞の健康は、位相差顕微鏡を用いて観察して監視できます。通常は録音はカバースリップあたり約30分間実行されます。 </li></ol></li></ol>パート3：代表的な結果： ライブセルイメージング観測は、通常のビュー（図1A）のフィールド内に蛍光タグ付き小器官の動きを示すビデオ（また、画像の&quot;スタック&quot;とも呼ばれる）で構成されています。各ビデオを伴い、しばしば細胞体に関して、タンパク質の発現および/または細胞の健康状態のレベルでの視野の方向を示す画像をサポートしています。輸送のビデオはkymographs（図1B）に形質転換により定量分析を行うことができる。 Kymographsは、各時点がカイモグラフの列で表される行のスキャンを並べることによって粒子の運動を説明する画像です。図2は、反対方向に動いつの粒子がカイモグラフで表現される方法を示しています。 kymographsのさらなる分析は、粒子フラックス、速度、ランレングス、反転、および静止した粒子に関する情報を提供することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> 図1代表的な生細胞イメージングの観測。mCherryタグ付き組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）輸送の映像から（A）選択されたフレーム。順行性に移動する個々の粒子（緑の矢印）との逆行（赤矢印）の方向が示されている。（B）を説明するKymographsは、TPA - mCherry運動軸索。斜めの線が細胞体から（正のスロープ）または（負勾配）に向かって遠ざかってオルガネラを表してkymographsの水平線は、静止オブジェクトを表します。長い緑と赤の矢印は、（）内の粒子に対応する実行を示しています。微小管脱重合試薬、ノコダゾールによる輸送の変化は、またカイモグラフで示されています。斜め線の有無によって細胞小器官の移動の削減に注意してください。

<ol><li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li>
<li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li>
<li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

ライブセルイメージングには、培養神経細胞でのオルガネラの輸送の直接観測のための挑戦的な、しかし強力な手法です。困難は、文化の合併症のために貧しい人々のニューロンの健康と手順の上流に起こることができます。したがって、細胞の健康状態は（例については文献4参照）増殖培地で組織培養光顕微鏡を使用中にカバースリップを観察することによってトランスフェクションの前と後に評価されるべきである。イメージングチャンバーにニューロンを含むカバースリップを転送するプロセスは、それゆえに、カバースリップを操作するときに注意を行使することが重要である、細胞にストレスになること。健康そうな顔をしている細胞は手続きの遅れに起因する輸送、またはイメージングメディアの装置または平衡の予熱不完全を表示しないすることが一般的であるができます。輸送解析の軸索と樹状突起の向きは、すなわち順行性と逆行性輸送を区別する、知られている必要があります。したがって、細胞体の位置が決定されていることと、連続神経セグメントが細胞体への関心の領域を接続して見ることができることを確認することが重要です。多くの場合、可溶性GFPの重複する画像を保存、またはinformatively保存されたビデオフ...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

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David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<table><tbody><tr><td>Earle塩およびL-グルタミン含有MEM-Eagle</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>10X Hanks (Ca2+およびMg2+含有)</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td>ライブイメージング培地</td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>ライブイメージング培地</td></tr></tbody></table>

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

観測とダイナミックな細胞プロセスを特徴付けることは、静止画像から得られることができない細胞の活動に関する重要な情報を得ることができる。バイタル蛍光プローブ、特に緑色蛍光タンパク質（GFP）は、特定の細胞内区画と細胞構造を標識するために能力に起因する細胞生物学に革命をもたらしています。例えば、GFP（とそのスペクトル変異体）キメラのライブイメージングは​​、生物や細胞の種類[1-3]の多数の細胞骨格、オルガネラ輸送、および細胞膜のダイナミクスの動的解析のために許可されている。ライブイメージングが普及しているが、このアプローチは、まだ特に初代培養神経細胞で、多くの技術的課題があります。 1つの課題は、有糸分裂後のニューロンでGFP -タグ融合タンパク質の発現であり、他には、光毒性を最小限に退色し、一般的な細胞の健康を維持しながら蛍光画像をキャプチャする機能です。ここでは、比較的低いトランスフェクション率（〜0.5％）が得られる脂質ベースのトランスフェクション法を説明するプロトコルを提供する、しかし完全に偏光ニューロンの撮影に最適です。低トランスフェクション率は、単一の軸索と樹状突起が順行性V.逆行輸送、すなわち、の方向性を確認するために細胞体にその方向へと特徴付けることができるようにすることが不可欠です。イメージングGFPを発現する神経細胞への我々のアプローチは、標準的な広視野蛍光をCCDカメラを装備した顕微鏡、画像キャプチャソフトウェア、および加熱されたイメージングチャンバーに依存しています。我々は特別な光学系や蛍光灯の光源以外の励起要件なしで、例えば、高密度コア小胞、ミトコンドリア、成長円錐、およびアクチンを細胞小器官や構造体のさまざまな画像化している。さらに、スペクトル的に異なる、蛍光標識タンパク質、例えば、GFPとDsRed -タグ付きタンパク質は、共同輸送や他のコーディネート携帯電話のイベントを特徴付けるために、同時に近くに視覚化することができます。ここで説明したイメージング手法は、各種イメージングアプリケーション用の柔軟性があり、顕微鏡が使用可能な場合、比較的少ない費用のための実験室で採用することができます。

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。

動的な細胞プロセスの観察と特性評価は、静止画からは得られない細胞活性に関する重要な情報をもたらす可能性があります。

生細胞イメージングは、オルガネラの輸送ダイナミクスを研究する際に特に有用です。このビデオでは、培養海馬ニューロンにおいて高密度コア顆粒をイメージングするために用いられる手順を解説します。まず、DNAMEM培地とリペクトミー（lipectomy）トランスフェクション試薬を混合して、トランスフェクション複合体を作製します。海馬ニューロンはグリア単層に向かい合うように倒立カバーガラス上で培養されているため、トランスフェクション試薬に曝露させるには、これらのカバーガラスを反転させる必要があります。GFPタグ付き高密度コア小胞輸送タンパク質が十分に発現するまで待機した後、イメージングチャンバーを構築します。培養ニューロンにおける高密度コアICALのイメージングは、広視野蛍光顕微鏡を用いて行うことができます。このプロトコルは柔軟性が高く、ミトコンドリア、エンドソーム、ペルキシソームなどの他の細胞小器官のイメージングにも適応させることができます。こんにちは、サイモンフレーザー大学の細胞神経科学研究室のマイケル・シルバーマンです。私たちは、神経細胞内で細胞小器官がどのように移動するかに注目しています。この問いに取り組むため、培養海馬ニューロンにおいて膜結合オルガネラ、具体的には高密度コア小胞を標識します。その方法について説明するため、ここからはデビッドに代わってもらいます。こんにちは、Silverman研究室のデビッドです。本日は、広視野ウエスタン顕微鏡を用いた、高密度コア小胞および培養ニューロンのライブセルイメージングの手順について説明します。それでは始めましょう。ほとんどの実験では、6 cmディッシュあたり250,000個の細胞密度で培養したラット海馬ニューロンのディッシュを使用します。各トランスフェクションに向けて、プラスミドDNA用とトランスフェクション試薬用の2本の1.5 mLチューブにラベルを貼ってください。ラミナーフローフード内にて、室温で1本のチューブに1 µgのプラスミドDNAと100 µLのMEMを混合します。この際、サプリメントを含まないMEMを使用してください。別のチューブに6 µLのlipと100 µLのMEMを混合します。ダブルトランスフェクションを行う場合も同量を使用できますが、その場合のlipとDNAの比率は半分になります。脂質試薬の保存期間を維持するため、常に冷蔵保存またはベンチトップクーラーで保管し、チューブを室温で5分間インキュベートします。MEMで希釈したDNA混合液を脂質チューブに移し、APEで緩やかに混合した後、室温で30分間インキュベートします。25分後、培養ニューロンへの細胞毒性ダメージを最小限に抑えるため、50 millimolarのK neuronic acidを60 µL添加します。GLモノレイヤーの上に吊り下げられたカバースリップの裏面でニューロンを培養しているため、カバースリップを反転させてニューロンをトランスフェクション溶液にさらす必要があります。滅菌ピンセットを使用して、カバースリップを慎重に反転させ、裏面を上にしてください。カバースリップ同士が重ならないように配置します。カバースリップのニューロンコーティング面や、ディッシュのgglコーティング面を擦らないように注意してください。30分間のインキュベーション終了後、6 cmディッシュから約0.5 mLの培地を取り出し、チューブ内のDNAと穏やかに混合します。DNA溶液をディッシュに戻し、培地表面に均等に滴下してください。ディッシュを一方方向にゆっくりと前後にスライドさせますが、培地を膨らませないように注意してください。一方向への混合後、一旦停止し、直交する方向で同様の操作を繰り返し、DNAリポプレキシス複合体をディッシュ全体に均一に分散させます。37°C、5%二酸化炭素の組織培養インキュベーター内で90分間インキュベートします。インキュベーション後、カバーガラスを裏返し、重ならないように並べます。最後に、DNAの発現を希望の時間（通常はインキュベーター内で一晩から48時間）まで進行させます。培養海馬ニューロンにおけるGFP標識濃密コア顆粒のライブイメージングには、CCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡が必要です。温度コントローラーと対物レンズヒーターを備えたイメージングチャンバーが必要です。チャンバーには開放ポートがないことが望ましく、これはチャンバーの注文時に指定することができます。次に、顕微鏡カメラ、蛍光灯、および画像取得ソフトウェアを起動します。チャンバープラットフォームと対物レンズヒーターの電源を入れます。このタイミングで、対物レンズにオイルを1滴滴下しておくのが適切です。次に、加熱プラットフォームとイメージングチャンバーを準備します。操作しやすくするため、チャンバー上部の片側に油性マジックで印を付けます。チャンバーを上向きにして、最適なチャンバーホルダーとなる50 milliliterチューブの蓋の上に置きます。「top」と表記されたチャンバー側面の穴の周囲にある溝に、グリースをリング状に塗布します。グリースがチャンバー内に入ると観察領域が減少するため、塗りすぎないように注意してください。ピンセットを使用します。未使用の清潔な18 cmのカバーガラスをチャンバーの上側に装着します。カバーガラスの端を軽く押し、チャンバーの凹溝内で密閉状態にします。チャンバーを反転させ、反対側（底面）の溝にも同様にグリースをリング状に塗布します。イメージング培地750 µLをチャンバーに移します。これは多めの量ですが、グリースによって培地の漏出が防がれ、また十分な量があることで、細胞を載せたカバーガラスを適用した際に気泡が混入するのを防ぐことができます。準備したチャンバーは、使用するまで組織培養インキュベーター内で保存してください。イメージング培地が蒸発し、組成が変化するため、1時間以上の長時間インキュベーションは避けてください。ライフスタイルイメージング用の最終的なチャンバー組み立てのために、準備したチャンバーとトランスフェクション済みカバーガラスを入れたディッシュを、インキュベーターから組織培養フードへ移動させます。滅菌済みピンセットを使用して、トランスフェクション済みディッシュからカバーガラスを1枚慎重に取り出します。次に、カバーガラスの端をキムワイプに触れさせ、培地を吸い取ります。続いて、カバーガラスのニューロン側を下にして、準備したチャンバーの上に置きます。まずカバーガラスの片側をグリースに接触させ、端の周囲に圧力をかけて、気泡を閉じ込めないようにカバーガラスを平らに密着させます。余剰なイメージング培地が溢れ出ることが予想されます。カバーガラスをずらさないように注意しながら、余剰なイメージング培地を拭き取ってください。チャンバーを予熱したプラットフォームヒーターへ移動させ、チャンバーを固定します。次に、光退色と光毒性を低減させるため、チャンバーをステージへと移します。ランプの強度を、トランスフェクションされた細胞を確認するために必要な最小限の強さに調整します。次に、目的の細胞を探します。40倍などの低倍率の油浸対物レンズを使用する場合、カバーガラス全体を最大限にカバーし、重複した画像取得を避けるために、計画的な探索パターンに従うことが有効です。目的の視野を特定したら、目的の蛍光標識タンパク質のチャネルに切り替えます。60倍から100倍などの高倍率油浸対物レンズに切り替え、ランプ強度を高設定に戻します。高速で移動するオルガネラの蛍光標識タンパク質のダイナミクスを記録するには、ストリーム撮影またはイメージングソフトウェアの同等の機能を使用してください。高いフレームレートで記録を行うため、露光時間および露光間のディレイは最小限に抑える必要があります。画面上のプレビューで観察される焦点のドリフトは、手動でのフォーカス調整によりリアルタイムで補正することが可能です。後での解析やプレゼンテーションに必要となる位相差像およびその他の付随する画像を必ず撮影してください。カバーガラスのさらなる探索や次の録画を行う前に、すべての画像を保存してください。通常、1枚のカバーガラスから3〜5回の記録が得られれば成功と考えられます。各カバーガラスのイメージングは30〜60分間行いますが、損傷した細胞では輸送能が低下するため、光毒性と全般的な細胞の状態に留意する必要があります。生細胞イメージングの観察は、通常、視野内の蛍光標識されたオルガネラの移動を示す、画像スタックとして知られる記録で構成されます。以下は、高密度コア型iCal輸送の代表的な動画です。観察しやすくするため、色を反転させています。移動する粒子に注目してください。CHグラフは、各時点をグラフの列として表すラインスキャンを並置することで、粒子の動きを視覚化した画像です。この図は、互いに反対方向に移動する2つの粒子がCHグラフでどのように表現されるかを示しています。クロノグラフをさらに分析することで、粒子の流速、走行方向の反転、および静止粒子に関する情報を得ることができます。ここでは、培養されたヒポカンパスニューロンにおけるdsco小胞輸送の高速記録の取得方法について説明しました。この手順を行う際は、インキュベーターからステージへ移動させる際の細胞へのストレスを軽減するため、イメージングチャンバーとプラットフォームのすべての構成要素をあらかじめ予熱しておくことが重要です。迅速かつ慎重に作業してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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