初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

ライブセルイメージングは、臓器輸送のダイナミクスを研究する場合に特に有用です。このビデオでは、培養された海馬ニューロンの密集したコアlesを画像化するために使用される手順に焦点を当てます。トランスフェクション複合体は、まずD-N-A-M-E-M培地と脂肪切除トランスフェクション試薬を混合することによって得られます。

海馬ニューロンはグリア単層に面した逆さカバースリップで培養されるため、トランスフェクション試薬に曝露するためには、これらのカバースリップを裏返す必要があります。GFPタグの高密度コア粘性タンパク質の発現に十分な時間を確保した後、イメージングチャンバーを構築します。培養ニューロンにおける高密度コアICALのイメージングは、広視野蛍光顕微鏡を用いて行うことができます。

このプロトコールは柔軟性があり、ミトコンドリア、エンドソーム、ペルオキシソームなどの他のオルガネラのイメージングにも適応できます。こんにちは、私はマイケル・シルバーマンで、サイモン・フレーザー大学の細胞神経科学の研究室へようこそ。私たちは、オルガネラが神経細胞内でどのように動くかに興味を持っています。

この疑問にアプローチするために、私たちは膜ドンオルガネラ、特に培養海馬ニューロンの密集したコア小胞を標識します。そして、私たちがこれをどのように行うかを示すために、私はそれをデビッドに引き継ぐつもりです。こんにちは、シルバーマン研究所のデビッドです。

今日は、広視野ウェスタン顕微鏡を使用して、高密度コア小胞と培養ニューロンのライブセルイメージングの手順をお見せします。さっそく始めましょう。ほとんどの実験では、2つの1.5ミリリットルチューブ、プラスミド、DNA用、トランスフェクション試薬用の2本のトランスフェクションを標識した各トランスフェクションについて、6センチメートルディッシュあたり250,000細胞の細胞密度で培養されたラット海馬ニューロンのディッシュを使用します。

層流フードでは、1マイクログラムのプラスミドDNAと100マイクロリットルのMEMを1本のチューブに室温で結合するために、サプリメントを含まないMEMを必ず使用してください。6マイクロリットルのリップと100マイクロリットルのMEMをもう一方のチューブに組み合わせます。ダブルトランスフェクトには同量を使用できますが、その場合、リップDNAの比率が半分になります。

リップ試薬の保存期間を延ばすために、常に冷蔵またはベンチトップクーラーに保管し、チューブを室温で5分間インキュベートしてください。MEM中のDNA混合物を脂質チューブに移し、APE Nextと穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートします。25分後、培養ニューロンへの細胞毒性損傷を最小限に抑えるために、60マイクロリットルの50ミリモルKニューロン酸を添加します。

GL単分子膜の上に吊り下げられたカバースリップの下側でニューロンを培養するため、カバースリップを反転させてニューロンをトランスフェクション溶液にさらす必要があります。カバーを慎重に裏返し、滅菌鉗子を使用して足を上に滑り込ませます。重ならないように配置します。

カバースリップのニューロンコーティング面や皿のgglコーティング面をこすらないように注意してください。30分間のインキュベーションの終わりに、6cmの皿から約N 0.5ミリリットルの培地を取り出し、チューブ内のDNAと穏やかに混合します。DNA溶液を皿に戻し、培地の表面に均等に滴下します。

皿を一方向にゆっくりと前後にスライドさせますが、中程度が膨らまないように注意してください。一方向に混合した後、停止して垂直方向に繰り返し、DNA脂肪切除複合体を皿全体に均一に分配します。組織培養インキュベーターで37°C、5%二酸化炭素で90分間インキュベートします。

インキュベーション後、カバーのスリップを足側を下にして、重ならないように配置します。最後に、DNAの発現を所望の時間(通常はインキュベーター内で一晩から48時間)進行させます。培養海馬ニューロンにおけるGFPタグ付き高密度コアlesのライブイメージングには、CCDカメラを備えた蛍光顕微鏡が必要です。

温度コントローラーと対物レンズヒーターを備えたイメージングチャンバーが必要になります。チャンバーには開いているポートが含まれていてはなりませんが、これはチャンバーの注文時に含めることができる変更です。次に、顕微鏡カメラ、蛍光灯、画像取得ソフトウェアを起動します。

チャンバープラットフォームと対物レンズヒーターの電源を入れます。これは、目標にオイルを一滴垂らすのにも良い時期です。次に、加熱されたプラットフォームとイメージングチャンバーを準備します。

操作を容易にするため。チャンバー上部の片側に油性マーカーでラベルを付けます。チャンバーの上面を上にして、理想的なチャンバーホルダーである50ミリリットルのチューブの蓋に置きます。

上部にラベルが貼られたチャンバーの側面にある穴を囲む溝にグリースのリングを塗布します。グリースはチャンバーに入り、観察可能な領域が減少するため、グリースの過剰使用は避けてください。鉗子を使用します。

清潔な未使用の18センチのカバースリップをチャンバーの上面に取り付けます。カバースリップの端に穏やかな圧力を加えて、チャンバーの凹んだ溝内にしっかりとシールします。チャンバーを裏返し、チャンバーの反対側または底面の溝に同様のグリースのリングを塗布します。

750マイクロリットルのイメージング培地をチャンバーに移します。これは過剰な量ですが、グリースは媒体がこぼれるのを防ぎ、余分なグリースは、セルで覆われたカバースリップが適用されたときに気泡が閉じ込められるのを防ぐ必要があります。準備したチャンバーは、必要になるまで組織培養インキュベーターに保管してください。

1時間以上のような長時間のインキュベーションは、イメージング培地が蒸発して組成が変化するため、避けるべきです。ライフスタイルイメージングのための最終的なチャンバーアセンブリでは、準備したチャンバーとトランスフェクションされたカバースリップの皿をインキュベーターから組織培養フードに移動します。滅菌鉗子を使用して、トランスフェクションされた皿から1つのカバースリップを慎重に取り外します。

次に、カバースリップの端をキムワイプに触れて、成長培地を引き離します。次に、カバースリップニューロン側を下にして準備したチャンバーに置きます。カバーの片側に触れ、最初にグリースに滑り込ませ、端の周りに圧力を加えて、気泡を閉じ込めずにカバーを平らにします。

余分なイメージング媒体がこぼれることが予想されますので、余分なイメージング媒体を拭き取ってください。ただし、カバーがずれないように注意してください。チャンバーを予熱されたプラットフォームヒーターに移動し、チャンバーを所定の位置に固定します。次に、チャンバーをステージに移して、光退色と光毒性を減らします。

トランスフェクションされた細胞を見つけるために必要な最小限の強度にランプを調整します。次に、目的のセルを見つけます。40倍などの低倍率のオイル対物レンズを使用すると、計画された検索パターンに固執して、カバースリップを最大限にカバーし、冗長な画像取得を回避することが有益です。

目的のフィールドが特定されたら、蛍光標識した目的のタンパク質のチャネルを切り替えます。60倍から100倍などの高倍率オイル対物レンズに切り替え、ランプ強度を高設定に戻します。ストリームアクイジションまたはイメージングソフトウェアの同等の機能を使用して、高速移動するオルガネラの蛍光標識タンパク質ダイナミクスを記録します。露出時間と露出間の遅延を最小限に抑えて、高いフレームレートで録画を生成する必要があります。

画面上のプレビューで観察された焦点ドリフトは、手動フォーカス調整によってリアルタイムで修正できます。位相画像と、後で分析およびプレゼンテーションに必要なその他の付随する画像を必ず撮影してください。カバースリップをさらに探索して次の録音を行う前に、すべての画像を保存してください。

通常、1つのカバースリップからの3〜5回の録音が成功したと考えられ、カバースリップは30〜60分間画像化されます。損傷した細胞のトランスポーターが減少するため、一般的な細胞の健康における各光毒性を念頭に置く必要があります。ライブセルイメージングの観察は、通常、視野内の蛍光タグ付きオルガネラの動きを示す画像のスタックとも呼ばれる記録で構成されます。こちらは、高密度コアのiCalトランスポートの代表的なムービーです。

色を反転させて見やすくしています。動いているパーティクルに注目してください。CHグラフは、各時点がグラフの列で表されるラインスキャンを並置することにより、粒子の動きを示す画像です。

この図は、反対方向に移動する 2 つの粒子が CH グラフでどのように表されるかを示しています。クロノグラフをさらに分析することで、粒子の磁束速度、ランレングスの反転、静止粒子に関する情報を得ることができます。こんにちは、dsco小胞輸送と培養カバの首都ニューロンの高速記録を取得する方法を紹介しました。

この手順を実行する際には、インキュベーターからステージへの移行中の細胞のストレスを軽減するために、イメージングチャンバーとプラットホームのすべてのコンポーネントを予熱することを覚えておくことが重要です。迅速かつ慎重に作業する必要があります。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。