初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

生細胞イメージングは、オルガネラの輸送ダイナミクスを研究する際に特に有用です。このビデオでは、培養海馬ニューロンにおいて高密度コア顆粒をイメージングするために用いられる手順を解説します。まず、DNAMEM培地とリペクトミー（lipectomy）トランスフェクション試薬を混合して、トランスフェクション複合体を作製します。

海馬ニューロンはグリア単層に向かい合うように倒立カバーガラス上で培養されているため、トランスフェクション試薬に曝露させるには、これらのカバーガラスを反転させる必要があります。GFPタグ付き高密度コア小胞輸送タンパク質が十分に発現するまで待機した後、イメージングチャンバーを構築します。培養ニューロンにおける高密度コアICALのイメージングは、広視野蛍光顕微鏡を用いて行うことができます。

このプロトコルは柔軟性が高く、ミトコンドリア、エンドソーム、ペルキシソームなどの他の細胞小器官のイメージングにも適応させることができます。こんにちは、サイモンフレーザー大学の細胞神経科学研究室のマイケル・シルバーマンです。私たちは、神経細胞内で細胞小器官がどのように移動するかに注目しています。

この問いに取り組むため、培養海馬ニューロンにおいて膜結合オルガネラ、具体的には高密度コア小胞を標識します。その方法について説明するため、ここからはデビッドに代わってもらいます。こんにちは、Silverman研究室のデビッドです。

本日は、広視野ウエスタン顕微鏡を用いた、高密度コア小胞および培養ニューロンのライブセルイメージングの手順について説明します。それでは始めましょう。ほとんどの実験では、6 cmディッシュあたり250,000個の細胞密度で培養したラット海馬ニューロンのディッシュを使用します。各トランスフェクションに向けて、プラスミドDNA用とトランスフェクション試薬用の2本の1.5 mLチューブにラベルを貼ってください。

ラミナーフローフード内にて、室温で1本のチューブに1 µgのプラスミドDNAと100 µLのMEMを混合します。この際、サプリメントを含まないMEMを使用してください。別のチューブに6 µLのlipと100 µLのMEMを混合します。ダブルトランスフェクションを行う場合も同量を使用できますが、その場合のlipとDNAの比率は半分になります。

脂質試薬の保存期間を維持するため、常に冷蔵保存またはベンチトップクーラーで保管し、チューブを室温で5分間インキュベートします。MEMで希釈したDNA混合液を脂質チューブに移し、APEで緩やかに混合した後、室温で30分間インキュベートします。25分後、培養ニューロンへの細胞毒性ダメージを最小限に抑えるため、50 millimolarのK neuronic acidを60 µL添加します。

GLモノレイヤーの上に吊り下げられたカバースリップの裏面でニューロンを培養しているため、カバースリップを反転させてニューロンをトランスフェクション溶液にさらす必要があります。滅菌ピンセットを使用して、カバースリップを慎重に反転させ、裏面を上にしてください。カバースリップ同士が重ならないように配置します。

カバースリップのニューロンコーティング面や、ディッシュのgglコーティング面を擦らないように注意してください。30分間のインキュベーション終了後、6 cmディッシュから約0.5 mLの培地を取り出し、チューブ内のDNAと穏やかに混合します。DNA溶液をディッシュに戻し、培地表面に均等に滴下してください。

ディッシュを一方方向にゆっくりと前後にスライドさせますが、培地を膨らませないように注意してください。一方向への混合後、一旦停止し、直交する方向で同様の操作を繰り返し、DNAリポプレキシス複合体をディッシュ全体に均一に分散させます。37°C、5%二酸化炭素の組織培養インキュベーター内で90分間インキュベートします。

インキュベーション後、カバーガラスを裏返し、重ならないように並べます。最後に、DNAの発現を希望の時間（通常はインキュベーター内で一晩から48時間）まで進行させます。培養海馬ニューロンにおけるGFP標識濃密コア顆粒のライブイメージングには、CCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡が必要です。

温度コントローラーと対物レンズヒーターを備えたイメージングチャンバーが必要です。チャンバーには開放ポートがないことが望ましく、これはチャンバーの注文時に指定することができます。次に、顕微鏡カメラ、蛍光灯、および画像取得ソフトウェアを起動します。

チャンバープラットフォームと対物レンズヒーターの電源を入れます。このタイミングで、対物レンズにオイルを1滴滴下しておくのが適切です。次に、加熱プラットフォームとイメージングチャンバーを準備します。

操作しやすくするため、チャンバー上部の片側に油性マジックで印を付けます。チャンバーを上向きにして、最適なチャンバーホルダーとなる50 milliliterチューブの蓋の上に置きます。

「top」と表記されたチャンバー側面の穴の周囲にある溝に、グリースをリング状に塗布します。グリースがチャンバー内に入ると観察領域が減少するため、塗りすぎないように注意してください。ピンセットを使用します。

未使用の清潔な18 cmのカバーガラスをチャンバーの上側に装着します。カバーガラスの端を軽く押し、チャンバーの凹溝内で密閉状態にします。チャンバーを反転させ、反対側（底面）の溝にも同様にグリースをリング状に塗布します。

イメージング培地750 µLをチャンバーに移します。これは多めの量ですが、グリースによって培地の漏出が防がれ、また十分な量があることで、細胞を載せたカバーガラスを適用した際に気泡が混入するのを防ぐことができます。準備したチャンバーは、使用するまで組織培養インキュベーター内で保存してください。

イメージング培地が蒸発し、組成が変化するため、1時間以上の長時間インキュベーションは避けてください。ライフスタイルイメージング用の最終的なチャンバー組み立てのために、準備したチャンバーとトランスフェクション済みカバーガラスを入れたディッシュを、インキュベーターから組織培養フードへ移動させます。滅菌済みピンセットを使用して、トランスフェクション済みディッシュからカバーガラスを1枚慎重に取り出します。

次に、カバーガラスの端をキムワイプに触れさせ、培地を吸い取ります。続いて、カバーガラスのニューロン側を下にして、準備したチャンバーの上に置きます。まずカバーガラスの片側をグリースに接触させ、端の周囲に圧力をかけて、気泡を閉じ込めないようにカバーガラスを平らに密着させます。

余剰なイメージング培地が溢れ出ることが予想されます。カバーガラスをずらさないように注意しながら、余剰なイメージング培地を拭き取ってください。チャンバーを予熱したプラットフォームヒーターへ移動させ、チャンバーを固定します。次に、光退色と光毒性を低減させるため、チャンバーをステージへと移します。

ランプの強度を、トランスフェクションされた細胞を確認するために必要な最小限の強さに調整します。次に、目的の細胞を探します。40倍などの低倍率の油浸対物レンズを使用する場合、カバーガラス全体を最大限にカバーし、重複した画像取得を避けるために、計画的な探索パターンに従うことが有効です。

目的の視野を特定したら、目的の蛍光標識タンパク質のチャネルに切り替えます。60倍から100倍などの高倍率油浸対物レンズに切り替え、ランプ強度を高設定に戻します。高速で移動するオルガネラの蛍光標識タンパク質のダイナミクスを記録するには、ストリーム撮影またはイメージングソフトウェアの同等の機能を使用してください。高いフレームレートで記録を行うため、露光時間および露光間のディレイは最小限に抑える必要があります。

画面上のプレビューで観察される焦点のドリフトは、手動でのフォーカス調整によりリアルタイムで補正することが可能です。後での解析やプレゼンテーションに必要となる位相差像およびその他の付随する画像を必ず撮影してください。カバーガラスのさらなる探索や次の録画を行う前に、すべての画像を保存してください。

通常、1枚のカバーガラスから3〜5回の記録が得られれば成功と考えられます。各カバーガラスのイメージングは30〜60分間行いますが、損傷した細胞では輸送能が低下するため、光毒性と全般的な細胞の状態に留意する必要があります。生細胞イメージングの観察は、通常、視野内の蛍光標識されたオルガネラの移動を示す、画像スタックとして知られる記録で構成されます。以下は、高密度コア型iCal輸送の代表的な動画です。

観察しやすくするため、色を反転させています。移動する粒子に注目してください。CHグラフは、各時点をグラフの列として表すラインスキャンを並置することで、粒子の動きを視覚化した画像です。

この図は、互いに反対方向に移動する2つの粒子がCHグラフでどのように表現されるかを示しています。クロノグラフをさらに分析することで、粒子の流速、走行方向の反転、および静止粒子に関する情報を得ることができます。ここでは、培養されたヒポカンパスニューロンにおけるdsco小胞輸送の高速記録の取得方法について説明しました。

この手順を行う際は、インキュベーターからステージへ移動させる際の細胞へのストレスを軽減するため、イメージングチャンバーとプラットフォームのすべての構成要素をあらかじめ予熱しておくことが重要です。迅速かつ慎重に作業してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。