ライブの視覚化ショウジョウバエグリア - 神経筋接合部

この手順では、まずショウジョウバエ幼虫を準備し、体を反転させて、体壁筋細胞表面に関連する運動ニューロンおよびグリア細胞を露出させます。具体的には、シナプス前ニューロン末端の蛍光染色、グリア細胞およびシナプス後筋細胞膜を標的としたGFPおよびDsRedの内在性発現、そしてパラシナプス間隙の可視化を組み合わせて行います。蛍光染料を用いることで、生体標本においてグリア神経筋接合部で起こっている構造的変化を鮮明に観察することができます。こんにちは。私はブリティッシュコロンビア大学動物学部のVanessaのALS研究室のD Brinkです。今日は、共焦点顕微鏡を用いて生きた幼虫組織をイメージングするための、組織標本作製法と2種類の細胞標識技術について解説します。

当研究室では、神経筋接合部のグリア細胞を研究するためにこの手順を用いています。それでは、全く異なる手法について説明します。「インサイド・アウト」組織標本の作製は、幼虫のステージ判定から始まります。本手順では、サイズが大きく解剖しやすいため、3齢遊泳期（W3）幼虫を用いて実演します。活発に這い回っているW3幼虫のみを使用してください。

次に、二回蒸留水を入れたペトリ皿の中で、非常に柔らかい絵筆を用いて幼虫の表面を洗浄します。幼虫を洗浄することは、光学的な視認性を向上させ、細菌を減少させるため重要です。洗浄後、幼虫を5 mMグルタメートを含む氷冷HL6液 3 mLが入った小型のペトリ皿に移します。

動物が動きを止め、弛緩するまでディッシュを氷上に置きます。通常、これには約2分かかります。幼虫が動かなくなったら、利き手にスプリングシザーを、もう一方の手に極細先ピンセットを持ち、解剖顕微鏡を用いて組織の解剖を開始します。動物をディッシュの底にそっと固定しながら、シザーで体壁に小さな穴を開け、体壁内外の圧力を均等にします。

ピンセットを用いて後方の2節を切除し、内臓を剥離します。脂肪体の一部が切開部から体腔外に露出する可能性があります。この組織も同様に切除してください。

そのまま、微細ピンセットで幼虫をシャーレの底に軽く押し付けて保持し続けます。もう一方の手で、先端の丸い0番の昆虫ピンを持ち、それを幼虫の口器に押し当てます。拳の上で靴下を裏返すようにして、口器を体腔へと押し込みます。

裏返した組織はこのようになっているはずです。超極細の解剖用スプリング鋏を用いて、体壁から脂肪体と気管を切り離します。脂肪体はできる限り多く除去してください。

気管を引っ張ったり、神経系を切り離したりしないよう細心の注意を払ってください。気管を断裂させると、体壁筋に穴が開いてしまいます。解剖が完了したとき、筋肉は不透明であったり収縮していたりせず、半透明で弛緩した状態である必要があります。

グルタミン酸を含まないHL6溶液に室温で筋肉を入れると、律動的に収縮する可能性が高くなります。中枢神経系（CNS）の運動パターンジェネレーターが活性化しているため、無傷の裏返しになった体壁は、背面および腹面の正中線に沿って半分に折りたたまれる傾向があります。したがって、この準備試料では、動物の左半分または右半分を可視化することになります。

最後に、ブリッジカバーガラス法を用いて組織を顕微鏡スライドに封入します。組織の封入手順については後述します。神経バトン（neuronal batons）の標識を開始するために、HL sixに含まれる蛍光標識一次抗HRP抗体溶液を30 µLピペットで採取し、ペトリ皿に1滴落とします。

次に、反転させた体壁標本をダイ浴に浸します。約5分後にニューロン末端のラベルが見え始めますが、完全で鮮明なラベルを得るためには10〜20分間インキュベートしてください。

過剰なHRPラベルを洗い流すため、組織を0.5 mLのHL sixに入れ、室温で10〜30秒間置きます。結合していない染料は速やかに洗い流されるため、洗浄サイクルを長くしたり強力に行ったりする必要はありません。これでラベル付けされた組織の封入および顕微鏡による観察が可能です。

先ほど示した生体抗体標識プロトコルの変法として、蛍光標識デキストリンを用いて、液体で満たされた細胞外空間を強調する方法があります。この手順を開始するには、蛍光標識デキストリン染料をHL sixで0.001 mg/mLに希釈します。デキストリンが細胞外空間に拡散する正確なタイミングを重視しない場合は、デキストリン濃度を調整する必要があるかもしれません。

ブリッジカバーガラス上に染料を20 µL滴下し、組織標本を染料浴に転移させます。inside-out組織に灌流を行う必要がない場合、またはHL sixの量を少なく抑える必要がある場合は、ダブルブリッジスライドにマウントすることができます。まず、非常に清潔な顕微鏡スライドガラス上に、18 mmの正方形カバーガラス2枚を瞬間接着剤で貼り付けます。

カバーガラスの端から2 mmの隙間を空け、その隙間がスライドの中央付近にくるように配置してください。接着剤を完全に乾燥させてください。そうしないと、組織標本の周囲にある水性媒体の上に膜が形成されてしまいます。

次に、カバーガラスの隙間にHL sixを30 µL滴下します。反転させた組織をHL sixの滴の中に配置します。幼虫が大きく、画像取得システムのピクセルアレイに制限がある場合は、組織を斜めに配置する必要があるかもしれません。

3枚目の18 millimeter カバースリップの端に少量のワセリンを塗り、組織上の接着された2枚のカバースリップの上に、ワセリンを塗った面を下にして配置し、軽く押さえます。ここでは、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて得られた、裏返し幼虫標本の急性的蛍光標識という2つの手法による結果を示します。1つ目は、生体内の anti HRP 標識された Buton 終末を含むグリア・神経・筋肉シナプスの光学スタック画像です。

筋細胞の表面には、青色で擬似着色された明るくラベルされたニューロンボタン型の終末が見えます。画像スタックの中央には、緑色で示されたGFPラベルのグリア突起と、青色でHRPラベルされたバトンが確認できます。バトンを囲むように、中層および深層において赤色に染まったポケット状のSSR（シナプス網状構造）の横断面が見え、これらはDS redでラベルされています。

SSRは筋肉細胞の特異的なシナプス領域です。BNSは筋肉細胞内のポケットに収まっており、緑色のグリア細胞突起の一部も同様に収まっています。グリア細胞の突起はBNSとSSRの周囲に介在していますが、スタックの最深層にあるように、シナプス表面を毛布のように覆っているわけではありません。

緑色のグリア細胞の突起と赤色のSSRは確認できますが、ブトン末端はそれほど多くは見られません。また、筋肉を支配する運動神経の横断面も確認できます。グリア細胞が運動神経を包んでいるため、ここも緑色に染まっています。

inside-out larval preparationを用いた急性蛍光ラベル化の2つ目の結果は、蛍光デキストリンでラベル化されたシナプスです。ここでは、パラシナプス間隙またはシナプス間隙内の液体が赤色にラベル化されています。光学スタック画像の表面層には、赤色デキストリン色素の液体層が存在し、それが筋細胞膜の波状の陥凹部に蓄積している様子が見て取れます。

スタックのより深い層では、蛍光デキストリン染料がシナプス間隙に浸透しており、ニューロン末端と青色でラベル付けされたSSRポケットの間に、小さなドーナツ型の染料のプールが形成されています。これが染料で強調されたシナプス間隙です。画像スタックの深い層では、緑色のグリア層板は間隙への染料の浸透を妨げません。

最も顕著な特徴は、青色でラベル付けされた筋肉のSSRまたはシナプス領域と、緑色の平坦なグリア突起です。同様に、深層に見られる除神経軸索周囲のグリア鞘も緑色です。グリア鞘はデキストリン色素を排除しているように見えます。

ショウジョウバエ幼虫のインサイドアウト組織標本を用いて、グリア-神経-筋肉シナプスを可視化する新しい方法をご紹介しました。組織を調製する際は、組織を慎重に扱うよう努め、筋肉が弛緩していること、および末梢神経が損傷していないことを確認することが重要です。最後に、マルクスの言葉を引用して締めくくりたいと思います。

光陰矢のごとし。恐怖はバナナのように飛ぶ。