Name: 解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: 学ぶ C. elegansの神経筋接合部を解離して電気生理学的記録を行う手法。パッチクランプ技術によりシナプス活動を定量的に解析し、シナプス変異体の機能を詳細に研究できます。

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この記事は、JERにNIHの補助金によって賄われていた。私は録音のデモの1つで使用コリン作動性運動ニューロンにチャネルロドプシンを発現するトランスジェニックワームを提供するための博士アレックスゴットシャルクに感謝したいと思います。

解剖のために使用するツールのA.の準備。 <ol><li>解剖/録音室：私たちは通常、22 mmの直径の円形カバーガラスを十分に収容できる大きさであることを中心にドリルで丸穴で、1 / 16インチの磁性シートから私たちの記録室を構築する。チャンバーの外側の寸法は、レコーディングを行うために使用される顕微鏡のステージに依存します。磁性シートの裏面に、私たちはカバーの各隅に低い溶融Paraplax組織埋め込むワックスのペレットを配置することにより、チャンバーに付着する48 × 60 mmのカバースリップを、添付ガラスとチャンバーの間に挟まスリップ。それは連続的な層の接着チャンバーにカバースリップを形成するまでワックスは、その後、ガラス板を上に向けて、ホットプレート上で溶融する。ワックスはすぐに溶けて、このステップは放置しないでください。チャンバーは削除と同時にワックスが溶けているように冷却する必要があります。 22ミリメートルの円形空洞の内側の縁に沿ってseepedている過剰なワックスは、かみそりの刃のエッジを使用して削除できます。 </li><li> Sylgardコーティングされたカバースリップ：解剖が22ミリメートル、録音室の円形の空洞内に配置されているSylgardコーティングしたカバースリップ上で実行されている。 Sylgardのコートは、シアノアクリル接着剤がダウンしてもワームがそれが差し込まになったときに接着剤ピペットチップをバックブレークするクッションとして機能するときに接着スリップカバーに付着することができます。 Sylgardは（10重量部硬化剤1部に対して、シリコーンベース）の指示を製造するにしたがって、新鮮で構成されています。 Sylgardの小滴は、各カバースリップ上に配置され、さらに表面を作るためにかみそりの刃のエッジを使用して全体に染みています。コー​​ティングされたカバースリップは、大型フラットふた付きの容器に入れて治すために一晩65℃程度のオーブンに残されます。 </li><li>ピペットは：一般的に、我々は、電極プラーを使用して、筋肉からキューティクルの切開と記録を作成、接着ワーム用ピペットを生成するために同じ1ミリメートル、外径のフィラメントホウケイ酸ガラスを使用してください。この段階では、ピペットのいくつかの迅速な交換を必要とすることができるように解剖を試みる前に、ピペットのjarファイルをプルすることをお勧めします。 </li><li>グルーアプリケーター：接着剤は口圧によって、接着剤のピペットの先端からロードして適用されます。接着のピペットは、ピペットのガラス（通常1 mm）の外径と一致する内径を有するポリエチレンチューブの2フィートピースの一端に挿入されます。チューブのもう一方の端は、マウスピースとして機能するエッペンドルフピペットの先端を保持しています。 </li><li>抽出ピペット：キューティクルの切開が行われた後、ワームの内臓は、ワームの空洞から削除する必要があります。これは、接着剤の塗布に似ていますが、この場合にはガラスの抽出ピペットチップが戻って十分に卵と内臓は簡単にワームの空洞の外バキュームを可能にするために切断されるエッペンドルフピペットの先端に取り付けられたチューブの部分で達成されます。 </li></ol> B.解剖<ol><li>録音室で円形のワックスペンラインは、Sylgardコーティングされたカバースリップを所定の位置に確実に押されているチャンバー（Sylgard -コートが上を向いて）の境界に近い描画されます。このワックスのラインは、カバースリップを固定化し、下に浸透し、解剖し、記録中にカバースリップを外れからレコーディングソリューションを防ぎます。チャンバーは、細胞外記録液で満たされているといくつかのワームは、ワームのピックを使って中央に配置されます。ワームは、溶液中で泳ぐだろう、しかし練習と、これらのワームは、このような動きを防ぐために冷却するように、それ以上の手続きなしでダウン接着することができます。トレーニングの段階では、それは水泳が損なわれている接着変異体ワームを（そのようなUNC - 31変異体のような）練習することができます。 </li><li>ワックスや粘土で開催されたPCRのキャップから作ら接着剤の容器は、シアノアクリル接着剤の作業用ストックを保持するために使用されます。記録ピペット（通常は〜4メグオームの抵抗）と同様の先端寸法と接着剤のピペットは、接着剤を適用するために使用されます。グルーアプリケーターを用いて、接着剤の少量の接着剤が吸い取られるようにピペットチップを可視化するために解剖スコープを使用して、接着剤のピペットに吸い上げています。 </li><li>シアノアクリル接着剤（HistoacrylBlue、Aesulap）は細胞外記録液と接触すると重合する、従ってそれが硬化から接着剤を防止し、ピペットを差し込むためにチャンバー液に入ると接着剤のピペットで正圧を維持することが重要です。とすぐに接着剤をピペットでチャンバーの溶液中にあるように、接着剤の小さいながらも一定の流れが閉塞を防ぐために口圧力制御下にSylgardの表面に適用する必要があります。ピペットがなった場合、それが時には優しくsylgardコーティングされたガラスに関するヒントをタップしてブロックを解除することができるプラグイン。それは、接着剤のワームを試みる前に、接着を実践することをお勧めします。あなたが日常的にワームの幅よりも細い線で作られた文字で、Sylgard上で接着剤で自分の名前を書くことができるなら、procの準備が整いました接着ワームの表皮にEED。 </li><li>接着剤ワームをするために、頭部やワームのテールのどちらかに接着剤の少量を添付するために正圧を使用し、急速にSylgardの表面にワームを描く。エッジに近すぎる接着ワームは、記録ピペットで到達が難しくなるのでチャンバーの中心近くにワームを添付してみてください。その後、（腹側筋肉の録音のための）内側に面した外陰部とC -位置にワームを強制的に、開始、添付ファイルからワームのキューティクルの背側縁に沿って接着剤の一定のストリームを適用する。この接着剤の行の任意のギャップは、ワームが強くキューティクル切開のステップ中に切り離すことは、ワームを防ぐために、接続されているので、入力されているはずです。 </li><li>キューティクル切開を行うには、ハンドヘルド解剖のピペットに切り替えます。このピペットは、接着剤/録音ピペットよりもシャープになると短く、頑丈なシャフトを持っている必要があります。解剖範囲で最高倍率を使用して、ワームの縦軸にピペットを平行に整列し、キューティクル/接着剤界面での切開を行うワーム（近くに外陰部に）に沿って中間点に関するヒントを挿入する。この切開は、切開のポイントを介して卵と腸を強制的にワームの静水圧を解放します。あなたが咽頭に到達するまで、手紙を開くために同様のスライス動きでワームの頭に向かってキューティクルを切断続ける。ワームの内臓を真空抽出ピペットに切り替える。切開をクリアした後、開いたキューティクルは、その円筒状の形状を保持します。 Sylgardの表面にクチクラの切り口を下に溶接見つけるために新鮮な接着のピペットを使用してください。 NMJsを損傷または不明瞭にしないため、この段階で最小限の接着剤スポットを使用することが重要です。 腹側神経索と体壁の筋肉は、現在公開されています。 </li><li> 、NMJsを覆う基底膜を除去チャンバーから細胞外記録のソリューションを吸うと、約10-20秒間コラゲナーゼを（細胞外記録液の0.4mg/ml）に適用するには、削除して、新鮮な細胞外記録液で数回洗浄する。録音の段階に進みます。 </li></ol> C.パッチクランプ記録<ol><li>中央ワームのに10倍対物レンズを用いてまで右顕微鏡のステージ上の記録室を置きます。 DICと40Xの水出現の目標に切り替え、体壁の筋肉と神経索が完全な状態であることを確認してください。ワームの縦軸は電極が左右両側から導入できるように、範囲の前縁と平行になるようにワームを配置します。 </li><li>標準的なパッチクランプ技術を使用して筋肉にパッチを適用します。約4メグオームの抵抗の記録電極が適しています。電極は、筋肉の膜に触れた後gigohmシールが得られるまで、負圧を増加させる。ホールセル電圧クランプ記録モードの場合は、より多くの吸引を適用し、gigohmシールが破裂するまで膜を攻撃する。良い録音では、野生型の成虫の体壁の筋肉は、通常、約70 pFの細胞膜の静電容量を持っているし、安定的に最小限の保持電流（〜50 -60 mVの保持電位で少なくとも10分間記録することができますPA）。 </li><li>塩化ナトリウム150、KClの5、CaCl 2の 5、MgCl 2の 4、グルコース10、ショ糖5、HEPES 15（pHは7.3、〜330mOsm）：細胞外記録のソリューションは、（mm）で構成されています。パッチピペットは（mMで）含まれています：KClを120、KOH 20、MgCl 2の 4、（N -トリス[ヒドロキシメチル] mthyl -2 -アミノエタン-スルホン酸）TES 5、二水和物CaCl 2で 0.25、硫酸ナトリウム ATP 4、ショ糖36 、EGTA 5（pHは7.2、〜312 mOsm）。注：これらのソリューションは、人工的にGABA受容体を介した電流は-60 mVの保持電位で塩素流出による内側になるように、塩化物と筋肉細胞を読み込むこれらのソリューションのバリエーション（詳細については出版物を参照）が使用されている。 </li><li>リリースを誘発。一般的に我々は、パッチを適用した筋肉の前腹側神経索の細胞外溶液を含む第二の電極を配置する。この緩やかなパッチの構成は、野生型ワームで最大の誘発反応（通常は2.0から2.5 NA）を達成するために短期間の大規模な脱分極刺激（ボルトの10秒のオーダー）（1 - 2msの）が必要です。このアプローチの限界は、1）神経索が不可逆的に損傷し、2する前に、ほんの数誘発反応が理由は不明）に配信することができる、唯一のコリン作動性誘発反応は、この刺激の構成を使用して誘発することができます。 </li><li>光は、チャネルロドプシンの刺激を活性化。最近、ゴットシャルクのラボでは、式4を駆動するために使用されるプロモーターに応じて、神経細胞のサブセットで、光刺激により細胞膜を脱分極藻類由来のチャネルロドプシンを発現するトランスジェニックワームが生成されています。 Cの場合で虫 NMJ、どちらかのコリン作動性運動ニューロンやGABA作動性運動ニューロンにチャネルロドプシンを発現している統合された行が現在availablですE.チャネルロドプシンのみが全トランスレチナールはオプシン部分に関連付けられているとき点灯に応答するので、このアプリケーションで使用するワームは、網膜が混入細菌上に成長されている必要があります。緑色の光パルスは、繰り返しtransgenicワームが使用されているかによって、アセチルコリンやGABAのどちらかの誘発放出をcausing channelロドプシンをアクティブにすることができます。これらのトランスジェニックワームは、変異株に交差することができます。前の電気刺激に対するこの手法の利点は次のとおり、1）光活性化はGABA作動性またはコリン作動性運動ニューロンは独立して調査することができるのいずれかからリリースを誘発）、多くの繰り返しの刺激を行うと2できるように、神経損傷を引き起こすことはありません。 </li><li>高浸透圧誘発性放出。容易に放出可能小胞プール（記録された筋肉の上にすべてのNMJのからプライミング小胞の合計プールを反映する）の大きさを測定するために、高浸透圧、細胞外溶液の入った圧力ピペットは（追加のショ糖を添加することにより〜850 mOsmに調整）に使用されます。 1-3秒の圧力パルスのアプリケーションでは、上記の標準液を使用して非同期のポストシナプスのイベントの弾幕を生成する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> 図1：Cの回路図の概要elegansの解剖および神経筋録音の設定 ガラスと硬化全体Sylgardのスミアドロップによるsylgardコーティングされたカバースリップは、一晩プレハブ記録室の円形の空洞内に配置し、記録液で覆われている。中央に配置されたワームは、接着剤ピペットを用いて、ワームの背側に接着剤を適用し、先頭または末尾から開始Sylgard表面に糊付けされています。一度接着が完了すると、キューティクルと接着剤間の界面における外陰部に隣接切開は、ガラスの針で行われ、（赤のミシン目を参照）頭に向かって拡張されます。内臓や体腔から卵の抽出に続いて、切開の面取り部は腹側神経（緑）と体壁の筋肉（赤）を公開するSylgardに接着剤でスポット溶接されている。外陰部の前腹側、内側の筋肉は、パッチクランプされ、刺激電極は、神経索に上流に配置されます。 代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Represenative図" width="600" height="404" />全細胞、電圧クランプ体壁筋の録音は、（電気的に誘発、光誘発し、高浸透圧応答）上記の3つの刺激の各プロトコルに示されている。すべてのケースでは腹側内側体壁筋を-60 mVにクランプされます。 A.野生型筋細胞は、通常、私たちの標準的なレコーディングソリューションで内因性の内向きの小型のシナプス電流の高い率を示す。 B.前腹側神経索の2msの脱分極は、野生型ワームで2〜2.5前後nAの大きな誘発反応で生じるいくつかのシナプスからの同期放出を引き起こします。 AとBの野生型のトレースの右側にある代表的なトレースがひどくまとまりのない変異体（UNC - 18）におけるシナプス放出を示す。パネルCは、コリン作動性ニューロンにおけるチャネルロドプシンを発現する野生型ワームの神経筋接合部からの光誘発反応を示しています。 2msの光パルスは、通常、1.5〜1.8 nAの応答を生成します。 D. 1秒のための筋肉の上に850 mOsm高浸透圧の生理食塩水圧力放出は、小胞の容易に放出可能プールを表すミニチュアシナプス電流の非同期弾幕を生成します。

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Richmond, J. E., Davis, W. S., Jorgensen, E. M. Nat Neurosci. 2 (11), 959-959 (1999).</li>
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</ol>

遺伝的モデル生物C、elegansのは理想的にシナプスのタンパク質をコードする遺伝子の変異の機能解析を通じて、シナプス伝達の研究に適しています。ここではCをレンダリングする解剖手法を記載している虫は、電気生理学的解析のためにアクセスNMJs。付属のビデオは 、C言語の重要な手順を示していますelegansの解剖とシナプス活性を測定するために用いられる代表的な録音の設定。このテクニックを学ぶことに最大の課題を提起三つのステップとしては、1）ワームの接着のステップ、2）成功した​​切開を行う、と体壁の筋肉への3）パッチ。これらをマスターしたら、この準備は、電圧クランプや電流クランプモードでのポストシナプス筋の録音に適している。誘発刺激に対する応答は、容易に変異さまざまな経歴でこの解剖の準備を用いて測定することができます。野生型成体のワーム（長さは1 mm）をすでに分サイズを考えると、成人に達するか、または骨張った残っていないシナプスの変異体は、この解剖のアプローチに従順になる場合があります。いくつかのラボが正常にCから記録されているも...

解離性とc. elegansの神経筋接合部から録音する

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

神経伝達は、神経細胞が急速な時間スケールで、彼らのポストシナプスのターゲットに化学信号を介して情報を転送するプロセスです。この複雑なプロセスがリサイクル、分泌小胞、カルシウムセンシング、小胞融合、シナプス後受容体の局在と機能し、最後の適切なシナプス接続、電気信号​​の伝導、標的とプライミングを確保するために多くの事前事後シナプスタンパク質の協調活動が必要ですメカニズム。神経科学者としては、これらの各ステップで機能するタンパク質の解明とその​​作用メカニズムを理解することが、当社の目標です。シナプスからの電気生理学的記録は、シナプス伝達中に発生する基本的な電気的事象から読み出さ定量化を提供しています。分子および遺伝学的ツールの強力な配列とCのシナプスタンパク質を操作するために利用可能なこの手法を組み合わせることにより、 elegansは 、我々はシナプス伝達の結果として得られる機能的な変化を分析することができます。 C.虫は、運動ニューロンと体壁の筋肉のコントロールの移動、これらのシナプス1のため、まとまりのない運動器官の表現型（UNCのとして知られている）を持つ変異体がしばしば乱すシナプス伝達の間に形成さNMJs。 UNCの変異体は、細菌の食物源の豊富な供給を維持しているので、彼らは食物を摂取するために、いくつかの咽頭のポンプ機能を維持する限り、実行可能なままです。この、一緒に事実とそのC.虫は雌雄同体として存在し、それらは精巧な交尾行動を必要とせずに変異子孫に渡すことができます。ワームから記録するために我々の最近の能力と相まって、これらの属性は、2,3,7はこの方法UNC変異体の影響の神経伝達を正確に対処するための優れたモデル生物行うNMJs。 解剖の方法は、NMJsを公開するワームの表皮に切開を行うために、シアノアクリル接着剤を使用して、成虫を固定化する伴います。 C.以来、 虫の大人は、解剖は解剖顕微鏡を使用して実行し、優れた手と目のコーディネーションを必要とされる長さはわずか1 mmである。 NMJの録音は全細胞の個々の体壁筋細胞と神経伝達物質の放出をクランプ電圧は、電気刺激、光活性化チャネルロドプシンを介する脱分極4となるすべてが高浸透圧生理食塩水、を含む刺激のさまざまなプロトコルを使用して誘発することができることによって作られています簡単に説明します。

アクセス可能なシナプスの電気生理学のアプリケーションでは、シナプス変異体の分析に有用なシナプス活性の定量的な尺度を提供しています。この記事では、神経筋接合部（NMJ）のを公開するために使用される解剖の方法を説明します<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans（線虫）</em&gt;と簡潔にこの製剤を適用することができる用途のいくつかについて説明します。

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

神経伝達とは、ニューロンが化学信号を用いて、極めて短時間でポストシナプス標的に情報を伝達するプロセスのことである。この...

ガラス上にsogarを1滴塗り広げ、一晩硬化させて作製したsogarコーティングカバーガラスを、あらかじめ作製した記録チャンバーの円形空洞に配置し、記録液で満たします。中心に配置した線虫の頭部または尾部から、グルーピペットを用いて線虫の背側に接着剤を塗布し、シルガード表面に固定します。接着が完了したら、ガラス針を用いて、キューティクルと接着剤の境界にある外陰部付近に切開を加え、体腔から内臓と卵を抽出しながら、頭部に向かって切開を広げます。切開部の切り口を接着剤でsogarにスポット溶接し、腹側神経と体壁筋を露出させます。陰門の前方にある腹側内側筋をパッチクランプし、刺激電極を神経索の上流に配置します。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校生物科学科の准教授、ジャネット・リッチモンドです。本日は、電気生理学的記録のために、ナマコ（sea elgan）の神経筋接合部を露出させる解剖技術をご紹介します。私たちはシナプス伝達を研究するために、この標本作製法を用いています。それでは始めましょう。線虫を扱う前に、手順の少なくとも1日前までにいくつかの器具を製作しておく必要があります。解剖記録チャンバー、Sガードコーティング済みのガラスカバースリップ、古いピペット、接着剤塗布器、および抽出ピペットです。まず、チャンバーを構築します。顕微鏡ステージのサイズに合わせて、厚さ1/16インチのプレキシガラスのシートをカットします。プレキシガラスの中央で記録を行います。直径 22 mm の円形カバーガラスを接着できる十分な大きさの円形の穴をドリルで開けます。低融点パラプラックス組織埋め込み用ワックスのペレットをカバーガラスの各角に配置し、穴の下にあるチャンバーの底面に 48 × 60 mm のカバーガラスを固定します。ホットプレートでワックスを速やかに融解させ、冷却後にプレキシガラスとカバーガラスのスライドの間に薄いワックス層が残るようにします。余分なワックスはブレードで取り除いてください。チャンバーに適合するカバースリップは、22 mmのS guardコーティングカバーガラスです。SARDを機能させるには、製造元の指示に従って調製直後のものを使用する必要があります。調製後、SARDを少量のドロップとして各カバーガラス上に滴下し、ブレードを用いて均一な表面になるように塗り広げます。コーティングしたカバーガラスを蓋付き容器に入れ、65 °Cのオーブンで一晩キュアリング（硬化）させます。これにより、翌日のプロトコルにおける解剖に使用できる状態になります。外径1 mmのシリケートガラスピペットを、抵抗値が約4 MΩになるまで細らせて作製する必要があるため、あらかじめ準備しておくことが推奨されます。Miriam Goodmanによる、プログラマブル・ポラライザーを用いたパッチピペットおよび鋭利な電極の作製に関するJoVE論文を参照してください。電気生理学的な操作を行うための技術的な詳細として、線虫を所定の位置に固定する必要があります。そのためには、グルーアプリケーターが必要です。接着剤塗布器は、内径1mm、長さ2mmのシンプルなプラスチックチューブです。チューブの一端を口に保持します。これはマウスピースを装着することも可能です。チューブのもう一端には、接着剤を満たした1mmピペットを装着します。解剖中には、専用の抽出ピペットも使用します。これは接着剤塗布器と同様にチューブとピペットで構成されていますが、卵や内臓を収容できるようにピペットの先端をわずかに削って調整してあります。まず、チャンバーの周囲に沿ってワックスで線を引くことから始めてください。次に、Sylgardを塗布したカバーガラスを、Sylgard側を上にして押し当てて配置します。ワックスのラインがカバーガラスを固定し、解剖および記録中に記録液が下に浸透してカバーガラスがずれるのを防ぎます。その後、チャンバーに細胞外記録液を満たします。チャンバーの調製に関する組成については、付随するテキストを参照してください。ネマトーダピックを用いて、数匹の線虫を溶液中に配置します。慣れてくれば、泳いでいる線虫を、動きを止めるための追加の手順なしにそのまま接着することが可能です。ワックスやモデリングクレイで固定したPCRキャップ製の接着剤容器に、使用済みのSanoアクリル接着剤のストック溶液を入れて準備します。レコーディングピペットを接着剤アプリケーターの末端に取り付け、アプリケーターを完成させます。次に、解剖顕微鏡下で、口による吸引を用いて接着剤アプリケーターを満たします。接着剤は細胞外記録液に触れると重合するため、線虫に接着させるには習熟が必要であり、困難な作業となります。これを防ぐため、接着剤を常に一定の速度で押し出し、硬化してピペットが詰まることがないようにしてください。もしピペットが詰まった場合は、チップの先をカバースリップに軽く叩きつけることで解消できることがあります。接着剤の取り扱いに慣れるまで練習してください。シルガード上に接着剤で自分の名前が書けるようになれば、線虫のキューティクルを接着する準備が整ったと言えます。まず、操作スペースが十分に確保されているチャンバー中央付近の個体を選択します。次に、線虫の頭部または尾部のいずれかに少量の接着剤を付着させ、線虫をシルガード表面へ素早く引き寄せます。次に、線虫のキューティクルの背面端に沿って接着剤を塗布します。これにより、線虫は外陰部が内側を向いたC字型の姿勢になります。線虫をSylgardに最大限に密着させるため、接着剤のラインに隙間がある場合はすべて埋めてください。これは難しい工程であるため、低運動性変異体で練習することが有用です。31番のように、ちょうど右側にバルブがあります。ここでプレップを回転させ、ガラス針を挿入して切開を開始します。クチクラを切開するには、手持ちの解剖用ピペットに切り替えてください。このピペットは、グルー記録用ピペットよりも鋭く、最高倍率で使用した際に短く頑丈なシャフトである必要があります。解剖顕微鏡下で、ピペットを線虫の長軸と平行に合わせ、クチクラとグルーの界面にある外陰部の近くに先端を挿入します。この切開により線虫の静水圧が解放され、切開点から卵と腸が押し出されます。咽頭に達するまで、手紙の封筒を開けるようなスライス動作で、線虫の頭部に向かってキューティクルを切り続けます。次に抽出ピペットに切り替え、線虫の内部器官を吸引して除去します。切開部を洗浄すると、開いたキューティクルは円筒形を維持します。次に、新しい接着用ピペットを用意します。これを使用して、切開端のクチクラをSylgard表面にスポット溶接するように固定します。この段階では、njsへの損傷や遮蔽を避けるため、接着剤の使用量を最小限に抑えることが重要です。腹側神経索と体壁筋が露出しましたが、NMJを覆っている基底膜をまだ除去する必要があります。これを行うには、チャンバーから細胞外記録液を吸引し、0.4 mg/mLのコラゲナーゼを含む細胞外記録液を注入します。10〜20秒後、コラゲナーゼを除去し、新鮮な記録液で標本を数回洗浄します。これで線虫の電気生理学的記録の準備が整いました。正立顕微鏡ステージ上の記録チャンバーにおいて、10倍対物レンズを用いて線虫を中央に配置し、NMJの位置を確認します。次に、DIC光学系を備えた40倍水浸対物レンズに切り替え、体壁筋と神経索に損傷がないことを確認してください。左右両側から電極を挿入できるよう、線虫を水平に配置します。通常は、陰門の内側にある筋肉である腹側正中体をパッチしますが、虫の背側および腹側の両方の筋肉も容易にパッチすることが可能です。筋肉に接して半円状に見える数個のニューロンを確認します。次に、標準的なパッチクランプ法を用いて筋肉にパッチし、ギガシールを得ます。我々の経験では、ホールセル電圧クランプ記録モードには、抵抗値が約4 MΩの記録電極が適しています。吸引を強め、ギガシールが破れるまで膜に電気刺激を与えます。抵抗値が4MΩになることについてお話ししましたが、あそこを見ると、そうですね、4.9MΩと表示されています。大きさは、通常より大きめです。我々が使用する範囲内ですね。わかりました。では、ここからさらに規模を拡大してみましょう。え？一番下まで来てほしいんです。はい。わかりました。やった。良好な記録が得られている場合、野生型成体線虫の体壁筋は通常、約 70 picofarad の細胞膜容量を持ち、-60 millivolts の保持電位において、約 50 pico amps という最小限の保持電流で少なくとも 10 分間安定して記録することが可能です。筋細胞のパッチクランプが完了すると、第2電極による刺激、光活性化チャネル、Rodin、または高浸透圧溶液の添加により、いずれも測定可能な反応が誘発されます。電気的に誘発された反応を引き出すために、通常は細胞外液を含む刺激電極を、パッチを適用した筋肉よりも内側の腹側神経索上に配置します。このルーズパッチ構成では、10から40 Vの電流による1から2ミリ秒のパルスが必要です。残念ながら、数回の誘発反応の後、神経索に不可逆的な損傷が生じます。また、原因は不明ですが、この構成を用いて誘発できるのはコリン作動性誘発反応のみです。あるいは、異なるニューロン集団でdosinトランスジーンを発現させた光活性化チャネル保持線虫を用いて、放出を誘発させることができます。本手法の準備にあたり、本アプリケーションに使用する線虫はレチノールを添加した細菌上で育成させる必要があることに留意してください。この調製では、450～490 nmのGFP励起フィルターでろ過した高出力の470 nm LEDを用い、チャネルオプシンを繰り返し活性化させます。これにより、チャネルを発現している細胞型に応じて、異なる神経伝達物質の誘発放出が起こります。最後に検討する手法は、記録対象の筋肉に対する複数のニューロンからのシナプス小胞の即時放出可能プール（readily releasable pool）のサイズを測定するために使用できます。これは、パッチを適用した筋肉に高浸透圧の細胞外液を1〜3秒間圧力パルスで投与することで達成されます。その結果、非同期的なポストシナプスイベントが大量に発生します。上述の3つの刺激プロトコル、すなわち電気刺激、光刺激、および高浸透圧応答について、ホールセル電位固定法を用いた体壁筋の記録例を示します。すべての場合において、腹側内側体壁筋を-60 mVでクランプします。野生型の筋細胞は、通常、高い頻度の内因性内向きミニチュアシナプス電流を示します。標準的な記録溶液を用いた場合、前腹側神経索に2 msの脱分極を加えると、複数のシナプスから同期的な放出が起こり、約2〜2.5 nAの大きな誘発応答が得られます。野生型虫において、AおよびBの野生型トレースの右側に示されている代表的なトレースは、重度の不協調変異体におけるシナプス放出を示しています。パネルCは、channel red dosinを発現する野生型虫の神経筋接合部からの光誘発反応を示しています。コリン作動性ニューロンでは、2 msの光パルスによって通常1.5〜1.8 nAの反応が生成されます。筋肉に850 mOsmの高浸透圧生理食塩水を1秒間圧力注入すると、即時放出可能プール（RRP）の小胞を示すミニチュアシナプス電流の非同期的な連続放出が生成されます。ここまで、海辺の elegantly な性質を持つ生物（sea elegance）の神経筋接合部を露出し、電気生理学的記録を行うために我々が使用している解剖技術について説明しました。この技術の習得は困難であり、完璧にこなせるようになるまでには数ヶ月かかる可能性があることを覚えておいてください。しかし、一度習得してしまえば、自転車に乗れるようになるのと同じように、自然にできるようになります。これらの技術を習得すれば、繰り返し行うことで、調製作業はより迅速かつ確実なものになります。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。...

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

幼虫ゼブラフィッシュは、脊髄運動ニューロンとターゲット骨格筋からの同時パッチクランプ記録を可能にした最初の脊椎動物のモデルシステムを表す。このビデオでは、分節キャップ運動ニューロンと標的筋細胞と同様に各セルのタイプから録音するための方法論を識別するために使用される微細な方法を示しています。...

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。...

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部にあるシナプスボタンからのシナプス電流を記録する技術を示しています。この技術により、単一のシナプスブートンの活動をモニタリングすることができ、これは自発的または非同期的なシナプス活動が増強された突然変異型ハエ系統の研究に重要です。...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部におけるシナプス電流の記録

本ビデオでは、マウスの 経対腹部...

全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖

ショウジョウバエ第 3 齢幼虫神経筋接合部シナプス...

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

本稿で説明されたプロトコルは、神経筋接合部で自然を記録するマウス挙オーリス長(ラル) 筋とシナプス後電位の神経誘発 (電流クランプ) と電流 (電圧クランプ)...

オーリスの挙筋哺乳類の神経筋伝達電圧クランプ条件下での試験のための準備

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

ゼブラフィッシュの幼生の神経筋接合部は、シナプス生理学を研究するための魅力的なモデルです。電気生理学や光学イメージングなど、多くの実験技術に適しています。ここでは、直立した落射蛍光顕微鏡下でpHluorinベースのプローブを使用してシナプス伝達をイメージングするためのプロトコルについて説明します。...

解剖された幼生ゼブラフィッシュの神経筋接合部におけるシナプス小胞のリサイクルのライブイメージング

学ぶ C. elegansの神経筋接合部を解離して電気生理学的記録を行う手法。パッチクランプ技術によりシナプス活動を定量的に解析し、シナプス変異体の機能を詳細に研究できます。

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

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