解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

ガラス上にsogarを1滴塗り広げ、一晩硬化させて作製したsogarコーティングカバーガラスを、あらかじめ作製した記録チャンバーの円形空洞に配置し、記録液で満たします。中心に配置した線虫の頭部または尾部から、グルーピペットを用いて線虫の背側に接着剤を塗布し、シルガード表面に固定します。接着が完了したら、ガラス針を用いて、キューティクルと接着剤の境界にある外陰部付近に切開を加え、体腔から内臓と卵を抽出しながら、頭部に向かって切開を広げます。

切開部の切り口を接着剤でsogarにスポット溶接し、腹側神経と体壁筋を露出させます。陰門の前方にある腹側内側筋をパッチクランプし、刺激電極を神経索の上流に配置します。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校生物科学科の准教授、ジャネット・リッチモンドです。

本日は、電気生理学的記録のために、ナマコ（sea elgan）の神経筋接合部を露出させる解剖技術をご紹介します。私たちはシナプス伝達を研究するために、この標本作製法を用いています。

それでは始めましょう。線虫を扱う前に、手順の少なくとも1日前までにいくつかの器具を製作しておく必要があります。解剖記録チャンバー、Sガードコーティング済みのガラスカバースリップ、古いピペット、接着剤塗布器、および抽出ピペットです。

まず、チャンバーを構築します。顕微鏡ステージのサイズに合わせて、厚さ1/16インチのプレキシガラスのシートをカットします。プレキシガラスの中央で記録を行います。

直径 22 mm の円形カバーガラスを接着できる十分な大きさの円形の穴をドリルで開けます。低融点パラプラックス組織埋め込み用ワックスのペレットをカバーガラスの各角に配置し、穴の下にあるチャンバーの底面に 48 × 60 mm のカバーガラスを固定します。ホットプレートでワックスを速やかに融解させ、冷却後にプレキシガラスとカバーガラスのスライドの間に薄いワックス層が残るようにします。余分なワックスはブレードで取り除いてください。

チャンバーに適合するカバースリップは、22 mmのS guardコーティングカバーガラスです。SARDを機能させるには、製造元の指示に従って調製直後のものを使用する必要があります。調製後、SARDを少量のドロップとして各カバーガラス上に滴下し、ブレードを用いて均一な表面になるように塗り広げます。

コーティングしたカバーガラスを蓋付き容器に入れ、65 °Cのオーブンで一晩キュアリング（硬化）させます。これにより、翌日のプロトコルにおける解剖に使用できる状態になります。外径1 mmのシリケートガラスピペットを、抵抗値が約4 MΩになるまで細らせて作製する必要があるため、あらかじめ準備しておくことが推奨されます。

Miriam Goodmanによる、プログラマブル・ポラライザーを用いたパッチピペットおよび鋭利な電極の作製に関するJoVE論文を参照してください。電気生理学的な操作を行うための技術的な詳細として、線虫を所定の位置に固定する必要があります。そのためには、グルーアプリケーターが必要です。

接着剤塗布器は、内径1mm、長さ2mmのシンプルなプラスチックチューブです。チューブの一端を口に保持します。これはマウスピースを装着することも可能です。チューブのもう一端には、接着剤を満たした1mmピペットを装着します。

解剖中には、専用の抽出ピペットも使用します。これは接着剤塗布器と同様にチューブとピペットで構成されていますが、卵や内臓を収容できるようにピペットの先端をわずかに削って調整してあります。まず、チャンバーの周囲に沿ってワックスで線を引くことから始めてください。

次に、Sylgardを塗布したカバーガラスを、Sylgard側を上にして押し当てて配置します。ワックスのラインがカバーガラスを固定し、解剖および記録中に記録液が下に浸透してカバーガラスがずれるのを防ぎます。その後、チャンバーに細胞外記録液を満たします。チャンバーの調製に関する組成については、付随するテキストを参照してください。

ネマトーダピックを用いて、数匹の線虫を溶液中に配置します。慣れてくれば、泳いでいる線虫を、動きを止めるための追加の手順なしにそのまま接着することが可能です。ワックスやモデリングクレイで固定したPCRキャップ製の接着剤容器に、使用済みのSanoアクリル接着剤のストック溶液を入れて準備します。

レコーディングピペットを接着剤アプリケーターの末端に取り付け、アプリケーターを完成させます。次に、解剖顕微鏡下で、口による吸引を用いて接着剤アプリケーターを満たします。接着剤は細胞外記録液に触れると重合するため、線虫に接着させるには習熟が必要であり、困難な作業となります。

これを防ぐため、接着剤を常に一定の速度で押し出し、硬化してピペットが詰まることがないようにしてください。もしピペットが詰まった場合は、チップの先をカバースリップに軽く叩きつけることで解消できることがあります。接着剤の取り扱いに慣れるまで練習してください。

シルガード上に接着剤で自分の名前が書けるようになれば、線虫のキューティクルを接着する準備が整ったと言えます。まず、操作スペースが十分に確保されているチャンバー中央付近の個体を選択します。次に、線虫の頭部または尾部のいずれかに少量の接着剤を付着させ、線虫をシルガード表面へ素早く引き寄せます。

次に、線虫のキューティクルの背面端に沿って接着剤を塗布します。これにより、線虫は外陰部が内側を向いたC字型の姿勢になります。線虫をSylgardに最大限に密着させるため、接着剤のラインに隙間がある場合はすべて埋めてください。

これは難しい工程であるため、低運動性変異体で練習することが有用です。31番のように、ちょうど右側にバルブがあります。ここでプレップを回転させ、ガラス針を挿入して切開を開始します。クチクラを切開するには、手持ちの解剖用ピペットに切り替えてください。

このピペットは、グルー記録用ピペットよりも鋭く、最高倍率で使用した際に短く頑丈なシャフトである必要があります。解剖顕微鏡下で、ピペットを線虫の長軸と平行に合わせ、クチクラとグルーの界面にある外陰部の近くに先端を挿入します。この切開により線虫の静水圧が解放され、切開点から卵と腸が押し出されます。

咽頭に達するまで、手紙の封筒を開けるようなスライス動作で、線虫の頭部に向かってキューティクルを切り続けます。次に抽出ピペットに切り替え、線虫の内部器官を吸引して除去します。切開部を洗浄すると、開いたキューティクルは円筒形を維持します。

次に、新しい接着用ピペットを用意します。これを使用して、切開端のクチクラをSylgard表面にスポット溶接するように固定します。この段階では、njsへの損傷や遮蔽を避けるため、接着剤の使用量を最小限に抑えることが重要です。

腹側神経索と体壁筋が露出しましたが、NMJを覆っている基底膜をまだ除去する必要があります。これを行うには、チャンバーから細胞外記録液を吸引し、0.4 mg/mLのコラゲナーゼを含む細胞外記録液を注入します。10〜20秒後、コラゲナーゼを除去し、新鮮な記録液で標本を数回洗浄します。

これで線虫の電気生理学的記録の準備が整いました。正立顕微鏡ステージ上の記録チャンバーにおいて、10倍対物レンズを用いて線虫を中央に配置し、NMJの位置を確認します。次に、DIC光学系を備えた40倍水浸対物レンズに切り替え、体壁筋と神経索に損傷がないことを確認してください。左右両側から電極を挿入できるよう、線虫を水平に配置します。

通常は、陰門の内側にある筋肉である腹側正中体をパッチしますが、虫の背側および腹側の両方の筋肉も容易にパッチすることが可能です。筋肉に接して半円状に見える数個のニューロンを確認します。次に、標準的なパッチクランプ法を用いて筋肉にパッチし、ギガシールを得ます。我々の経験では、ホールセル電圧クランプ記録モードには、抵抗値が約4 MΩの記録電極が適しています。

吸引を強め、ギガシールが破れるまで膜に電気刺激を与えます。抵抗値が4MΩになることについてお話ししましたが、あそこを見ると、そうですね、4.9MΩと表示されています。

大きさは、通常より大きめです。我々が使用する範囲内ですね。わかりました。では、ここからさらに規模を拡大してみましょう。

え？一番下まで来てほしいんです。はい。わかりました。やった。

良好な記録が得られている場合、野生型成体線虫の体壁筋は通常、約 70 picofarad の細胞膜容量を持ち、-60 millivolts の保持電位において、約 50 pico amps という最小限の保持電流で少なくとも 10 分間安定して記録することが可能です。筋細胞のパッチクランプが完了すると、第2電極による刺激、光活性化チャネル、Rodin、または高浸透圧溶液の添加により、いずれも測定可能な反応が誘発されます。電気的に誘発された反応を引き出すために、通常は細胞外液を含む刺激電極を、パッチを適用した筋肉よりも内側の腹側神経索上に配置します。

このルーズパッチ構成では、10から40 Vの電流による1から2ミリ秒のパルスが必要です。残念ながら、数回の誘発反応の後、神経索に不可逆的な損傷が生じます。また、原因は不明ですが、この構成を用いて誘発できるのはコリン作動性誘発反応のみです。あるいは、異なるニューロン集団でdosinトランスジーンを発現させた光活性化チャネル保持線虫を用いて、放出を誘発させることができます。

本手法の準備にあたり、本アプリケーションに使用する線虫はレチノールを添加した細菌上で育成させる必要があることに留意してください。この調製では、450～490 nmのGFP励起フィルターでろ過した高出力の470 nm LEDを用い、チャネルオプシンを繰り返し活性化させます。これにより、チャネルを発現している細胞型に応じて、異なる神経伝達物質の誘発放出が起こります。最後に検討する手法は、記録対象の筋肉に対する複数のニューロンからのシナプス小胞の即時放出可能プール（readily releasable pool）のサイズを測定するために使用できます。

これは、パッチを適用した筋肉に高浸透圧の細胞外液を1〜3秒間圧力パルスで投与することで達成されます。その結果、非同期的なポストシナプスイベントが大量に発生します。上述の3つの刺激プロトコル、すなわち電気刺激、光刺激、および高浸透圧応答について、ホールセル電位固定法を用いた体壁筋の記録例を示します。

すべての場合において、腹側内側体壁筋を-60 mVでクランプします。野生型の筋細胞は、通常、高い頻度の内因性内向きミニチュアシナプス電流を示します。標準的な記録溶液を用いた場合、前腹側神経索に2 msの脱分極を加えると、複数のシナプスから同期的な放出が起こり、約2〜2.5 nAの大きな誘発応答が得られます。

野生型虫において、AおよびBの野生型トレースの右側に示されている代表的なトレースは、重度の不協調変異体におけるシナプス放出を示しています。パネルCは、channel red dosinを発現する野生型虫の神経筋接合部からの光誘発反応を示しています。コリン作動性ニューロンでは、2 msの光パルスによって通常1.5〜1.8 nAの反応が生成されます。筋肉に850 mOsmの高浸透圧生理食塩水を1秒間圧力注入すると、即時放出可能プール（RRP）の小胞を示すミニチュアシナプス電流の非同期的な連続放出が生成されます。

ここまで、海辺の elegantly な性質を持つ生物（sea elegance）の神経筋接合部を露出し、電気生理学的記録を行うために我々が使用している解剖技術について説明しました。この技術の習得は困難であり、完璧にこなせるようになるまでには数ヶ月かかる可能性があることを覚えておいてください。しかし、一度習得してしまえば、自転車に乗れるようになるのと同じように、自然にできるようになります。

これらの技術を習得すれば、繰り返し行うことで、調製作業はより迅速かつ確実なものになります。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。