抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

Teerアッセイの本当にユニークな点は、抗原特異的T細胞を直接観察できることです。te、つまりteerは私たちのアッセイで最も重要な特徴です。それに加えて、私たちが行う増幅ステップも行います。

ご存知の通り、T細胞を分離して、興味のあるT細胞のサンプルを濃縮する環境で培養します。そして、そうした細胞だけを標識し、フローサイトメーターで可視化することができます。これまでの検査、例えばCSFEや増殖検査のようなものは、何十年も前から存在しているものでは、T細胞集団全体で起きていることの全体的な一括測定が得られるだけです。

しかし体内には何百万ものT細胞があり、多様なパターンを見ています。運が良ければ、サンプル中の細胞の2から30万に1つが、あなたが見ている細胞になるかもしれません。だからこそ、このアッセイは濃縮段階を行います。

そしてテスト数値を使えば、直接染色しているので、背景から離れて細胞数の1%未満の集団を視覚化できます。ですから、非常に小さな違いが見え、その血液サンプルに含まれるT細胞の数をかなり正確に数えることができます。つまり、その個体に存在するT細胞があなたの関心のパターンを認識しているのです。しかしそれだけにとどまりません。テテルはT細胞を標識するだけでなく、さらなる分析のために分離することも可能にします。

そして、あなたが使っているテテルは実はBRIで作られているのですよね?はい。私たちは国内でクラス2のテッターに成功したごく少数の研究所の一つです。私たちの意図は、これらの試薬を輸入に関心のある研究所にコストをかけて配布することです。

このアッセイを他のラボで再現する際、最も難しい、または挑戦的な点は何だと思いますか?考えてみると、実際には二つあります。T細胞の成長です。これは本当に一種の芸術のようなものです。

細胞が追加の栄養素を必要としているのか、成長のためのスペースが必要かどうか、ほぼ毎日のように判断を迫られます。そして、経験の浅いオペレーターにとっておそらく最も難しいと思う第二の部分は、実はデータ分析です。信号のどの部分が本当にポジティブな反応で、どれが物理学や引力に固有のものなのかを見極めるのです。

そして、すべてにある程度の粘着性があるという事実は、特に全体的な反応がやや弱い文脈では、多くの経験が必要です。このアッセイで得られる情報は、現時点で患者にどのような利益をもたらす可能性があるのでしょうか?自己免疫疾患の患者に最初に現れる特徴の一つは、その病気に特異的な抗体の星座のようなものです。

免疫学の基本的な原理から、抗体応答がある場所では必ず最初にT細胞反応が起こるということがわかっています。ですから、リスクのある個人で、抗体形成に先立つT細胞活性の跳ね上がりを観察できれば、新たなリスクレベル、つまり自己抗体を持つ人たちが進んでいることを定義し、介入的治療の窓が開けることを期待しています。この手順では、抗原特異的CDの陽性T細胞4細胞を精製・増殖し、テテル試薬とクラス2の層流バイオセーフティキャビネットを用いて可視化します。

ここが手術の主な作業スペースとなります。50ミリリットル円錐管 PBMCアイソレーション用の一次管 XPBS1。これはカルシウムとマグネシウムを含まないフォルパックに加え、軽くてドラム状ピペットから守るためにホイルで包んだものが望ましいです。CoStar 10ミルピペットエアロゾルキャニスター、50ミルのインサートを使って遠心分離機の血液汚染を防ぐことができます。

GS6R遠心分離機トランスファーピペット、パスツールピペット溶血緩衝剤(8.3グラム/リットルを含む)。塩化アンモニウム 1.0グラム/リットル。重炭酸ナトリウム 0.04グラム/リットル、DI、ナトリウムEDTA、トリアンブルー0.2%溶液、PBSヘモセル、細胞計15ミリリットル円錐形チューブ、バッファー、PBS含有、補足2ミリモラEDTAと5グラム/リットル。

BSA max CD 4 アイソレーションキット2はMilinバイオテックから購入したEPマグネットブロック、Stem Cell Technologiesから購入。他の磁気セル濃縮プラットフォームも同等の効果で使用可能です。5ミリリットルのポリプロピレン管RPMI 1640に25ミリモラのヒッピーを補足し、T細胞培地の補完用に使われるヒト血清、T細胞培地補給用のペンストリップ、500ミリリットルの0.22ミクロンのボトルトップフィルター、無菌48ウェルプレート(in vitro expansion culture用)、ステップ37度CO2インキュベーター、対象エピトープを含む合成ペプチド溶液20ミリグラム/ミリリットル。

抗原特異的T細胞の可視化に用いられた5ミリリットルのポリスチレンファックスチューブペプチドロードクラス2、抗CD 3、抗CD 4、抗CD25抗体は抗原特異的T細胞の被覆に使用されます。手順開始前にファックスの口径フローサイトメーターまたは同等のものを用意してください。作業スペース内のすべての資材や機器を組み立てましょう。

以下のデモンストレーションでは、以下のステップについて説明します。PBMC分離、CD 4の正のT細胞分離、in vitro増殖培養、teemまたは染色によるT細胞の可視化。ステップ1:PBMCの隔離。

血液サンプルを採取してください。血液はシリンジまたは血液チューブで採取し、凝固を防ぐためにヘパリンを1対50の比率で抗凝固処理し、約1ミリリットルあたり100万PBMCの収量が期待されます。そのうち約40%はCD陽性のT細胞です。

血液を50ミリリットルの円錐形チューブに分けてください。1本のチューブに25ミリリットルの血液を投与。ALI凝固前に血液を優しく混ぜて血漿を分散させます。

PBSを加えて総体積を40ミリリットルにし、下に11ミリリットルのフィアルを乾燥させて血液チューブに挿入し、ピペット補助剤を慎重にピペットから取り出します。フィアルはゆっくりとチューブの底に流れ込みます。レベルが均等になったら、ピペットをゆっくりとチューブから外し、キャップをしてキャニスターのエアロゾルに移します。

キャニスターをしっかり閉じ、遠心分離機を900倍Gで20分間休憩なしで過ごします。このスピンの終わりに破壊を加えないことが非常に重要です。破壊力がスピン後に細胞層を乱すためです。PBMCは、上の黄色いプラズマと下の透明なフィアルの間に明確な白い層を形成します。

移送ピペットで白血球層を優しくすくい取り、新しいチューブに移します。一部の血漿やフィアルはPBMCで抽出できますが、赤血球層は避けてください。通常、この段階で2本の血液チューブを1つの細胞チューブにまとめることができます。

ペレットサイズを増やすには、PBSを加えて総容量を15ミリリットルにし、500倍Gで低ブレイクで15分間遠心分離し、キャニスターのエアロゾルでペーストピペットを使って液体を吸引します。ただしペレットを乱さないように注意してください。溶血緩衝液で処理し、各チューブに5〜6ミリリットルを加え、優しく混ぜて塊を取り除きます。5分以内に潜伏させてください。

PBSを加えて総体積を50ミリリットルにし、230倍Gで10分間遠心分離します。ローブレイクでは、これらの遅いスピンにはエアロゾルキャニスターは不要になります。最終洗浄の前に、PBSを詰めた牧草地ピペットチューブと遠心分離機で2回吸引液を10分間洗浄し、再懸濁細胞を1分取り出し、トリアンブルーで希釈し、ヘモサイトメーターでカウントします。

この細胞数がT細胞分離に使用される試薬体積を決定します。ステップ2、CD4の正T細胞分離、液体吸引、ランニングバッファを追加して、総体積を1,000万細胞あたり40マイクロリットルにまで上げます。通常、これには30マイクロリットルのバッファーと残留ペレット容量が必要です。

この体積を15ミリリットルの円錐形管に移します。CDの4個分離キットから抗体カクテルを追加し、10マイクロリットル/1000万細胞のキャップチューブを10分間氷床に置きます。氷からチューブを取り出し、キャップを外し、1000万細胞あたり30マイクロリットルのランニングバッファーを追加します。

CD4のアイソレーションキットから磁気ビーズを追加してください。1000万細胞あたり20マイクロリットルのキャップチューブを装着し、15分間氷に置きます。ランニングバッファー10巻を加え、230倍Gで10分間遠心分離機で洗浄します。

スピン中は、作業スペースに磁石と5ミリリットルのポリプロピレン管を設置してください。細胞ペレットから液体を吸引します。ランニングバッファーを2ミリリットル加え、転送ピペットで塊を除去します。

同じ移送ピペットを用いて5ミリリットルのチューブに移し、磁石内で15分間培養します。磁石を反転させて最後の一滴を除いて、CD4の正のTセル分画を慎重に15ミル管に移します。5ミリリットルのチューブにさらに2ミリリットルのランニングバッファーを加え、磁石から外します。

CDの4つのネガティブセルをチューブの側面から優しくすすいで取り、マークされた15ミルチューブに移します。各チューブに2ミリリットルのT細胞培地を加えます。細胞数数のためにアリコートを取り出し、230倍Gで10分間遠心分離します。

トリアンブルーで希釈した細胞アリコートとヘモサイトメーターを使ったカウント。これらの細胞数が拡大培養に使用される井戸数を決定します。ステップ3。

in vitro培養では、細胞数に基づいてCD4の陽性細胞ペレットとCD4の陰性細胞ペレットから液体を吸引します。CDに培地を4つの正セルに加え、体積を1ミリあたり300万セルに調整します。CDに4つのネガティブセルを加え、体積を1000万セル/ミリに調整します。

拡大培養には1ウェルあたり300万個のCDと4つの陰性細胞、200万から300万個のCDと4つの陽性細胞が必要です。通常、CD4陽性細胞が制限集団です。48ウェルプレート上の適切な数のウェルに4つのネガティブセルを分割します。

それぞれに300マイクロリットルを加え、37度のインキュベーターで1時間置きます。プレートとインキュベーターを取り外し、ウェルを洗浄します。500マイクロリットルの新しい培地を加え、トランスファーピペットで12〜20回優しく上下にピペットし、液体をすべて取り除きます。この洗浄液は、付着した抗原提示細胞の層を残します。

洗いが終わったら、それぞれの底を湿らせる程度の媒体、つまりおよそ100マイクロリットルを加えます。そうしないと、A付随細胞は乾燥してしまいます。必要に応じて、各井戸に200万から300万個のCDと4つの陽性細胞を追加してください。

さらに培地を加えて、各井戸の総体積を1ミリリットルまで増やします。それぞれに希望のペプチドを加えます。まぁ。刺激の典型的な濃度は10マイクログラム/ミリリットルです。

最終配置板は37度のインキュベーターで7日間保管されます。7日後に。各ウェルにそれぞれ2回ずつ50マイクロリットルのヘモリットILを加えます。

まだ合流していない細胞の培養を顕微鏡フィードウェルでモニタリングし、培地の半分を取り除き、新鮮培地とILを50マイクロリットル追加し、2つの分割された合流ウェルに細胞を懸浮させて細胞の半分を空のウェルに移動させます。新鮮培地とIL50マイクロリットルを加え、2つの細胞をインキュベーターに戻します。拡大する細胞は13〜15日の培養後にティア染色の準備が整います。

ステップ4:T細胞をティア染色で視覚化し、ペプチドに合わせてテッターを購入または組み立てます。CDに4つの陽性T細胞を刺激するために用いられたMHCの組み合わせ。インキュベーターからプレートを取り出してください。

それぞれのメディアの半分を慎重に取り出しましょう。各ウェルから通常75マイクロリットル、約50,000個の細胞を5ミリリットルのポリスチレンファックスチューブに移し、通常は50マイクロリットルの総体積に1マイクロリットルを加え、37度のインキュベーターに1時間置きます。また、各ウェルの2つ目のアリコートを、不一致のTeerで陰性対照標識細胞として、抗CD 3、抗CD 4、抗CD 25抗体を用いることが推奨されます。

追加または代替の抗体マーカーを使用することもあります。ただし、このチャネルはこの時点でteems専用にするため、PE標識抗体は使用しないでください。また、単色やアイソタイプのコントロールには追加のセルを使ってラベル付けしてください。

抗体標識細胞を4度で15〜30分間インキュベートします。各チューブを0.5〜1ミリリットルのバッファーで洗浄し、遠心分離機で230倍Gで10分間洗浄します。ファックス管から液体を慎重にデカントし、リファレンスビーズ、単色制御管、アイソタイプ制御管などを用いてフローサイトメーターを校正します。

フローサイトメーターを使って各チューブを分析します。テトラ陽性細胞は拡張されたCDの4個陽性T細胞の中で明確な集団であるべきです。テトラ陽性細胞は通常CD25陽性で、しばしばCD4高Iです。