Name: 抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: 学ぶMHCクラスIIテトラマーを用いた抗原特異的CD4+T細胞の可視化法。末梢血からの細胞分離とin vitro増培により、フローサイトメトリーで正確な免疫応答解析が可能となる。

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私たちは、撮影とビデオ制作におけるそれらの重要な役割のためにディックフォーリーやリーキンボールに感謝。

1。末梢血単核細胞（PBMC）分離<ol><li>血液サンプルを入手する - 血液は凝固を防ぐために注射器や血液の管と（1:50比）ヘパリンによる抗凝固に収集する必要があります。約1 ×血液1mL当たり10 6 PBMCの利回りを期待する- CD4陽性（CD4 +）T細胞となる約40％、そのうち。 </li><li> 50 mLコニカルチューブ、チューブあたり25 mLに分注し血を。血液が分離されている場合は、軽くプラズマを配布するために小分けする前に混ぜる</li><li>血管に挿入し、フィコール11 mLを策定し、慎重にピペットからピペットエイドを削除して40 mLのとアンダーレイの総容積をもたらし、PBSを追加。フィコールは徐々にチューブの底部に排出されます。レベルが均等化された後、徐々に血液チューブからピペットを取り外して廃棄します。 </li><li>血液チューブにフタをし、Aerosolveキャニスターに移動​​します。ブレーキなし - しっかりと900缶と遠心× gで20分間を閉じます。それは、制動力が細胞の層を乱すので、ブレーキがこのスピンの最後に適用されていないことが重要です。 </li><li>スピンした後、末梢血単核球は黄色のプラズマ（上記）と透明フィコール（下）の間に明確な白い層を形成すべきである。静かに転送ピペットと新しいチューブへの転送を使用して白血球の層をオフに脱脂。いくつかの血漿とフィコールは、末梢血で策定が、赤血球層のいずれかを策定回避することができます。通常2つの血液の管はペレットのサイズを増やすには、この段階で一つのセルのチューブにまとめることができます。 </li><li> 15分間500 × gで50 mLのと遠心分離する総量をもたらす、PBSを追加 - aerosolveキャニスターの低いブレーキを。 </li><li>ペレットを乱さないように注意しながら、パスツールピペットを用いて液体を吸引除去する</li><li>各チューブに5〜6 mLを加えると軽く塊を除去するために混合することにより、溶血バッファーで扱う。せいぜい5分間インキュベートします。 </li><li> 10分間、230 × gで50 mLのと遠心分離する総量をもたらす、PBSを追加 - 低いブレーキを。 Aerosolveキャニスターは、これらの低速回転のために不要になります。 </li><li> 2回洗浄：パスツールピペットを用いて吸引液を、10分間230 × gでPBSと遠心機でチューブを埋める。 </li><li>最後の洗浄工程の前に、、再懸濁した細胞のアリコートを削除するトリパンブルーで希釈し、血球計算盤を用いて数える。この細胞数は、T細胞の分離工程で使用される試薬の量が決まります。 </li></ol> 2。 CD4 + T細胞の分離* <ol><li>液体を吸引し、10万個の細胞あたり40 ULに全量を持って実行しているバッファを追加します。通常、これは、バッファに加えて残留ペレットの体積の30 ULを必要とします。 </li><li> 15 mLコニカルチューブにこのボリュームを転送します。 </li><li> CD4分離キットから抗体のカクテルを追加 - 10 10万個の細胞あたりのUL、キャップのチューブ、および10分間氷上に置きます</li><li> 、氷からチューブを外しキャップを外し、10万個の細胞あたりのバッファを実行している30 ULを追加する</li><li> CD4のアイソレーションキットから磁気ビーズを追加 - 20 10万個の細胞あたりのUL、キャップのチューブ、および15分間氷上で場所を</li><li> 10分間、230 × gで洗浄し、遠心してバッファを実行しているの10巻を追加。 </li><li>スピン中は、ワークスペース内の磁石と5mLのポリプロピレンチューブを設置</li><li> 、細胞ペレットから液を吸引除去する2mLの実行中のバッファを追加し、転送ピペットを使用して塊を取り除く</li><li>同じ転送ピペットを使用して、15分間磁石で5 mLのチューブとインキュベートに細胞を移す</li><li>慎重にCD4 +反転磁石によってマーク15mLのチューブに細胞画分をデカントし、すべてが最後の一滴を空に</li><li> 5 mLのチューブにバッファを実行しているの別の2 mlを加え磁石から削除</li><li>優しくチューブの側面と著しい15 mLの試験管に転送をオフにCD4細胞をリンス</li><li>各チューブに2 mLのT細胞の培地を追加し、10分間230 × gで細胞計数および遠心のためのアリコートを削除します。 </li><li>トリパンブルーで細胞のアリコートを希釈し、血球計算盤を用いて数える。これらの細胞数は、拡大培養のステップのために使用される井戸の数が決まります。 </li></ol> 2.11 - *また、MACSカラムとビーズ（Miltenyi Biotec社）、AutoMACS電池セパレータ（Miltenyi Biotec社）、またはRobosep電池セパレータ（幹細胞技術は）ステップ2.2の代わりに指示を製造するにしたがって使用することができます。 3。 in vitroでの拡大培養に<ol><li>細胞数に基づいて、CD4 +およびCD4細胞ペレットから液を吸引し、（通常は300万CD4 + mL当たりの細胞とmLの1千万人ものCD4細胞が培養をセットアップするためにうまく機能する）培地を加える。拡大培養は48穴培養プレートに1mLの培養培地の総体積に1ウェルあたり3〜5000000 CD4細胞と2〜3000000 CD4 +ウェルあたりの細胞が必要です。一般的に、CD4 +細胞は、限定的な集団である</li><li>必要に応じて、CD4細胞を（5000ラッド照射秒）。それぞれに300〜500μLを添加することにより、48ウェルプレート上のウェルに適切な数に分注しCD4細胞。 1時間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 CD4細胞接着は、拡大培養で抗原提示細胞として機能します。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外します。 </li><li>新鮮な培地の500μLのを追加し、軽く12〜20回上下にピペッティングし、転送ピペットを用いて、液体のすべてを削除して井戸を洗浄してください。この洗浄は、付着性抗原提示細胞の層を残すだろう。 </li><li>洗浄が完了すると、各ウェルの底部（約100 UL）を濡らすのに十分なメディアを追加する - 特に接着細胞が完全に乾くだろう</li><li>各ウェルに2〜3000000 CD4 +細胞を追加。必要に応じて、1 mLのようにそれぞれの総ボリュームを起動するために追加のメディアを追加します。 </li><li>各ウェルに所望のペプチドを追加。刺激のための典型的な濃度は10 ug / mlと最後のです。 </li><li> 7日間、37℃インキュベーターで場所のプレート。 </li><li> 7日後、各ウェルにHemogen IL - 2の50のUL（または組換えIL - 2、10 IU / mLのような、相当する）を追加。 </li><li>後続の各日に、顕微鏡を用いて細胞増殖を監視する。新鮮な培地とIL - 2の50 ULを追加し、まだメディアの半分を削除することにより、コンフルエントでない井戸を養う。新鮮な培地とIL - 2の50 ULを追加して、空のウェルに細胞の半分を移動、細胞を再懸濁することによりコンフルエントに井戸を分割する。インキュベーターにセルを返します。 </li><li>拡大する細胞は、培養の13から15日後に四量体のための準備が整います。 </li></ol> 4。テトラマー染色によりT細胞の可視化<ol><li>購入するまたは刺激されたCD4 + T細胞（テトラマー試薬の源のための議論を参照）と一致するペプチド/ MHCの組み合わせと一致するように四量体を組み立てる。四量体は、〜0.5 mg / mLのソリューションでなければなりません。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外します</li><li>慎重に各ウェルから培地の半分をオフに描く</li><li> 5mLのポリスチレンのFACSチューブに - 通常75μLまたは約50,000細胞 - 各ウェルからの細胞のアリコートを転送する</li><li> 37と場所℃のインキュベーターに1-2時間 - 50μL合計体積当たり、通常、1μL - 四量体を追加。また、ネガティブコントロールとしてのミスマッチ四量体を各ウェルからの細胞の第2のアリコートを染色することをお勧めします。 </li><li>各抗体の30から10μLを加えることによって抗CD3、抗CD4、および抗CD25抗体でラベル細胞。追加のまたは別の抗体マーカーを使用することができます。このチャネルが四量体のために予約されている必要がありますしかし、PE標識抗体を使用しないでください。この時点で、また余分な細胞を使用して、単一の色またはアイソタイプコントロールにラベルを付けます。 </li><li>氷上または4℃で15〜30分間抗体標識された細胞をインキュベート℃に</li><li> 10分間、230 × gで0.5〜2 mLを実行しているバッファと遠心機で各チューブを洗浄する。 </li><li> FACSチューブから注意深くデカント液体。その後のFACS解析のための覆われた容器（できれば氷の上）に全てのチューブを保管してください。 </li></ol> 5。フローサイトメーターの収集と解析<ol><li>参照のビーズを使用してフローサイトメーターを較正します。 </li><li>楽器の設定を確認します。 <ol><li>未染色の対照細胞またはアイソタイプコントロールを使用して、実行可能なリンパ球ゲート（FSC対SSC）の位置を調整します。各軸上で最初の十年以下の人口を（ゲインの設定を変更することで）中心で全てのチャネルからの自家蛍光を削除します。 </li><li>単一のカラーコントロールチューブ、それぞれ単一の色の正しい象限内の中央イベント（補正の設定を変更することによって）使う。 </li><li>無関係な四量体で染色したチューブを使用して計測器の設定の微調整を行う。四量体は、多くの場合、抗体のコントロールよりも明るく染色ので、PEのチャネルのための特定の設定で調整が必要な場合があります。無関係な四量体は、CD4 +細胞の&lt;0.5％を染色してください。 </li></ol></li><li>各チューブのデータを取得する<ol><li>各サンプル管と陰性コントロールの管のためのイベントを収集</li><li>的考察のための少なくとも20,000のイベントを取得し保存</li></ol></li><li>データを分析する<ol><li>インポートデータファイルのFACS解析ソフトウェア（例えばCellQuestソフトウェア、WinMDI、またはFlowJo）へ。無関係な四量体を使用してチューブのステンドグラスを使用して、分析を開始します。 </li><li>プロットFSC対SSCとライブリンパ球（図1、左上のパネル）の周りゲートを描きます。 </li><li>プロットのCD4対CD3（ライブリンパ球のみを表示するためにゲート）とCD3 +とCD4 +集団（図1右上のパネル）の周りにゲートを描きます。 </li><li>プロットのCD4対テトラマー（のみCD3 +リンパ球を表示するためにゲート）とは、象限の境界を設定するようにCD4 +テトラマー+人口が0.5％未満（図1の左下のパネル）である。 </li><li>プロットCD25対テトラマーおよびCD25 +テトラマー+人口が0.5％未満（図1右下のパネル）になるように象限の境界を設定する（CD4 +リンパ球のみを表示するためにゲート）。 </li><li>ゲートを変更することなく、サンプルチューブのすべてを分析する。 </li></ol></li></ol>1167/JOVE％の20FIGUREの％201.png"ALT ="図1"幅="600"高さ="342"/&gt; 図1代表的な負の制御テトラマー染色の結果。左上のパネルは、前方散乱の詩の側方散乱およびリンパ球サイズのゲート（R1）を示します。右上のパネルには、R1のゲートであり、ANT - CD4対抗CD3およびCD3 +（R2）とCD4 +（R3）のゲートを示しています。左下のパネルには、R2のゲートであり、四量体に対する抗CD4を示しています。右下のパネルには、R3のゲートであり、抗CD25対四量体を示しています。両方の四量体のプロットのための象限は、0.5％に設定されていました。 6。代表的な結果<ol><li>テトラマー陽性細胞は、拡張されたCD4 +細胞（図2）の間で別個の人口である必要があります。 </li><li>テトラマー陽性細胞は、通常、CD25 +と頻繁にCD4高い。 </li><li>いくつかのケースでは、MHC /ペプチドの組み合わせは、バックグラウンド染色を（多くの場合、溶解性が悪いとペプチドによって引き起こされる）与えることができます。 "偽陽性"細胞はテトラマー対CD4またはCD25対テトラマープロット（図3）のいずれかの単一の明確な集団ではないので、そのようなバックグラウンド染色は真陽性から区別することができます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362"> 図2。代表正テトラマー染色の結果。パネルのレイアウトとゲーティング戦略は、図1と同一です。テトラマー陽性細胞は抗CD25対四量体のパネル上で四量体のパネルと異なるCD25 +集団に対する抗CD4で異なるCD4高い人口として表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="図3" width="600" height="336"> 図3。代表"偽陽性"テトラマー染色の結果。パネルのレイアウトとゲーティング戦略は、図1と同一です。四量体のパネルに対する抗CD4は、不明瞭な"古墳"染色を示す。抗CD25対四量体はまた、CD25 +であることに向かって明確な傾向がある"古墳"染色を示しています。

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

免疫にCD4の役割+ T細胞を理解することは基本的に重要である。しかしながら、抗原特異的CD4 + T細胞が検出し、従来の方法を使用して分離することが困難な場合があります。対照的に、MHCクラスIIテトラマーは、所望の抗原特異性とCD4 + T細胞の直接可視化を可能にする。このビデオでは、分離、精製、およびCD4 + T細胞および四量体を使用して、その後の可視化のin vitro増幅を示しています。クラスIIテトラマーは、蛍光標識ストレプトアビジンのコア（図4）周りの共役可溶性ビオチン化クラスIIα/β二量体から成る複合体蛍光タンパク質です。このビデオで使用される四量体は、昆虫細胞培養（1）を使用してベナロヤホール研究所Teramerコア研究所によって製造された。これらの四量体を0.5 mg / mLの溶液として調製されており、6月18日月間4℃で保存することができる。四量体は、凍結融解、ストレスが取り除かれsteptavidinのコアからのPEのラベルを取り除くことができるように、凍結しないでください。クラスIIの染色試薬は、いくつかのソースから取得することができます（表1）および四、"ultimers"、およびマルチマーとして指定さ...

<table><tbody><tr><td>クラス2層流バイオセーフティキャビネット</td><td>装置・器具</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>装置・器具</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>1X PBS（Ca/Mg不含）</td><td>試薬</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>遮光のためアルミホイルで包む</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>装置・器具</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>10 mLピペット</td><td>装置・器具</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>エアロソルブキャニスター</td><td>装置・備品</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>50 mL インサート付き</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>装置・機器</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>トランスファーピペット </td><td>装置・器具</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>パストゥールピペット</td><td>装置・器具</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>溶血緩衝液</td><td>試薬</td><td>入力がありません。翻訳するテキストを提供してください。</td><td>翻訳するソーステキストをご提示ください。</td><td>8.3 g/L NH4Cl、1.0 g/L NaHCO3、0.04 g/L EDTA二ナトリウム</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>PBS中0.2%</td></tr><tr><td>血球計数器</td><td>装置・器具</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>装置・備品</td><td>VWR International</td><td>05-527-90</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>ランニングバッファー</td><td>試薬</td><td>該当なし</td><td>該当なし</td><td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td></tr><tr><td>MACS CD4+ T細胞分離キットII</td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>EasySep&amp;#174; 磁石</td><td>装置・器具</td><td>幹細胞技術</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリプロピレンチューブ</td><td>装置・備品</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>25 mM HEPESを含む</td></tr><tr><td>プールヒト血清</td><td>試薬</td><td>提供されたソーステキストがありません。翻訳するテキストをご提示ください。</td><td>入力がありません。翻訳するテキストをご提供ください。</td><td>健康なドナーから採取し、熱不活化およびろ過処理を行った</td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>500mL 0.22ミクロンボトルトップフィルター</td><td>装置・器具</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>装置・器具</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; インキュベーター</td><td>装置・器具</td><td>三洋</td><td>MCO-18AIC</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>20 mg/mL 合成ペプチド</td><td>試薬</td><td>翻訳するテキストが提供されていません。翻訳が必要なソーステキストをご提示ください。</td><td>提供されたソーステキストがありません。翻訳対象のテキストを入力してください。</td><td>任意のペプチドベンダーによるカスタム合成</td></tr><tr><td>5 mL FACSチューブ</td><td>装置・器具</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>（記載された）ペプチド負荷クラスIIテトラマー</td><td>試薬</td><td>入力データがありません。翻訳するテキストをご提示ください。</td><td>翻訳対象のテキストが提供されておりません。翻訳する英文テキストをご提示ください。</td><td>BRIテトラマーコアによって調製</td></tr><tr><td>抗CD3抗体</td><td>試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>抗CD4抗体</td><td>試薬</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>抗CD25</td><td>試薬</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>または同等のもの</td></tr><tr><td>FACS Calibur フローサイトメーター</td><td>装置・器具</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>または同等のもの</td></tr></tbody></table>

抗原特異的cd4 + t細胞はmhcクラスiiテトラマーを用いての可視化

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIIテトラマーは、抗原特異的CD4 +フローサイトメトリーによるT細胞の直接可視化を可能にする。このメソッドは、ペプチドロードされたMHCと対応するT細胞受容体との間の非常に特異的な相互作用に依存しています。単一MHC /ペプチド分子の親和性は低いですが、ストレプトアビジンとMHC /ペプチド複合体を架橋する染色試薬としての利用を可能にする、相互作用の結合力を増加させる。ためにCD4 + T細胞（単特異性30万で〜1）の比較的低い周波数からこのアッセイでは検出のしきい値を高めるためにin vitroでの増幅工程に使用しています。単核細胞をFicollの下敷きにより末梢血から精製されています。 CD4 +細胞は、その後、ビオチン化抗体カクテルとAnti - Biotin標識した磁気ビーズを用いてネガティブセレクションによって分離される。抗原提示細胞、CD4 + T細胞は抗原ペプチドとIL - 2を追加することで、メディアで展開されるようにCD4細胞分画から接着細胞を使用する。拡張された細胞は、抗CD4、抗CD3および抗CD25などの表面の抗体を用いて一時間、その後、ステンドグラス、37℃でインキュベートすることにより、対応するクラスIIテトラマーで染色されています。標識後、細胞を直接フローサイトメトリーによって分析することができます。テトラマー陽性細胞は、通常、拡張されたCD4 +細胞の間で明確な集団を形成する。テトラマー陽性細胞は、通常、CD25 +と頻繁にCD4高い。バックグラウンドのテトラマー染色のレベルが異なる場合があるため、陽性染色の結果は常に無関係の四量体と同じ細胞の染色と比較する必要があります。この基本的なアッセイの複数のバリエーションが可能です。テトラマー陽性細胞は、さらに表現型解析、ELISPOTまたは増殖アッセイに含める、または他の二次アッセイのためにソートすることができる。いくつかのグループはまた、四量体と抗サイトカインや抗Foxp3の抗体のいずれかを使用して共同で染色を実証している。

この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin vitroでの展開の例を示します。四量体は、単一の抗原特異性と定義されているMHCクラスII制限とT細胞の直接可視化を可能にする。

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

主要組織適合性複合体（MHC）クラスIIテトラマーを用いることで、フローサイトメトリーにより抗原特異的なCD4+ T細胞を直接可視化することが可能になります。この手法は…

TEERアッセイの真にユニークな点は、抗原特異的T細胞を直接視覚化できることです。TEERこそが、本アッセイの最大の特徴であり、それに加えて増幅ステップを組み合わせています。まずT細胞を分離し、目的のT細胞が濃縮される環境で培養します。これにより、特定の細胞のみを特異的に標識し、フローサイトメーターで可視化することが可能になります。CFSEなどの、数十年前から行われている増殖アッセイのような従来の解析では、T細胞集団全体の状況について、大まかなバルク測定の結果しか得られませんでした。しかし、体内には数百万個のT細胞が存在し、それらは非常に多様なパターンのセットを認識しています。運が良ければ、サンプル中の20万から30万個に1個程度の細胞が、目的の細胞である可能性があります。だからこそ、このアッセイでは濃縮ステップを行う必要があるのです。そして、テスト回数を重ね、直接染色を行うことで、全細胞数の1%未満という極めて低い集団であっても、バックグラウンドから切り離して視覚化することが可能です。そのため、非常にわずかな差を検出でき、その血液サンプル中、すなわち個体内に存在する、目的のパターンを認識するT細胞の数をかなり正確にカウントすることができます。さらに、テトラマーはこれらのT細胞をラベル付けするだけでなく、さらなる解析のためにそれらを単離することも可能にします。そして、使用されているテターは実際にこちらのBRIで製造されたものということでしょうか？はい。私たちは、クラス2テターの製造に成功した国内でもごく少数の研究室の一つです。私たちの意向としては、この技術の導入に関心を持つあらゆる研究室に、これらの試薬を原価で提供することです。このアッセイを他の研究室で再現する際に、最も困難または不可欠なポイントは何だと思われますか？そうですね、考えてみると主に2つの点があります。その一つがT細胞の培養です。これはある種の熟練した技術が必要な作業と言えます。細胞にさらなる栄養が必要か、あるいは増殖させるための追加のスペースが必要かについて、ほぼ毎日判断を下す必要があります。そして、不慣れなオペレーターにとっておそらく最も困難だと思われるのが、実際のデータ解析です。信号のどの部分が真にポジティブな応答であり、どの部分が単に物理的な現象や誘引によるものなのかを見極める必要があります。また、あらゆるものにある程度の吸着性があるという事実は、特に全体の反応が弱くなる状況において、習熟を要する点です。このアッセイで得られる情報が、現時点でどのように患者に利益をもたらす可能性があるのでしょうか。自己免疫疾患の患者にまず現れる特徴の一つに、その疾患に特異的な抗体群の集まりがあります。免疫学の基礎から、抗体反応があるところには、常にその前にT細胞反応が存在することが分かっています。したがって、リスクのある個人のなかで、抗体形成に先行して起こるT細胞活性の上昇を確認できれば、自己抗体を保有することになる個人の新たなリスクレベルを定義する助けとなり、それが介入療法の機会を開くことにつながると期待されます。本手順では、抗原特異的なCD4陽性T細胞を精製および増幅し、teters試薬およびクラス2層流バイオセーフティキャビネットを用いてそれらを可視化します。ここを手順の主要なワークスペースとします。PBMC分離用の主要チューブとして、50 milliliter コニカルチューブ、およびXPBSを準備します。XPBSはカルシウムおよびマグネシウムフリーである必要があります。遮光のため、フォイルパックをアルミホイルで巻いておきます。ピペットエイド、および遠心機内での血液汚染を防ぐための50 mil インサート付き CoStar 10 mil ピペットエアロゾルキャニスターを用意します。GS 6 R遠心機、転送ピペット、パスツールピペット、溶血緩衝液（8.3 g/L 塩化アンモニウム、1.0 g/L 重炭酸ナトリウム、0.04 g/L DI sodium EDTAを含む）、PBS中0.2%トリパンブルー溶液、hemo CYTOMETER、15 mLコニカルチューブ、ランニングバッファー（2 mM EDTAおよび5 g/Lを添加したPBS）BSA max CD four isolation kit twoはMilin biotechから購入し、EP magnet blockはstem cell technologiesから購入した。他の磁気細胞濃縮プラットフォームであっても、同等の有効性で利用可能である。5 mLポリプロピレンチューブ、25 mM HEPESを添加したRPMI 1640（T細胞培地調製に使用）、T細胞培地の添加剤として使用するプール済みヒト血清、T細胞培地の添加剤として使用するpen strip、500 mL 0.22 µm ボトルトップフィルター、in vitro増殖培養に使用する滅菌済み48ウェルプレート、37 °C CO2インキュベーター、目的のエピトープを含む20 mg/mLの合成ペプチド溶液。抗原特異的T細胞を可視化するために、ペプチドをロードした5 mLポリスチレン製FAXチューブおよびクラス2のTEERを使用しました。抗原特異的T細胞のコーティングには、anti-CD3、anti-CD4、およびanti-CD25抗体を使用しました。手順を開始する前に、FAX Caliberフローサイトメーターまたは同等品を用意してください。すべての材料と装置を作業スペースに揃えます。以下のデモンストレーションでは、次の手順について解説します。PBMCの単離、CD4陽性T細胞の分離、in vitroでの増殖培養、およびTEMまたは染色によるT細胞の可視化です。ステップ1：PBMCの単離。血液サンプルを入手します。血液はシリンジまたは採血管で採取し、凝固を防ぐためにヘパリンを1:50の比率で添加して抗凝固処理を行います。血液1 mLあたり約100万個のPBMCが得られる見込みであり、その約40%がCD4陽性T細胞となります。血液を50 mLコニカルチューブに分注します。1本あたり25 mLずつ分注してください。血漿を均一にするため、ALI凝固の前に血液を穏やかに混合します。PBSを加えて全量を40 mLにし、血液チューブに挿入したバイアルの中の11 mLを乾燥させてアンダーレイ（下層形成）を行い、ピペットからピペットエイドを慎重に取り除きます。バイアルの中身はゆっくりとチューブの底へ流れ落ちます。液位が等しくなった後、血液チューブからゆっくりとピペットを抜き、血液チューブにキャップをして破棄し、エアゾルキャニスターへ移動させます。キャニスターをしっかりと密閉し、ブレーキなしで 900 ×g で 20 分間遠心分離します。遠心終了時にブレーキをかけないことが極めて重要です。ブレーキによる衝撃で、遠心後の細胞層が乱れるためです。pbmc は、上層の黄色い血漿と下層の透明なフィコール層の間に、はっきりとした白色の層として形成されます。トランスファーピペットを用いて、白血球層を慎重に吸い出し、新しいチューブに移します。PBMCとともに少量の血漿やフィブリンが吸引されることがありますが、赤血球層を吸い込まないようにしてください。通常、この段階で2本の血液チューブ分を1本の細胞チューブにまとめることができます。ペレットのサイズを大きくするため、PBSを加えて全量を15 millilitersにし、低速ブレーキ設定で500 times Gにて15分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、ペーストピペットを用いて液を吸引します。各チューブに5から6 millilitersの溶血バッファーを加え、緩やかに混合して凝集塊を除去し、処理を行います。5分を超えない範囲でインキュベートします。PBSを加えて全量を50 mLにし、230 ×gで10分間遠心分離します。このような低速回転では、低速ブレーキ設定のためエアロゾル防止用キャニスターは不要です。2回洗浄を行い、パスチャーピペットを用いて液を吸引した後、PBSを満たしたチューブに回収し、最終洗浄ステップの前に230 ×gで10分間遠心分離します。再懸濁した細胞の一部を分注して取り出し、トリパンブルーで希釈して血球計数器で計測します。この細胞数に基づいて、T細胞分離に使用する試薬量を決定します。ステップ2のCD4陽性T細胞分離では、液を吸引し、1,000万細胞あたり合計40 µLになるようにランニングバッファーを加えます。通常、これにはバッファー30 µLと残存するペレット量が必要になります。この液量を15 mLのコニカルチューブに移します。CD4分離キットの抗体カクテルを、細胞10 million個あたり10 µL添加し、チューブに蓋をして氷上で10分間静置します。チューブを氷上から取り出し、蓋を開けて、細胞10 million個あたり30 µLのランニングバッファーを添加します。CD4分離キットの磁気ビーズを添加します。細胞1,000万個あたり20 µLをチューブに加え、氷上で15分間静置します。洗浄のために10倍量のランニングバッファーを加え、230 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離中に、ワークスペースにマグネットと5 mLポリプロピレンチューブを準備します。細胞ペレットから液を吸引します。2 mLのランニングバッファーを加え、転送ピペットを用いて凝集物を除去します。同じ転送ピペットを使用して細胞を5 mLチューブに移し、マグネット内で15分間インキュベートする。マグネットを反転させ、最後の一滴を除いてすべて空にするようにして、CD4陽性T細胞画分を標識した15 mLチューブに注意深くデカントする。5 mLチューブにさらに2 mLのランニングバッファーを加え、マグネットから取り出す。チューブの壁面に付着しているCD4陰性細胞を優しく洗い流し、ラベルを貼った15 mLチューブに移します。各チューブにT細胞培地を2 mL加えます。細胞計数用の分注液を採取し、230 ×gで10分間遠心分離します。細胞のアリコートをトリパンブルーで希釈し、ヘモサイトメーターを用いて計測します。この細胞数に基づき、拡大培養に使用するウェル数を決定します。ステップ3へ進みます。in vitro 拡大培養において、細胞数に基づき、CD4陽性およびCD4陰性の細胞ペレットから吸引液を除去します。CD4陽性細胞には培地を加え、細胞密度を3 million cells/mLに調整します。CD4陰性細胞には培地を加え、細胞密度を10 million cells/mLに調整します。拡大培養には、1ウェルあたり300万個のCD4陰性細胞と200万〜300万個のCD4陽性細胞が必要です。通常、CD4陽性細胞が制限集団となります。CD4陰性細胞を48ウェルプレートの適切な数のウェルに分注します。各ウェルに300 µLずつ添加し、プレートを37 °Cのインキュベーターで1時間静置します。プレートをインキュベーターから取り出し、500 µLの新鮮な培地を加えて、トランスファーピペットで12～20回緩やかにピペッティングし、液をすべて除去してウェルを洗浄します。この洗浄により、接着性の抗原提示細胞の層が残ります。洗浄が完了したら、各ウェルの底を濡らすのに十分な量の培地（約100 µL）を加えます。そうしないと、接着細胞が乾燥してしまいます。必要に応じて、各ウェルに200万〜300万個のCD4陽性細胞を加えてください。各ウェルの総容量が1 mLになるように、追加の培地を加えます。各ウェルに目的のペプチドを添加します。刺激に用いる標準的な濃度は10 µg/mLです。最後に、プレートを37°Cのインキュベーターに7日間置いてください。7日後から、以降の日々、各ウェルに50 µLのhemo IL twoを添加します。顕微鏡を用いて細胞の増殖をモニタリングします。まだコンフルエントになっていないウェルについては、培地の半分を除去し、新鮮な培地と50 µLのIL-2を添加します。コンフルエントになったウェルは、細胞を再懸濁し、細胞の半分を空のウェルに移動させることで分割します。その後、新鮮な培地と50 µLのIL-2を添加し、細胞をインキュベーターに戻します。増殖させた細胞は、培養13〜15日後にTEER染色の準備が整います。ステップ4、テトラマー染色によるT細胞の可視化。CD4陽性T細胞を刺激するために使用したペプチド-MHC複合体に適合するテトラマーを購入または調製します。プレートをインキュベーターから取り出します。各ウェルから培地の半分を慎重に吸引します。通常75 µL（約50,000個の細胞）の細胞分注量を、5 mLのポリスチレン製Falconチューブに各ウェルから移します。通常、総容量50 µLあたり1 µLのテトラマーを加え、37 °Cのインキュベーターで1時間置きます。また、陰性コントロールとして、各ウェルの2つ目の分注量をミスマッチテトラマーで染色することが推奨されます。細胞をanti-CD3、anti-CD4、およびanti-CD25抗体でラベルします。追加または代替の抗体マーカーを使用することも可能です。ただし、このチャンネルは現時点でteems用に予約されているため、PE標識抗体は使用しないでください。また、シングルカラーコントロールまたはアイソタイプコントロールの標識には、別途追加の細胞を用いてください。抗体標識した細胞を4°Cで15〜30分間インキュベートします。各チューブを0.5〜1 mLのランニングバッファーで洗浄し、230 ×gで10分間遠心分離します。 FACSチューブから上清を慎重にデカンテーションし、リファレンスビーズ、シングルカラーコントロールチューブ、アイソタイプコントロールなどを用いてフローサイトメーターのキャリブレーションを行います。フローサイトメーターを用いて各チューブを解析します。テトラマー陽性細胞は、増殖させたCD4陽性T細胞の中で独立した集団として認められるはずです。テトラマー陽性細胞は通常CD25陽性であり、多くの場合CD4 highとなります。

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