Name: ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その1 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学ぶワクシニアウイルス感染法でHeLa細胞を用いた遺伝子発現の時間的解析。マイクロアレイ解析のためのRNA抽出と増幅技術を含むウイルス学の基礎手法を習得できます。

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ホワイトヘッド研究所フェローファンド

パート1：感染症のセットアップ<ol><li>フラスコにHeLa細胞を成長し、細胞が約80％コンフルエントになるまで待ちます。 </li><li> 2％FBSとの定期的なDMEMと添加しない抗生物質：実験のために十分なウイルスの増殖培地を準備します。 </li><li>感染症は、どちら原油既知の力価を持つワクシニアウイルスの株式、またはあなたがホストの遺伝子の発現が心配な場合は、既知の力価でウイルスを精製白糖を行うことができます。 </li><li>あなたがウイルスを精製白糖を使用している場合は、パート2に直接進みます。 </li><li>あなただけの感染前に、原油ワクシニアウイルス株を使用している場合は、主に氷のお風呂と少量の水でカップの超音波処理でウイルスのアリコートを超音波で分解する。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 20秒のために30W前後で超音波処理。 </li><li>ボルテックスチューブと氷とチルドを充填したカップを保つために、必要に応じてより多くの氷を追加し、超音波処理を3回繰り返す。 </li><li>各超音波処理のステップの間に渦。 </li><li>パート2に進んでください。 </li></ul></li><li>また、あなたがカップの超音波処理を有していない場合、原油ウイルスストックと0.25mg/mLのトリプシンの等量を混合する。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li>激しくボルテックスする。 </li><li> 30分間37℃ウォーターバスでのウイルスストック/トリプシンミックスをインキュベートする。 </li><li> 5〜10分間隔で渦。 </li><li>パート2に進んでください。 </li></ul></li></ol>パート2：細胞に感染<ol><li>感染の目的の多重度（MOI）で単層に感染するために必要なウイルス粒子の量を計算します。一般的に、MOI（5〜10）高は、感染のtimecoursesに使用されます。 </li><li> 37ウイルスまたはトリプシン処理原油のウイルスを精製白糖、所望量の° Cのウイルス増殖培地を加え、よく混ぜる。あなただけのフラスコの底部をカバーするのに十分なメディアを使用する必要があります。たとえば、T - 175フラスコのためのメディアを10mL。 </li><li>細胞から培地を取り除き、室温のPBSですすいでください。 </li><li>各フラスコにウイルス/ウイルス増殖のメディアを追加します。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li>優しくスワール、37℃傾斜プレートをインキュベート℃で1時間5％CO2インキュベーターでC。 </li><li>チルトと渦のプレートは15​​分ごとに一様にウイルスを拡散し、細胞の潤いを保つために。 </li><li> 0hr/Mockの時点では、唯一のウイルスの増殖培地を追加し、ないウイルスには、追加された。 </li></ul></li><li> 1時間のインキュベーションの後、ウイル​​スを含むメディアを削除し、そして室温PBSで3回リンス。 </li><li>各フラスコにウイルスの増殖培地の最大量を追加。たとえば、T - 175フラスコのためのメディアの30 mLの。あなたの0時間の時点としてこれをカウントを開始。 </li></ol>パート3：収穫の細胞<ol><li>顕微鏡下で細胞を確認し、すべての細胞変性効果（CPE）を注意してください。 </li><li>メディアを取り出し、室温PBS 30 mLで細胞をリンス。 </li><li>細胞にトリプシンの15 mLを加え、37℃で2 - 5分間インキュベート℃に</li><li>細胞の剥離を顕微鏡で確認し、細胞を取り除くために、静かにフラスコをタップします。 </li><li> 50 mLコニカルチューブに滅菌血清ピペットで細胞を移す。 </li><li>細胞増殖培地の等量でフラスコを洗い、円錐管にトリプシン処理細胞にメディアを追加。 </li><li>室温で5分間、300 × gで細胞を遠心分離します。 </li><li>細胞ペレットからトリプシン/メディアを取り出します。 </li><li>ご希望のRNA単離キットからTRIzol試薬または溶解バッファーのいずれかで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>あなたがTRIZOLを使用している場合は、-80℃で1.5mlのラベルが付いたエッペンドルフチュー​​ブや凍結の1mLのアリコートにサンプルを分割℃に</li><li>タイムポイントごとに1つのフラスコを収穫する、すべての時間ポイントについて繰り返します。 </li></ol>パート4：TRIZOLのサンプルのRNA抽出<ol><li>この時点で、あなたのサンプルを処理できる状態にTRIzol試薬中に再懸濁させ、されるべきである。 </li><li>各チューブのTRIZOLのすべての1 mLのためのBCPの相分離試薬の200μLを追加。あなたがTRIZOL大量の話から始めている場合、より大きなチューブにサンプルを転送する必要がある場合があります。 </li><li>ボルテックスや激しい振とうし、2〜3分間室温でインキュベートする。 </li><li> 15分間12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li>新しいチューブに水相を移す。水相は、上に透明層である。あなたがから始めたTRIZOLのすべての1mLのための約600μL回復されるべきである。 </li><li>代わりに、BCPの第二のフェノール/クロロホルム抽出、1mlのトリゾールあたりのクロロホルム500μLを使用して、この時間を、ください。 </li><li>ボルテックスや激しい振とうし、2〜3分間室温でインキュベートする。 </li><li> 15分間12,000 xgでサンプルを遠心分離します。 </li><li>新しいチューブに水相を移す。水相は、上に透明層である。 </li><li>各サンプルに線形アクリルアミドの20μgを追加。リニアアクリルアミドは、キャリアとして機能し、RNAを沈殿させるために役立ちます。 </li><li> 500＆マイルを追加CRO、TRIZOL 1mlあたりイソプロパノールのLは、それぞれのサンプルにしてスタートし、よく混ぜる。 </li><li>室温で10分間サンプルをインキュベートする。 </li><li> 10〜15分、最高速度で遠心機で遠心する。 </li><li> RNAペレットは、チューブの下部に表示されます。非常に慎重に、どちらかの真空吸引器で、または手動ピペッターで、チューブから上清を取り除く。ペレットを乱さないでください。 </li><li> 70％エタノール1mLでペレットを洗浄します。 <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li>ペレットに70％エタノール1mLを追加。 </li><li>トップスピードで5-7分、14,000 gで遠心します。 </li><li>非常に慎重に、真空吸引器のいずれかで、チューブからエタノールを削除する、または手動ピペッターで。その際、ペレットがチューブの下部に表示されていることを確認してください。 </li><li>上清を捨てる。 </li></ul></li><li>洗浄ステップを繰り返します。上清を廃棄した後に、ペレットがチューブ上のどこにマークします。 </li><li> 5分よりもはや自然乾燥ペレット。乾燥し過ぎたしない、またはRNAを再構成することが難しくなるためです！ </li><li>あなたがサンプルから、残りのDNAを除去するために、オプションのDNase処理をフォローしたい場合は、ヌクレアーゼフリー水17μLでペレットを再懸濁します。そうでない場合は、ヌクレアーゼフリー水20μLでペレットを再懸濁し、22に進みます。 </li><li> （オプションのDNase処理）キアゲンのRNaseフリーのDNaseセットを使用して、2μlのバッファRDDと1μLで再懸濁したRNAにRNaseフリーのDNase Iを再構成に追加します。穏やかに混合する。 </li><li> （オプションのDNase処理）37℃で30分間。 </li><li> （オプションのDNase処理）65で2.5 mMのEDTAとインキュベートの2μlの追加℃で5分間は、DNaseを失活させる。長い時間/より高い温度ではRNAの分解を引き起こすことができるように不活性化の時間や温度を超えないようにしてください。 </li><li>分光光度計によるRNA濃度を確認してください。 </li><li> -80℃でのRNAサンプルを保存する</li><li> （オプションQC）アジレントバイオアナライザを用いてRNAの品質をチェック、または変性ゲルでサンプルを実行し、OD測定値をチェックして。 （260nmのと280分の260比） </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

重要なステップパート1＆2 ウイルス粒子を分解するために、同期ワクシニア感染症、ウイルスの最初のもの慎重に超音波処理を（またはtrypzinizing）、セットアップするには、いくつかの重要なステップがあります。ワクシニアウイルスは、集約の影響を受けやすい国である、とウイルス粒子の破壊は細胞のさらに感染を確保するために重要です。同期感染を達成するために、MOI（2より大きい）高は、各セルが感染していることを確認するために使用する必要があります。感染および非感染細胞の混合物は、感染の複数回、時間の点の異種混合物、および非同期のウイルスと宿主の転写反応につながる。感染は、細胞にウイルスの最大吸着できるように、メディアの最小限の量で実施されるべきである。加えて、フラスコや培養皿（10分ごと）の定期的な揺れは、フラスコでウィルスの配布を可能にし、細胞が乾燥しないことが保証されます。 パート4 1 - ブロモ-3 - クロロプロパン（BCP...

<table><tbody><tr><td>TRIzol試薬</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Roche社のTriPureなどの類似試薬でも代用可能です。</td></tr><tr><td>BCP相分離試薬</td><td>試薬</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーDNaseセット</td><td>試薬</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase処理はオプションの工程です。</td></tr></tbody></table>

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

家族の<em&gt;ポックスウイルス科</em&gt;感染細胞の細胞質中に独占的に複製するウイルスを含む大規模な二重鎖DNAで構成されています。のメンバー<em&gt;オルトポックス</em&gt;属インクルード天然痘、人間の天然痘、サル痘、およびワクシニア（VAC）の原因物質、ウイルスの家族の原型の一員。比較的大きな（〜200 KB）ワクシニアゲノムの中で、遺伝子の3つのクラスは、エンコードされています：初期、中間、および遅い。すべての3つのクラスがウイルスによりコードされたRNAポリメラーゼによって転写されていますが、各クラスには、ウイルスのライフサイクルの異なる機能を果たします。ポックスウイルスは感染時に宿主細胞環境の変調のための複数の戦略を利用する。両方のホストとウイルスの遺伝子発現の調節を理解するために、我々は、ウイルスと宿主細胞の両方から転写産物量を分析するためにゲノムワイドなアプローチを利用してきた。ここで、我々は、いくつかの時点感染後におけるワクシニアウイルスとサンプリングのRNAとHeLa細胞の経時的感染を示す。両方のホストとウイルスの全RNAを単離し、遺伝子発現の解析用マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのために増幅されます。

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。 3のパート1。

ポックスウイルス科（Poxviridae）は、感染細胞の細胞質内のみで複製する、大きな二本鎖DNAを含むウイルスで構成される。...のメンバーは、

ワクシニアウイルスを用いたHeLa細胞のタイムコース感染実験は、ウイルス感染の準備、細胞への感染、そして感染後の複数のタイムポイントにおける感染細胞からのRNA回収という手順で進められます。このRNAを後に増幅し、マイクロアレイにハイブリダイズさせることで、遺伝子発現の解析が可能になります。こんにちは、Whitehead Institute for Biomedical ResearchのKate Irvin研究室のJudy Annです。本日は、哺乳類細胞におけるワクシニアウイルスのタイムコース感染の手順と、感染後さまざまな時点での感染細胞からのRNA抽出について解説します。この手法は、感染中のウイルスの遺伝子発現を評価するためにRNAを抽出および増幅させるという、より広範なプロトコルの導入段階であり、残りの工程は他の2つのJoVEビデオで完結します。それでは、始めていきましょう。感染の準備として、HeLa細胞をフラスコで培養し、細胞が約80%コンフルエントになるまで待ちます。次に、実験に十分な量のウイルス増殖培地を準備してください。2% FBSを含み、抗生物質を添加していない通常のDMEMを使用し、タイター（力価）が既知の回収済みワクシニアウイルス株、またはタイターが既知のショ糖精製ウイルスを用いて感染を行うことができます。ホストの遺伝子発現を懸念し、ショ糖精製ウイルスを使用する場合は、次のセクションへ進んでください。粗精製ワクシニアウイルスを使用する場合は、感染直前にウイルスのストックをソニケーションし、分注してください。氷を主とし少量の水を加えたバスに入れ、約 30 W で 20 秒間ソニケーションします。チューブをボルテックスし、ソニケーションを 3 回繰り返します。その際、容器の中を氷で満たして冷却状態を維持するために、必要に応じて氷を追加してください。また、各ソニケーション工程の間には必ずボルテックスを行ってください。カップソニケーターをお持ちでない場合は、粗精製ウイルスストックと同量の 0.25 mg/mL 溶液を混合してください。トリプシンを加え、ウイルスストックを激しくボルテックスして混合し、37 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。細胞を感染させるまで、5～10分間隔でボルテックスを行います。まず、目的の感染多重度（MOI）で単層細胞を感染させるのに必要なウイルス粒子の量を算出します。または MOI。通常、感染タイムコースには 5 から 10 の間の高い MOI が用いられます。次に、所定量のショ糖精製ウイルスまたはトリプ粗ウイルスを 37 °C のウイルス増殖培地に加え、よく混合します。フラスコの底がちょうど隠れる程度の量の培地を使用してください。T 1 75 フラスコであれば、10 milliliters の培地で十分

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生物学

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。...

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その2

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。パート3は、蛍光色素のアミノアリルカップリングにより、両方のホストとウイルスのサンプルから増幅されたRNAを標識するプロセスを説明します。...

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その3

ウイルス感染に関与する新規の宿主因子は、機能のRNAiスクリーニングの細胞ベースのゲノムワイドな損失を介して識別できます。...

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療薬として期待されています。治療前に患者から得られた生体組織標本の感染力を把握する能力は、この治療的アプローチのユニークな利点です。このプロトコルは、のための組織を処理する方法について説明します。...

腫瘍溶解性ウイルスと生きている組織のex vivoでの感染

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス -...

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

シナプス接続されたニューロンをトレースする方法が記載されている。我々は、目的の細胞集団は遺伝的に定義された種類の細胞からシナプス入力を受け取るかどうかを調べるために上流の細胞のTVAの特異性を利用する。...

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

一過性の支配的選択の方法を使用して蛍光タグ付きタンパク質を同時に発現する組換えワクシニアウイルスの生成のための迅速かつモジュール的なプロトコルがここに記載されている。...

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

我々は、スペクトル的に別個のレポーターフルオロフォアの段階特異的発現を介して、ウイルス感染および遺伝子発現のリアルタイム測定を可能にする蛍光レポーターワクシニアウイルスの使用を記載している。我々の詳細を正確にウイルス複製を阻害する小分子に応答して影響される段階を識別するためのプレートベースの方法。...

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ICP0 は、HSV-1 感染核-細胞質転流を受けます。このイベントの分子メカニズムは知られていません。ここで我々 は将来解明で ICP0 転座を定量的に解析の基盤 HSV-1 感染の ICP0...

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