Name: ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その2 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶワクシニアウイルス感染によるHeLa細胞の遺伝子発現解析法。逆転写とin vitro転写を用いてウイルスRNAを増幅し、マイクロアレイ解析へ応用する詳細なプロトコルを解説します。

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パート1：RNAからcDNA合成<ol><li>アンビオンアミノアリルMessageAmp IIキットを使用する前に、洗浄バッファーに100％エタノールの推奨量を追加します。 </li><li> PCR反応チューブに、100ngの間にT7オリゴ（dT）プライマーのトータルRNAと1μlのの5μgに追加します。ヌクレアーゼフリー水で12μlにボリュームを起動します。 </li><li> 70でサンプルをインキュベート℃でサーマルサイクラーで10分間。 </li><li> ° Cと遠心簡単に70からRNAサンプルを削除します。氷の上に置きます。 </li><li>第1ストランド合成のマスターミックスを調製し、（エラーをピペッティングするための10％超過付き）、室温でおいてください。（表1） </li><li>ミックスして、手短に遠心して静かにピペットでマスターミックスまたはフリックします。 </li><li>各RNAサンプルにマスターミックスの8μlを転送する。 3〜4回上下にピペッティングして混ぜる。 </li><li>サーマルサイクラーで2時間、42℃でインキュベートする。 </li><li>氷上で遠心サンプルの短時間と場所。すぐに二本鎖DNAの合成の次のステップに進みます。 </li><li>氷上で2 回目のストランドの合成マスターミックス（エラーをピペッティングするための10％超過と）。（表2）を準備</li><li>ミックスして、手短に遠心して静かにピペットでマスターミックスまたはフリックします。 </li><li>各サンプルに80μlを移し、軽く3,4回上下にピペッティングして混ぜる。 </li><li>サーマルサイクラーで2時間16℃でインキュベートする。 </li><li> 2時間のインキュベーションの後、cDNAを、クリーンアップ手順を続行または-20℃で直ちに凍結する</li></ol>パート2：二本鎖cDNAをクリーンアップ<ol><li>冷蔵庫からcDNAピュアを取り外して、使用前に30分間室温に平衡化することができます。完全に使用前に磁気のcDNA結合ビーズを再懸濁するためにボトルを振る。 </li><li> 1.5mlチューブ50〜60℃でインキュベートC前の2時間インキュベーション中に少なくとも10分間に分注しヌクレアーゼフリー水。 </li><li>各サンプルのcDNAの純粋の180μlを追加し、徹底的に上下にピペッティングにより混合する。 96ウェル丸底プレートにサンプルを移す。 </li><li>静かに少なくとも2分間オービタルシェーカー上でプレートを振とうしてサンプルをミックスし続ける。 </li><li>磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。約6分間、または混合物が透明になり、結合ビーズをペレット化されるまで、スタンドにプレートを残す。 </li><li>慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。 </li><li>磁気スタンドからプレートを取り外します。 </li><li>各ウェルに150μLcDNAを洗浄バッファーを追加し、適度なスピードでオービタルシェーカー上で1分間プレートを振る。ビーズは、洗浄緩衝液の低い表面張力により、このステップで分散されません。 </li><li>磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。 </li><li>慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。 </li><li>磁気スタンドからプレートを取り外します。 </li><li> 150μLcDNAを洗浄バッファーで洗浄2回目のタイムを繰り返します。 </li><li>第2回洗浄した後、最高速度でオービタルシェーカーで2分間プレートを振とうしてビーズを乾燥させる。乾燥し過ぎたしないでください！ </li><li>各サンプルに予熱のNuclease - Free Water18μlを加えることによりビーズからcDNAを溶出させる。 </li><li>精力的にオービタルシェーカー上で3分間プレートを横に振ると、磁性ビーズが十分に分散されている確認してください。されていない場合は、揺れ続ける。 </li><li>磁気ビーズが完全に分散した後、磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。 </li><li>慎重に（〜16μl）溶出したcDNAは、新たなPCRプレート（またはPCRチューブ）に移す。 </li><li>次の手順に直接進む、または-20℃にてcDNAを凍結する</li></ol>パート3：in vitro転写 （IVT） <ol><li>室温でIVTマスターミックスを調製する。（表3） </li><li>穏やかに混合し、手短に遠心してマスターミックスや映画をピペット。 </li><li>各サンプルに24μl追加し、軽く3,4回上下にピペッティングして混ぜる。 </li><li>サーマルサイクラーで14時間、37℃でインキュベートし、その後次のステップのため° Cまでの準備4で保持する。 </li></ol>パート4：aRNAのクリーンアップIVTの後に<ol><li>簡単に渦RNA結合ビーズを使用前であっても混合物を得ること。 </li><li>室温でaRNAの結合ミックスを準備する（表4）これは、事前に行うことができます- 。プリペアド結合ミックスは、最大1週間まで室温で保存することができます。 </li><li>ボルテックスでよく混ぜる。 </li><li>少なくとも10分間、50〜60℃で1.5mlチューブとインキュベートに分注しaRNAの溶出バッファー。 </li><li> aRNAの結合ミックスの70μlを追加各サンプルにして3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。 </li><li> PCRプレートから96ウェル丸底プレートにサンプルを移す。 </li><li>各サンプルに100％イソプロパノール50μlのを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。 </li><li>やさしく徹底的にサンプルを混ぜるために、少なくとも2分間オービタルシェーカー上でプレートを振る。 </li><li>磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。混合物が透明になり、結合ビーズをペレット化されるまで、スタンドにプレートを残す。 </li><li>慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。 </li><li>磁気スタンドからプレートを取り外します。 </li><li>各ウェルに100μlのaRNAの洗浄液を追加し、適度なスピードでオービタルシェーカー上で1分間プレートを振る。ビーズは、完全にこの段階では分散されないことがあります。 </li><li>磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。 </li><li>慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。 </li><li>磁気スタンドからプレートを取り外します。 </li><li> 100μlのaRNAの洗浄溶液で洗浄2回目のタイムを繰り返します。 </li><li>第2回洗浄した後、最高速度でオービタルシェーカー上で1分間プレートを振とうしてビーズを乾燥させる。サンプルを乾燥し過ぎたしないでください！ </li><li>各サンプルに40μlの予熱aRNAの溶出バッファーを添加することによりビーズからaRNAのを溶出する。 </li><li>精力的に3分間オービタルシェーカー上でプレートを横に振ると、磁性ビーズが十分に分散されている確認してください。されていない場合は、揺れ続ける。 </li><li>磁気ビーズが完全に分散した後、磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。上清は、取り込まれたaRNAのがクリーンアップされたアミノアリルが含まれています。 </li><li>慎重に新たなPCRプレート（またはPCRチューブ）に溶出されたaRNAを転送します。 </li><li> （オプションの手順）は、光度計分光光度計に1.5μlずつを測定することにより、サンプルのRNAの濃度を確認してください。 </li><li>すぐに次のステップに引き続き、または-80 aRNAの℃にて保存してください。 </li></ol>表1：cDNAの第1のストランドの合成マスターミックス<table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 1反応量 </td></tr><tr><td> 10Xファーストストランドバッファー</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> dNTPミックス</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼ阻害剤</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>配列スクリプト</td><td> 1μL </td></tr></tbody></table>表2：cDNAの第2鎖合成のマスターミックス<table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 1反応量 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 63μlの</td></tr><tr><td> 10Xセカンドストランドバッファー</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> dNTPミックス</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> DNAポリメラーゼ</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> RNase H活性</td><td> 1μL </td></tr></tbody></table>表3：IVTマスターミックス<table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 1反応量 </td></tr><tr><td> aaUTP溶液（75mMの） </td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> ATP、CTP、GTPミックス（25 mM）を</td><td> 12μlの</td></tr><tr><td> T7 UTPソリューション（75 mM）を</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td> T7 10X反応バッファー</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> T7酵素ミックス</td><td> 4μlの</td></tr></tbody></table>表4：aRNAのバインディングミックス<table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 1反応量 </td></tr><tr><td> RNA結合ビーズ* </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>ビーズの再懸濁ソリューション* </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 100％イソプロパノール** </td><td> 6μlの</td></tr><tr><td> aRNAの結合バッファー濃縮液</td><td> 50μlの</td></tr></tbody></table> *最初のビーズ懸濁液でRNA結合ビーズをミックス。 **イソプロパノールを追加し、aRNAの結合バッファー濃縮液を添加する前によく混ぜる。

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

重要なステップ配列データにバイアスが観察されているとして、増幅の第二ラウンドはお勧めできません。それぞれの酵素のステップのインキュベーションが適切な温度になるように各酵素段階（第1回および第2鎖cDNA合成、IVT）で慎重に混合することは、良好な増幅収量を得るために重要です。さらに偏差を空気のハイブリダイゼーションオーブンまたは水浴のハイブリダイゼーションにIVTの間に2〜3度と小さいが大幅に増幅産物の収量に影響を与える可能性が - 調整可能なフタ付きのPCRサーマルサイクラーが好ましい。 アプリケーション/意義このプロトコルに起因する標識されたRNAは、培養で感染した細胞に遺伝子発現の応答を評価するために、人間のウイルス、またはカスタムマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。マイクロアレイプラットフォームが異なるため、標識プローブからハイブリダイゼーション混合物の調製のための製造業者の指示に従ってください。 <p c...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA増幅キット</td><td>試薬</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>20反応分</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA増幅キット</td><td>試薬</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>100反応分、96ウェル形式</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS分光光度計</td><td>その他</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>または同等の分光光度計</td></tr></tbody></table>

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

家族の<em&gt;ポックスウイルス科</em&gt;感染細胞の細胞質中に独占的に複製するウイルスを含む大規模な二重鎖DNAで構成されています。のメンバー<em&gt;オルトポックス</em&gt;属インクルード天然痘、人間の天然痘、サル痘、およびワクシニア（VAC）の原因物質、ウイルスの家族の原型の一員。比較的大きな（〜200 KB）ワクシニアゲノムの中で、遺伝子の3つのクラスは、エンコードされています：初期、中間、および遅い。すべての3つのクラスがウイルスによりコードされたRNAポリメラーゼによって転写されていますが、各クラスには、ウイルスのライフサイクルの異なる機能を果たします。ポックスウイルスは感染時に宿主細胞環境の変調のための複数の戦略を利用する。両方のホストとウイルスの遺伝子発現の調節を理解するために、我々は、ウイルスと宿主細胞の両方から転写産物量を分析するためにゲノムワイドなアプローチを利用してきた。ここで、我々は、いくつかの時点感染後におけるワクシニアウイルスとサンプリングのRNAとHeLa細胞の経時的感染を示す。両方のホストとウイルスの全RNAを単離し、遺伝子発現の解析用マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのために増幅されます。

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。 3パート2。

ポックスウイルス科（Poxviridae）は、感染細胞の細胞質内のみで複製を行う、大きな二本鎖DNAを含むウイルスで構成されている。...のメンバーは

こんにちは。ホワイトヘッド生物医学研究所のKate Rubins研究室のJudy Yenです。以前のJoVEビデオプロトコルで紹介した、HeLa細胞へのワクシニアウイルス感染と全RNAの単離に続き、逆転写およびin vitro転写を用いてウイルスRNAを単離・増幅させます。この増幅されたRNAは、後にウイルスおよび宿主遺伝子発現のマイクロアレイ解析に使用します。それでは始めましょう。RNAからのcDNA合成を開始するには、ambient amino allele message AMP two kitを使用する前に、推奨量の100%エタノールを洗浄バッファーに加えてください。PCR反応チューブに、100 ngから5 µgの全RNAと1 µLのT7オリゴプライマーを加えます。ヌクレアーゼフリーウォーターを用いて、液量を12 µLに調整します。サーモサイクラーを用いて、サンプルを70 °Cで10分間インキュベートします。次に、遠心分離機を用いてRNAサンプルを70°Cから取り出します。遠心分離後、速やかにサンプルを氷上に置きます。分注誤差を考慮し、10%の過剰量を含めて第1ストランド合成用マスターミックスを調製します。室温に置き、マスターミックスをピペッティングまたは軽く弾いて穏やかに混ぜた後、短時間遠心分離します。遠心分離後、各RNAサンプルにマスターミックスを8 µLずつ分注し、ピペッティングで3〜4回混ぜ合わせ、サーモサイクラーを用いて42 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを短時間遠心分離し、氷上に置きます。直ちに次のステップであるdsDNA合成に進みます。氷上で、分注誤差を補正するために10%の過剰量を含めた第2ストランド合成マスターミックスを調製します。マスターミックスを穏やかにピペッティングするか、軽く指で弾いて混ぜた後、短時間遠心分離します。各サンプルに80 µLずつ分注し、ピペッティングで3〜4回穏やかに混合します。サーモサイクラーを用い、16 °Cで2時間インキュベートします。2時間のインキュベーション後、cDNAの精製ステップに進むか、直ちに-20°Cで冷凍保存します。二本鎖cDNAの精製を開始するには、まずcDNA Pureを冷蔵庫から取り出し、使用前に30分間室温に戻します。使用前にボトルを振って磁性cDNA結合ビーズを完全に再懸濁させてください。ヌクレアーゼフリー水を1.5 mLチューブに分注し、50〜60°Cで少なくとも10分間インキュベートします。前の2時間のインキュベーションの間に、各サンプルに180 µLのCD NA pureを加え、ピペッティングで十分に混合します。サンプルを96ウェルラウンドボトムプレートに移します。サンプルをプレートに移した後、オービタルシェーカーでプレートを少なくとも2分間

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