ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その3

こんにちは、ホワイトヘッド生物医学研究所のケイト・ルービンズ研究室のジュディ・Yです。ここでは、ワクシニアウイルスに感染したhela細胞と、色素のアミノオールLEOカップリングによるウイルスの両方から収集されたアンチセンスRNAサンプルを標識する方法を示します。次に、標識されたA RNAをクリーンアップし、遺伝子発現のマイクロアレイ解析のためにハイブリダイズする準備をする方法を示します。

以前のJoeのビデオでは、ウイルス感染、全RNA単離、RNA増幅および増幅ステップの実行方法を紹介しています。それでは始めましょう。RNAの標識を開始するには、まず1マイクログラムのA RNAサンプルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに加えます。

サンプルが完全に乾くまで、弱火または無熱で真空乾燥します。乾いたらすぐに各チューブにキャップをします。サンプルが乾燥した後は、サンプルを過度に乾燥させないことが重要です。

各チューブに9マイクロリットルのカップリングバッファーを追加し、1分間ゆっくりとボルテックスしてA RNAを再懸濁し、遠心分離機で短時間サンプルをチューブの底に集め、サンプルを氷上に置きます。次に、SCI 3またはS 5染料の各チューブに22マイクロリットルの高品質DMSOを追加します。S SI 3ダイは参照サンプルのラベリング用、SCI 5色素はテストサンプルのラベリング用です。

染料をボルテックスして完全に混合します。使用する準備ができるまで、染料を暗所に置いておくことを忘れないでください。使用の1時間以上前に染料を準備し、染料DMSOミックスに水が入らないように注意してください。

ここで、調製したD-M-S-O-S染料混合物を各サンプルに11マイクロリットルでボルテックスによりよく混合した。室温で30〜45分間静かにインキュベートします。サンプルをアルミホイルで覆うか、引き出しに保管して、光への曝露を最小限に抑えます。

4.5マイクロリットルのヒドロキシラミンを各サンプルにインキュベートした後、ボルテックスによりよく混合された反応を急冷する。ほうきの温度でさらに15分間静かにインキュベートします。サンプルをアルミホイルで覆うか、引き出しに保管して、光への曝露を最小限に抑えます。

ラベルをきれいにするために、彼らはRNAボルテックス、RNA結合ビーズ。簡単に言うと、使用前に均一な混合物を得るために、室温でA RNA結合混合物を調製します。A RNA溶出バッファーを1.5ミリリットルのチューブにボルテックスして結合混合物をよく混合し、摂氏50〜60度で少なくとも10分間インキュベートします。

各サンプルに70マイクロリットルのA RNA結合混合物を加え、パイプでよく混合し、混合後に3〜4回上下に加え、PCRプレートからサンプルを96ウェル丸底プレートに移します。次に、各サンプルに50マイクロリットルの100%イソプロパノールを加え、ピペッティングで3〜4回上下してよく混合します。オービタルシェーカーでプレートを少なくとも2分間静かに振ってください。

サンプルを完全に混合します。プレートをマグネットスタンドに移動します。磁気ビーズを捕らえるため。

混合物が透明になり、結合ビーズがペレット状になるまで、プレートをスタンドに置いておきます。磁気ビーズを乱さずに真空吸引器で上清を慎重に吸引します。または、ピペットで上清を慎重に取り除き、上清を捨てます。

上清は、取り込まれていない色素分子のために、この時点では明るいピンクまたは明るい青のいずれかである必要があります。上清を捨てたら、プレートを磁気スタンドから取り出します。次に、各ウェルに100マイクロリットルのRNA洗浄溶液を加え、オービタルシェーカーでプレートを適度な速度で1分間振とうします。

このステップではビーズが完全に分散しない場合があるため、プレートを磁気スタンドに戻します。磁気ビーズを捕らえるため。磁気ビーズを乱さずに真空吸引器で上清を慎重に吸引します。

または、ピペットで上清を慎重に取り除き、上清を捨てます。プレートをマグネットスタンドから取り外します。100マイクロリットル、A RNA洗浄液で2回目の洗浄を繰り返します。

2回目の洗浄後。オービタルシェーカーでプレートを最大速度で1分間振ってビーズを乾燥させます。サンプルを乾燥しすぎないように、予熱した20マイクロリットルのA RNA溶出バッファーを添加してビーズからARNAを溶出させます。

各サンプルに対して、オービタルシェーカーのプレートを3分間激しく振ってください。次に、磁気ビーズが完全に分散していることを確認します。そうでない場合は、振とうを続けます。

磁気ビーズが完全に分散したら、プレートを磁気スタンドに移動して磁気ビーズを捕捉します。上清には、クリーンアップされた標識A RNAサンプルが含まれており、淡いピンクまたは淡い青色である必要があります。次に、言及されたRNAを新しいPCRプレートまたはPCRチューブに慎重に移します。

この時点で、NanoDrop分光光度計で1.5マイクロリットルを測定することにより、サンプル中のRNA濃度と色素の量を確認できます。マイクロアレイモジュールを使用すると、標識されたA RNAを選択したマイクロアレイプラットフォームにすぐにハイブリダイズできます。あるいは、ハイブリダイゼーションの準備ができるまで、標識されたA RNAを摂氏マイナス80度で保存することもできます。

これは、NanoDrop分光光度計を使用して生成された代表的な分光光度計の読み取り値とODプロットで、サンプル濃度と色素の取り込みを測定します。サンプルの濃度を計算するための 260 ナノメートルの OD ピークと、S3 と SCI の 5 つの色素をそれぞれ表す 532 ナノメートルと 635 ナノメートルの 2 つのピークを確認できます。マイクロレイハイブリダイゼーションのために、増幅された免疫対立遺伝子に組み込まれたRNAサンプルを蛍光標識する方法を示しました。

この手順を実行するときは、カップリングの1時間未満で染料をDMSOに再懸濁し、染料の活性基と反応するため、染料DMSO混合物に水が入らないようにすることが重要です。また、必要に応じてRNAを過度に乾燥させないことも重要です。サンプルは、完全に乾燥させるのではなく、1〜2マイクロリットルまで乾燥させ、カップリング反応中にカップリングバッファーに十分に再懸濁することができます。

反応は暗闇の中で、時折フリックしておき、必要に応じてスピンダウンします。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

このシリーズの他のビデオでは、ワクシニアウイルスによる経時的な感染とサンプルのRNA抽出方法、およびRNAサンプルの線形増幅の手順を紹介していますので、ぜひご覧ください。