Name: ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その3 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶワクシニアウイルス感染HeLa細胞由来アンチセンスRNAのアミノアリル結合による蛍光標記法とマイクロアレイ解析前の精製プロセス。この手法は宿主とウイルスの遺伝子発現動態を解明する上で重要です。

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ホワイトヘッド研究所フェローファンド

パート1：aRNAの標識：色素のアミノアリルカップリング<ol><li> 1.5ml微量遠心チューブにaRNAのサンプルの1μgのを追加。 </li><li>彼らは完全に乾燥されるまで低いかゼロの熱で試料をドライ真空。とすぐに乾燥しているとして、各チューブにフタを- 乾燥し過ぎたしないでください！ </li><li>各チューブに9μlカップリング緩衝液を加え、穏やかに1分間ボルテックスでaRNAを再懸濁します。チューブの底にサンプルを収集するために手短に遠心し、サンプルが氷の上に座ってみましょう。 </li><li> Cy3またはCy5色素の各チューブに22μlの高品質のDMSOを追加。染料の一管は十分な2サンプル用です。 Cy3標識色素は、参照試料を標識するためです、とCy5色素は、テストサンプルを標識するためです。 </li><li>渦染料が完全に混合する。使用する準備ができるまで暗闇の中で染料を保管してください。使用する前に、前の1時間より染料を用意しないでください。水がどの時点でも染料/ DMSO混合で取得しないことを確認します。 </li><li>各サンプルに準備DMSO / Cyの染料の11μlを追加。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 </li><li>室温で30〜45分インキュベートする。アルミホイルで試料を覆ったり、光への曝露を最小限に抑えるために引き出しに保管してください。 </li><li>インキュベーション後、反応をクエンチするために各サンプルに4.5μlhydroxlyamineを追加。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 </li><li>室温でさらに15分間インキュベートする。アルミホイルで試料を覆ったり、光への曝露を最小限に抑えるために引き出しに保管してください。 </li></ol>パート2：aRNAのクリーンアップ標識<ol><li>簡単に渦RNA結合ビーズを使用前であっても混合物を得ること。 </li><li>室温でaRNAの結合ミックスを準備します。（表1） </li><li>ボルテックスでよく混ぜる。 </li><li>少なくとも10分間50〜60℃で1.5mlチューブとインキュベートにaRNAの溶出バッファーをAliquote。 </li><li>各サンプルにaRNAの結合ミックスの70μlを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。 </li><li> PCRプレートから96ウェル丸底プレートにサンプルを移す。 </li><li>各サンプルに100％イソプロパノール50μlのを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。 </li><li>やさしく徹底的にサンプルを混ぜるために、少なくとも2分間オービタルシェーカー上でプレートを振る。 </li><li>磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。混合物が透明になり、結合ビーズをペレット化されるまで、スタンドにプレートを残す。 </li><li>慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。上清は、明るいピンク色または非法人の色素分子のためにこの時点では明るい青のいずれかでなければなりません。 </li><li>磁気スタンドからプレートを取り外します。 </li><li>各ウェルに100μlのaRNAの洗浄液を追加し、適度なスピードでオービタルシェーカー上で1分間プレートを振る。ビーズは、完全にこの段階では分散されないことがあります。 </li><li>磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。 </li><li>慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。 </li><li>磁気スタンドからプレートを取り外します。 </li><li> 100μlのaRNAの洗浄溶液で洗浄2回目のタイムを繰り返します。 </li><li>第2回洗浄した後、最高速度でオービタルシェーカー上で1分間プレートを振とうしてビーズを乾燥させる。サンプルを乾燥し過ぎたしないでください！ </li><li>各サンプルに20μlの予熱aRNAの溶出バッファーを添加することによりビーズからaRNAのを溶出する。 </li><li>精力的に3分間オービタルシェーカー上でプレートを横に振ると、磁性ビーズが十分に分散されている確認してください。されていない場合は、揺れ続ける。 </li><li>磁気ビーズが完全に分散した後、磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。上清は、クリーンアップ、ラベルされたaRNAのサンプルが含まれており、淡いピンクや淡いブルーのどちらかでなければなりません。 </li><li>慎重に新たなPCRプレート（またはPCRチューブ）に溶出されたaRNAを転送します。 </li><li> （オプションの手順）は、マイクロアレイのモジュールを使用して光度計分光光度計に1.5μlずつを測定することにより、サンプル中のRNAの濃度と色素の量を確認してください。 </li><li>あなたがハイブリダイゼーションのための準備が整うまではすぐに代わりにお好みのマイクロアレイプラットフォームにラベル付けaRNAをハイブリダイズする、または、あなたは、-80 ° Cで標識したaRNAを保存することができます。 </li></ol>表1 aRNAをバインドミックス<table border="1"><tbody><tr><td>試薬</td><td> 1反応量</td></tr><tr><td> RNA結合ビーズ* </td><td> 10μlの</td></tr><tr><td>ビーズの再懸濁ソリューション* </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100％イソプロパノール** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> aRNAの結合バッファー濃縮液</td><td> 50μlの</td></tr></tbody></table> *とRNA結合ビーズをミックスビーズ懸濁液第一 **イソプロパノールを追加し、aRNAの結合バッファー濃縮液を添加する前によく混ぜる。

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

重要なステップアミノアリルカップリングを実行するとき、それはカップリングの前にすぐにDMSO（1時間未満）で色素を再懸濁し、それが染料でアクティブグループと反応するので、水が、染料/ DMSO混合に入ったことを確認するため、重要です。 RNAを（1 - 2uLではなく、完全に乾燥するまで乾燥することができます）乾燥し過ぎた、そしてカップリングバッファにうまく懸濁しないでください。カップリング反応中に、時折のフリックで、暗所で反応を維持し、必要に応じてスピンダウン。 アプリケーション/意義このプロトコルに起因する標識されたRNAは、培養で感染した細胞に遺伝子発現の応答を評価するために、人間のウイルス、またはカスタムマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。マイクロアレイプラットフォームが異なるため、標識プローブからハイブリダイゼーション混合物の調製のための製造業者の指示に従ってください。 カスタム設計されたポックスウイ...

<table><tbody><tr><td>CyDye ポストラベリング反応性染料パック</td><td>試薬</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Cy3およびCy5染料の両方を含む</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS 分光光度計</td><td>その他</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>または同等の分光光度計</td></tr></tbody></table>

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

家族の<em&gt;ポックスウイルス科</em&gt;感染細胞の細胞質中に独占的に複製するウイルスを含む大規模な二重鎖DNAで構成されています。のメンバー<em&gt;オルトポックス</em&gt;属インクルード天然痘、人間の天然痘、サル痘、およびワクシニア（VAC）の原因物質、ウイルスの家族の原型の一員。比較的大きな（〜200 KB）ワクシニアゲノムの中で、遺伝子の3つのクラスは、エンコードされています：初期、中間、および遅い。すべての3つのクラスがウイルスによりコードされたRNAポリメラーゼによって転写されていますが、各クラスには、ウイルスのライフサイクルの異なる機能を果たします。ポックスウイルスは感染時に宿主細胞環境の変調のための複数の戦略を利用する。両方のホストとウイルスの遺伝子発現の調節を理解するために、我々は、ウイルスと宿主細胞の両方から転写産物量を分析するためにゲノムワイドなアプローチを利用してきた。ここで、我々は、いくつかの時点感染後におけるワクシニアウイルスとサンプリングのRNAとHeLa細胞の経時的感染を示す。両方のホストとウイルスの全RNAを単離し、遺伝子発現の解析用マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのために増幅されます。

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。パート3は、蛍光色素のアミノアリルカップリングにより、両方のホストとウイルスのサンプルから増幅されたRNAを標識するプロセスを説明します。 3のパート3。

ポックスウイルス科（Poxviridae）は、感染細胞の細胞質のみで複製を行う、大きな二本鎖DNAを含むウイルスで構成されている。...のメンバーは、

こんにちは。ホワイトヘッド生物医学研究所のKate Rubins研究室のJudy Yです。ここでは、ワクシニアウイルスに感染させたHeLa細胞およびウイルスから回収したアンチセンスRNAサンプルを、アミノアリルLEOカップリング法を用いて色素で標識する方法を実演します。その後、標識したアンチセンスRNAを精製し、遺伝子発現のマイクロアレイ解析に向けてハイブリダイゼーションの準備を行う方法について説明します。以前のJoVEビデオでは、ウイルス感染、全RNA分離、およびRNA増幅の手順について詳しく解説しました。それでは、始めていきましょう。RNAラベル化を開始するには、まず1.5 mLマイクロ遠心チューブに1 µgのRNAサンプルを加えます。サンプルが完全に乾燥するまで、低熱または無加熱で真空乾燥させます。乾燥しだい、すぐに各チューブにキャップをします。乾燥した後にサンプルを過剰に乾燥させないことが重要です。各チューブに9 µLのカップリングバッファーを加え、1分間緩やかにボルテックスしてA RNAを再懸濁します。短時間遠心してサンプルをチューブの底に集め、その後、サンプルを氷上に置きます。次に、Cy3またはCy5染料を含む各チューブに22 µLの高純度DMSOを加えます。染料1本につきサンプル2つ分として十分な量です。Cy3染料はリファレンスサンプルの標識用、Cy5染料はテストサンプルの標識用に使用します。染料をボルテックスして十分に混合します。使用するまで染料を遮光して保存することを忘れないでください。染料の調製は使用する1時間前より早く行わず、また、染料のDMSO混合液にいかなる時点でも水が入らないようにしてください。準備したD-M-S-O-S染料混合液を各サンプルに11 µLずつ加え、ボルテックスで十分に混合します。室温で30～45分間緩やかにインキュベートします。光への曝露を最小限に抑えるため、サンプルをアルミホイルで覆うか、引き出しの中に保管してください。インキュベーション後、各サンプルに4.5 µLのヒドロキシルアミンを加えて反応を停止させ、ボルテックスで十分に混合します。室温でさらに15分間、緩やかにインキュベートします。光への曝露を最小限に抑えるため、サンプルをアルミホイルで覆うか、引き出しの中に保管してください。ラベルを洗浄するために、RNAボルテックスを行い、RNA結合ビーズを処理します。使用前に均一な混合液を得るため、室温でA RNA結合ミックスを調製します。結合ミックスをボルテックスで十分に混合し、A RNA溶出バッファーを1.5 milliliterチューブに分注し、50 to 60 °Cで少なくとも10分間インキュベートします。各サンプルに70 µLのA RNA結合ミックスを加え、ピペッティングを3〜4回繰り返して十分に混合した後、サンプルをPCRプレートから96ウェル丸底プレートに転送します。次に、各サンプルに50 µLの100%イソプロパノールを加え、ピペッティングを3〜4回繰り返して十分に混合します。その後、オービタルシェーカーでプレートを少なくとも2分間、緩やかに振盪させます。サンプルを十分に混合します。プレートをマグネットスタンドに移動させます。磁気ビーズを回収します。混合液が透明になり、結合ビーズがペレット状に集まるまで、プレートをスタンドに置いたままにします。磁気ビーズを乱さないように、バキュームアスピレーターで上清を注意深く吸引してください。あるいは、ピペットで注意深く上清を取り除き、廃棄してください。未結合の色素分子により、この時点での上清は鮮やかなピンク色または鮮やかな青色になっているはずです。上清を捨てた後、プレートをマグネットスタンドから取り出します。次に、各ウェルに100 µLのRNA洗浄溶液を加え、オービタルシェーカーで中速で1分間プレートを振盪します。この段階ではビーズが完全に分散しない場合があるため、プレートをマグネチックスタンドに戻してください。磁気ビーズを捕捉させ、磁気ビーズを乱さないように真空吸引装置で上清を慎重に吸引します。あるいは、ピペットを用いて上清を慎重に除去し、廃棄します。磁気スタンドからプレートを取り出します。100 µLのA RNA wash solutionを用いて、2回目の洗浄を繰り返します。2回目の洗浄後、オービタルシェーカーを用いて最大速度で1分間プレートを振盪し、ビーズを乾燥させます。サンプルを乾燥させすぎないように注意してください。あらかじめ加熱しておいたA RNA溶出バッファーを20 µL加え、ビーズからA RNAを溶出させます。各サンプルについて、オービタルシェーカーでプレートを3分間激しく振盪します。その後、磁気ビーズが完全に分散しているか確認してください。分散していない場合は、振盪を続けます。磁気ビーズを完全に分散させた後、プレートをマグネットスタンドに移動させ、磁気ビーズを回収します。上清には精製されたラベル付きA RNAサンプルが含まれており、色は淡いピンク色または淡い青色になります。次に、回収したA RNAを新しいPCRプレートまたはPCRチューブに注意深く移します。この時点で、NanoDrop分光光度計を用いて1.5 µLを測定し、サンプル中のRNA濃度および染料量を確認することができます。マイクロアレイモジュールを使用して、ラベル化したA RNAを任意のマイクロアレイプラットフォームに直ちにハイブリダイズさせます。または、ハイブリダイゼーションの準備が整うまで、ラベル化したA RNAを-80 °Cで保存することも可能です。これは、サンプルの濃度および色素の取り込み量を測定するためにNanoDrop分光光度計を用いて作成された、代表的な分光光度計の読み取り値およびODプロットです。サンプルの濃度算出に用いられる260 nanometersのODピークに加えて、それぞれS3およびSCIの5色色素を示す532および635 nanometers付近の2つのピークを確認できます。以上で、マイクロアレイハイブリダイゼーションに向けて、増幅されたイムノアレル組み込みRNAサンプルを蛍光標識する方法について説明しました。この手順を行う際は、カップリングの1時間前までに色素をDMSOで再懸濁させ、色素のDMSO混合液に水が入らないようにすることが重要です。水が入ると、色素の活性基と反応してしまいます。また、必要に応じてRNAを乾燥させる場合、乾燥させすぎないように注意してください。サンプルは完全に乾燥させるのではなく、1〜2 µLまで濃縮し、カップリング反応中にカップリングバッファーで十分に再懸濁させてください。反応液は暗所に保存し、時々軽くタッピングし、必要に応じて遠心分離で液を回収してください。以上で手順は終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。ワクシニアウイルスを用いた時系列感染の行い方、サンプルのRNA抽出、およびRNAサンプルの線形増幅の手順を解説している、本シリーズの他のビデオもぜひ併せてご覧ください。

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