Name: ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学ぶヒトES細胞の培養維持法。H1およびH9細胞株を用いたコラゲナーゼによる継代技術と、内皮細胞への分化誘導を目指した幹細胞研究の応用可能性について解説する。

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<ol><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Pruszak, J., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> , John Wiley and Sons. (2007).</li>
<li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li>
<li>Sonntag, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li>
<li>Ko, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous%2C+stable%2C+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li>
<li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages%2C+including+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li>
<li>Pankratz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Lazzari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts%3A+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li>
<li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li>
</ol>

ヒト胚性幹（es）細胞の増殖

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

私はローレン・デオンです。MGHのヒトAmgen幹細胞共施設（Human Amgen stem cell co facility）の責任者を務めています。はい、ローレンです。MGHのヒトAM幹細胞共施設の責任者をしています。私は以前、ジョージ・デ・ラボでポストドクとして活動していた4年前から、長年にわたりヒトAmgen幹細胞を用いて研究を行ってきました。現在、私たちはY cell由来のH1とH9という2つの細胞株を使用しています。これらの細胞を培養して増殖または維持させる方法、少なくとも細胞を継代する方法としては、コラゲナーゼを使用しています。通常、細胞を播種した後の最初の数回の継代では、コロニーピッキングという手法を用います。これにより、顕微鏡下でどのコロニーが良好で、分化しており、形態が良いかを確認できます。これらのコロニーのみを回収し、数片に切り分けてから、新しいフラスコに移します。分化していないように見えるコロニーは、そのままにしておきます。細胞を継代させるもう一つの方法は、トリプシンを使用することです。ここではこの手法は用いません。ヒト幹細胞は個々の細胞に分離されることや単独で存在することを嫌うため、コラゲナーゼを使用する方がより安全であると考えられます。したがって、トリプシンを使用する場合、他の種類の細胞で使用するように3〜4分間など、少し長く使いすぎると、ヒト幹細胞は個々の細胞に分離してしまい、その多くが死滅するか、分化するか、あるいは基質に接着しなくなります。そのため、細胞を凝集塊として維持することが重要であり、フラスコ内で細胞を単一の状態で放置してはいけません。コラゲナーゼを使用する利点は、細胞を植物状の形態（plants）で維持できることです。一方、チップス（chipsy）を使用すると、opsonizationという極めて過酷なプロセスを生き抜く細胞のみを選択することになります。そのため、これらの細胞は通常、非常に高い増殖能を有しています。このように、細胞をこのトリプシン処理に適応させることができます。問題は、細胞によって挙動が異なり、増殖速度が大幅に速くなるものがあることです。そして、この非常に速い分裂プロセスによって、染色体異常が生じるリスクがあります。つまり、多く増殖能を持つ細胞において、培養中の選択が起こり得るとおっしゃるのですね。その通りです。他の細胞よりも活性が高く、おそらく生存率も高くなります。したがって、基本的にトリプシンを用いた増殖後の培養において、数回の継代を繰り返すと、これらの異なる特性を持つ別の培養系になります。そのため、これらが完全に同一であるかどうかを判断するのは困難です。一般的なテスト、例えばOC4、nano 1 60 SC4 C、C3といった終末分化した細胞の通常のマーカーを確認しても、これらの分子は依然として発現している可能性があります。また、TER形成を行った場合、これらの細胞は依然として分化し、正常な細胞のように形成される可能性があります。核型を分析しても、異常が見られる場合もあれば、正常な核型を維持している場合もあります。選択的優位性は、核型分析では検出できない単なる変異によるものである可能性があります。したがって、増殖速度が著しく速いという事実自体が、より深刻な状況であると考えられます。また、将来的にこれらの細胞を移植に使用したいと考えているのであれば、私は間違いなくこの種類の細胞は使用しません。さて、細胞の継代にこの手法、つまりSを使用する場合の主な技術的問題点について教えていただけますか？単に時間がより長くかかるだけでなく、細胞の増殖速度が遅いため、実験に必要な十分な数の細胞を得るまでにより多くの時間を要します。そのため、利便性が低いと言わざるを得ません。それでは、今回の実験の目的について簡単に教えていただけますか？CS細胞をどのように使用しますか？さて、ここでの私の主なプロジェクトは、ヒトAB幹細胞から内皮細胞を得ることです。そして、その目的は血液を生成できるようにすることです。私たちは組織バイオエンジニアリングの研究室と密接に連携しており、彼らの目標の一つはin vitroで組織を作製することです。しかし、その制限の一つとなっているのが、これらの組織内に血管が不足していることです。したがって、もし内皮細胞をこれらの組織に導入できれば、組織の成長をより促進させることができると考えられます。血管内皮細胞の細胞源としては、臍帯血や末梢血など少数のソースしか知られていませんが、ヒトiPS細胞のような別の細胞源があれば非常に有用です。ヒトiPS細胞はほぼ無限に増殖させることができ、さらにこれらの細胞を改変して誘導システムを構築し、最終製品である材料細胞として利用できるという利点があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

自己複製能と身体のあらゆる細胞タイプに分化するヒト胚性幹細胞の能力には、両方の医療アプリケーション用の開発や病気の根本的な問題に対処するための研究ツールとして有望視されて保持することを示唆している。ここでは、内部細胞塊のimmunosurgicalの分離による胚からのヒト胚性幹細胞の派生のための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供しています。...

免疫手術でヒト胚性幹細胞の導出

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。...

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特定の細胞へのヒトES細胞の監督分化、再生医療に大きな関心を生成しています。我々は決定するための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供する...

テラトーマ形成により、ヒト胚性幹細胞の運命のマッピング

遺伝子組み換えの最近の進歩にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESC）のトランスフェクションは、気まぐれなプロセスのままです。我々の知る限りでは、人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）トランスフェクトする体系的かつ効率的な方法が報告されていない。ここでは、効率的にトランスフェクトし、人間性IPSCをnucleofectするための堅牢なプロトコルを記述。...

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

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小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。...

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

レポーター細胞株は、視覚追跡し、不均一な集団から目的の細胞を単離する手段を提供する。しかし、遺伝子ターゲッティングヒト胚性幹細胞は、従来の相同組換えを使用しては非常に非効率的である。本明細書では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ増強相同組換えを使用して、EGFPとCNS中脳特異的転写因子PITX3遺伝子座を標的と記載している。...

ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

ここでは私たちの研究室ではヒト胚性幹細胞株の色合いをフリーズする方法を示します。...

凍結ヒトES細胞

学ぶヒトES細胞の培養維持法。H1およびH9細胞株を用いたコラゲナーゼによる継代技術と、内皮細胞への分化誘導を目指した幹細胞研究の応用可能性について解説する。

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

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