Name: 広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 学ぶ広視野顕微鏡を用いた哺乳類細胞の長期ライブイメージング法。37度恒温環境と倒立型顕微鏡設定により、細胞分裂過程をリアルタイムで観察し、神経科学研究に有用なデータを取得する技術です。

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広視野顕微鏡を用いて長期的なイメージング哺乳類細胞

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

実際に行う手順としては、まずここに固定し、その後に交換します。では、可能な限り慎重に吸引します。よし。数秒間保持します。はい。大丈夫です。このライブセルイメージンググリッドの重要な特徴は、倒立顕微鏡であることです。つまり、対物レンズとサンプルが下側に配置されています。対物レンズは上を向いており、対物レンズとサンプルを含む顕微鏡のほぼ全体が37 °Cに保たれています。したがって、このプラスチックボックス内のすべてが37 °Cに維持されています。ステージのすぐ上に、空気とCO2の混合ガスが供給されています。濃度は5%CO2です。つまり、サンプルが実際にはセルの中にあり、あたかもセルインキュベーターの中にいるような状態にするのが狙いです。このように、こちらが空気とCO2のミキサーで、加湿および加熱された後、ステージ上のサンプルに配管されます。さて、本日は蛍光1チャンネルのGFP蛍光のみを行います。こちらが5% CO2が導入されるホースで、ステージホルダーにそのまま適合します。それは重要です。次に、これらを閉じて取り出し、最初のポジションへ移動します。まず、コントロールサンプルである最初の視野に向かい、画面上の表示に基づいてポジションを選択します。各ウェルに移動するたびに、必ず顕微鏡で確認するようにしてください。ウェルごとに焦点面が異なり、ディッシュの底部が完全に平らではないためです。したがって、ウェルを移動する際には微調整が必要になります。現在は最初のウェルにいますので、焦点を合わせます。まず、顕微鏡の透過光を点灯させます。そして、すべての光が接眼レンズに届いていることを確認します。接眼レンズを覗き、視野がきれいに確保されているかを確認してください。その後、透過光を消して蛍光灯を点灯させ、観察している細胞が健全であり、アポトーシスを起こしていないことを確認します。そして、これをオフにします。次に、送信を行います。ここから位置の選択を始めますので、光路をカメラに送る必要があります。こちらがカメラです。顕微鏡の設定をすべてカメラに送るようにするため、接眼レンズからは何も見えなくなります。そこで、顕微鏡を制御するソフトウェアで、今回の目的に適したフィルターセットであるpsyを選択し、その後、露光時間を設定します。私はこれらの細胞を非常によく知っており、露光時間が0.2秒で適切であることも分かっています。そのため、ソフトウェアにそのように設定し、「フォーカス」ボタンを押します。これは、基本的に生存している状態です。ライトが点灯し、細胞が見えるかと思いますが、ここが良好な視野である理由は、蛍光も含め、すべての細胞にアポトーシス細胞が見られないためです。アポトーシス細胞は非常に強く発光する傾向があり、また、視野内に汚れやゴミも存在しません。こちらに見えるのは、実際、これが中期細胞で、あちらも中期細胞です。そして、こちらの細胞はおそらく有糸分裂を終えたばかりの細胞だと思われます。というのも、2組のクロマチンが非常にきれいに配向しており、ちょうど終期を終えたばかりのように見えるからです。これで良好な視野が得られました。露出時間とフィルターセットが適切であることが確認できましたので、次に（ソフトウェアによって操作は異なりますが）ポジションの保存を行います。これで、ソフトウェアにその視野のX、Y、Z座標が記憶されました。同じウェル内で別の視野を選択する場合は、シャッターを開けて画面上の表示を確認し、接眼レンズで直接覗くのではなく、その画面上の映像に基づいて視野を選択します。したがって、トニックはどれも見当たりません。しかし、繰り返しになりますが、たとえ適切に中心に配置されていても、これらの細胞は私のPS（分光計）を通過します。こちらが良い例です。私が避けるべきものの良い例がこちらにあります。どれほど明るいか分かりますか？非常に明るい部分があります。これはおそらくアポトーシス細胞の残骸です。ここを避ける理由は、非常に明るいため、ソフトウェアがオートフォーカスを行う際にそこだけにピントが合ってしまい、他のすべての細胞と同じ平面上にならなくなるからです。したがって、その視野からは情報を得られません。ここは良いですね。ここに前中期があり、あちらが中期です。したがって、1ウェルにつき3つのポジションを撮影します。これで3ポジションとなりますので、次のウェルに移ります。おそらく10分ごとに画像を撮影することになります。これは妥協案です。ライフスタイルイメージングは、常に妥協の産物であると言えます。イメージングを行いながら、特に有糸分裂に関心がある場合は、細胞を健全な状態に維持しなければなりません。したがって、蛍光光線への曝露を最小限に抑える必要があります。そして、情報を取得する必要があります。そのため、画像を撮影しなければなりませんが、何を捉えたいか、どのような情報を取得したいかについて、妥協点を見出し、選択する必要があります。今回の目的において、有糸分裂には通常約1時間かかります。したがって、10分間隔で撮影していれば、十分だと言えます。前相、中相、後相が観察でき、特定の細胞周期ステージに影響を与える処理や薬剤、またはsiRNAがある場合に、いつそれが起こるかを確認できます。今回の目的においてはこれで十分ですが、常にさらなる詳細が求められます。より多くの測定位置や、より短い時間間隔などが常に求められますが、そこは妥協点となります。それでは、スタートボタンを押します。そこで、当ソフトウェアでは、最初のパスでオートフォーカス処理を行います。開始ボタンを押すとオートフォーカスが始まり、オートフォーカスの間にシャッターが開閉するのが確認できます。では、開始します。これがシャッターの開閉動作です。Z軸モーターが作動し、最もコントラストが高く、つまり最もピントが合っている面を探しています。画面上で、最適なフォーカス面を探索するためにピントが合ったり外れたりしている様子が見て取れますが、これは懸念される点かもしれません。これにより、Zモーターを駆動して、最もピントが合った平面、つまり最も画像が鮮明な面を探索します。そこで画像を撮影し、そのZ位置を記録します。そして、そのZ位置を以降の12回のパスで使用します。そして、もう一度オートフォーカス処理を行います。どのような実験を行っているのでしょうか？はい、私たちの研究室は主に、有糸分裂の進行を制御する要因を理解することに関心を持っており、少なくとも私はそれに最も関心があります。生細胞イメージング、特に当研究室のマルチポジション・長期イメージング顕微鏡を使用すれば、細胞が有糸分裂に入る様子を2〜3日間にわたって撮影でき、複数回の有糸分裂サイクルをイメージングして解析することが可能です。さらに、研究したい細胞に対して薬剤やRNA、あるいはあらゆる種類の摂動を加えることができます。これにより、それらの薬剤や遺伝子が有糸分裂の進行の制御にどのように関与しているかを理解することができます。固定細胞ではなく生細胞を用いた解析であるため、有糸分裂に影響を与えるためにいつ摂動を加えるべきか、あるいは有糸分裂のどの段階が影響を受けるのかを把握することができます。その点において、本手法は非常に強力です。では、この実験における主要な技術的要素は何でしょうか？想定される問題は何でしょうか。まず、装置をセットアップすること自体が容易ではありませんが、それ以外で最大の課題は、装置を所有していても、それが自身のアプリケーションに適切に機能するかを確認することにあります。金銭的な要素は、決して小さくありません。装置のセットアップがあり、そしてデータを収集した後は、本格的なデータ解析の問題に直面します。例えば、30個の細胞を含む動画を40本収集したとします。つまり、撮影した40箇所の視野それぞれに30個の細胞がある場合、それら一本一本の動画に向き合い、動画内のすべての細胞を確認しなければなりません。そのため、データ解析に非常に長い時間がかかります。つまり、2日間で収集したデータの解析に1週間かかるということです。したがって、大量のデータを収集する上で、これが非常に大きな障害となります。つまり、データの収集はハイスループットですが、解析はハイスループットではありません。では、この実験を真にハイスループットにするにはどうすればよいでしょうか。現在、私たちの研究室では、データ解析を自動的に行うプログラムを開発しているところです。そして、これはかなり優れたプログラムです。完璧ではありません。人間の目の方が常に勝りますが、それに近づきつつあります。では、この実験の興味深い応用例にはどのようなものがあるでしょうか？細胞分裂以外に、どのような分野が挙げられるでしょうか？つまり、ええと、ライブセルイメージングのことですね？はい。そうですね、細胞運動能アッセイが可能です。使用する顕微鏡の種類によりますが、細胞の様子を観察したり、必要であれば腫瘍の形成過程を観察したりすることもできます。しかし、適切なイメージング設定さえあれば、ほぼあらゆる制限なく観察することが可能です。我々の顕微鏡は広視野であり、20倍の対物レンズを使用しています。そのため、解像度はかなり低い設定になりますが、観察目的には十分な性能を備えています。ですから、制限があるわけではなく、むしろ全くないと言えます。生物学のような動的な実験を伴うあらゆる研究は、ライブセルイメージングから大きな恩恵を受けるでしょう。例えばカルシウムイメージングなどが挙げられますが、当装置では実施できなくても、それはライブセル（生細胞）の解析にあたります。それには間違いなくライブセルイメージングが必要です。先ほど申し上げたように、患者サンプルを用いたアッセイや運動能アッセイなどは、ライブセルイメージングによるメリットが非常に大きいです。これまでのご経験について、少しお話しいただけますか？これらの手法にどのくらいの期間取り組んでいるのですか？その前は何に取り組んでいたのですか？なるほど。博士課程では、私は取り組んでいませんでした。私は共焦点顕微鏡を数多く使用してきましたが、ライブセルイメージングは行いませんでした。そのため、ポストドク期間中に、Dr. Kingがこの装置を導入し、これらのフラグメントをセットアップして運用できるようにするのを手伝いました。したがって、ポストドクの間、私はワイドフィールド顕微鏡によるタイムラプスイメージングと、共焦点顕微鏡によるタイムラプスイメージングの両方において多くの経験を積みました。これは非常に強力な手法だと言えます。多くの情報を得ることができますが、完璧に動作させるのは簡単ではありません。そのため、プロセスのあらゆる細かなステップにおいて、多大な注意と細部へのこだわりが本当に必要になります。そして、それでもまだ問題が発生します。したがって、これは困難なアプリケーションですが、もしあなたの科学的な問題を研究するために必要であるならば、その点において非常に貴重な手法となります。しかし、ハードルの高いものです。ですので、熟練した経験者に依頼して進めてください。これが私のアドバイスです。非常に有用です。

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