Name: アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶアダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖法。毛細胞再生メカニズムを研究するための組織分離技術を習得し、脊椎動物の再生生物学理解に貢献します。

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この研究は米国立ヒトゲノム研究所、国立衛生研究所の学内研究プログラムによってサポートされていました。

パート1：組織の準備<ol><li>バッファリングされたMS - 222（3 - アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩、0.03％）と成人ゼブラフィッシュを安楽死させる。 </li><li>魚を刎ねる。 、下顎を切断し、最大腹側と解剖のパッドの上にヘッドを置き、虫ピンで組織を固定化する。頭蓋骨の腹側の軟部組織を削除し、解剖顕微鏡下で微細なピンセットで頭蓋骨のカプセルの腹側部分を開口割れ目。 </li><li> 4℃で一晩パラホルムアルデヒドで魚の頭（4％）を修正。 </li><li> 3回、5分ごとに時間（リン酸塩は1X、緩衝生理食塩水）をPBSで固定魚の頭をすすぎます。 </li></ol>パート2：内耳の総解剖<ol><li>腹側を上にして解剖パッドに魚の頭を置きます。昆虫のピンとそれを固定する。すべての次の手順は、解剖顕微鏡下で実施されています。 </li><li>細かいピンセットと、内耳を介して頭蓋骨の骨を削除してから、慎重に内耳組織を引き出す：saccules、lagenaの複数形、およびutricles。球形嚢およびつぼはしっかりとお互いに接続するため、卵形嚢（嚢およびつぼに前方）しながら一緒に引き出している、解剖中にもう一方の端の器官から切り離される可能性が非常に高くなります。 </li><li> PBS（1X）の内耳の組織を置く。これ以上の微細な解剖が必要ない場合は、PBS（1X）で組織を2〜3回リンスし、それが他の実験、例えば凍結切片に使用することができます。 </li></ol>パート3：内耳感覚上皮の微細解剖<ol><li>細かい解剖は、清浄なスライドガラス上にPBS（1X）のドロップで行うことができる。 </li><li>細かいピンセットの二組の卵形嚢から小嚢の耳石を外し、そして、必要に応じて、微細なピ​​ンセットと針の刃で上皮からの非感覚上皮組織と神経支配を切り落とす。 </li><li>可能な限りそのまま全体球形を保つことを試みる間、嚢状とlagenar上皮を分離する前にlagenar耳石を取り外します。腹側を上にしてPBSのドロップで組織を置きます。慎重に球形嚢およびつぼの間にカットして針の刃を使用してください。必要に応じて、過度の非感覚上皮組織と微細なピンセットと針の刃を持つinnvervationを切り落とす。 </li></ol>パート4：感覚上皮の有毛細胞の蛍光染色<ol><li> 3回、5分間ずつPBT（1XPBS、1％トリトンX - 100）と感覚上皮をすすいでください。 </li><li>と上皮をインキュベートfluophore標識ファロイジン（例えばAlexaの小麦粉488ファロイジン、1:1000希釈）を室温で30分間。 </li><li> 3回、10分間ずつPBTと感覚上皮をすすいでください。 </li><li>メディアのマウントをスライド上に上皮をマウントし、適切な波長のフィルターと蛍光顕微鏡下で染色した組織を確認してください。 </li><li>成功した解剖と染色後、強力な有毛細胞束の染色と無傷の上皮を顕微鏡（図1）の下で見ることができます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="図1" /> 図1。嚢状感覚上皮の有毛細胞は、アレクサ小麦粉488ファロイジン（緑色）で染色した。ペーパーで説明したように組織サンプルを切除し、染色された。いくつかの画像はサンプルの異なる位置で撮影し、Adobe Photoshop 7.0と共に並べて表示されました。 スケールバー=150μm。

このプロトコルでは、我々は、私たちは、感覚上皮の細胞と細胞内機能を研究するための組織サンプルを準備することができる大人のゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスと微細な解剖を説明した。 成功した解剖を行うために、非常に最初のステップは、固定では、非常に重要です。古いソリューションは、解剖時に扱うことが困難な組織の下で、固定につながるので、常に作りたてのパラホルムアルデヒド溶液を使用していることを確認します。しかし、それは郭清後の免疫/組織染色の結果に干渉するので、あなたが、長すぎるために固定のソリューションでそれらを残すことによって組織を過剰修正しないことを確認してください。さらに、適切なサイズになってよく維持解剖ツールを使用すると、特に細かい解剖については、同様に重要です。 この総解剖のプロトコルは、組織特異的なDNAを/ RNAの/タンパク質の抽出に内耳の組織を取得するために適応させることができます。その場合には、解剖はパラホルムアルデヒド固定せずに右の魚の犠牲の後に行ってください。さらに、特定のルーチンのメソッドは、ターゲ...

<table><tbody><tr><td>MS222 (3-アミノ安息香酸エチル メタンスルホン酸塩)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝生理食塩水, 10X)</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ファロイジン</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td><td>試薬</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>器具</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>器具</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>ニードルブレード</td><td>器具</td><td>Sharpoint</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>解剖マット</td><td>器具</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ</td><td>動物</td><td>各種</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

内耳の感覚神経上皮は、聴覚やバランス機能のための重要な構造です。有毛細胞（HCS）と支持細胞（SCS）：そのため、主に細胞の2つの型で構成された上皮の細胞および分子の機能を理解することが重要です。ここでは、上皮構造が高度に調査したすべての脊椎動物で保存されているので、大人のゼブラフィッシュではないだけに内耳感覚上皮を勉強するだけでなく、大人のゼブラフィッシュは、HCS、哺乳類は出生後まもなく失うことの能力を再生成することができるからです。我々は、HCの損失の結果として人間の聴覚/バランス赤字の臨床治療に役立つ可能性がある成人の脊椎動物の内耳HCの再生のメカニズムを研究するモデル系として成人ゼブラフィッシュの内耳を使用してください。 ここでは、成人のゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスと微細な解剖を行う方法を示します。総解剖は内耳の周囲の組織を取り除き、私たちは感覚上皮の詳細な構造を調べることができます組織切片を調製するのに便利です。細かい解剖では、個々の上皮の非感覚上皮組織をクリーンアップし、ホールマウント上皮サンプルで簡単に全体の上皮の不均一性を調べるために私達が可能になります。

大人のゼブラフィッシュの内耳感覚上皮は成人脊椎動物で有毛細胞の再生のメカニズムを理解するための良いモデルシステムです。このプロトコルは、我々は、細胞と細胞内レベルでの再生イベントを研究するための組織サンプルを取得できるような上皮の微細な解剖を、示しています。

内耳の神経感覚上皮は、聴覚および平衡機能における極めて重要な構造です。したがって、...を理解することは重要です。

ゼブラフィッシュの内耳には、囊状の末端器官が3対あり、それぞれ耳囊、サキュラー（saccule）、およびラグナ（lagena）と呼ばれています。耳囊は最も前方に位置し、サキュラーとラグナは互いに密接に付着しており、耳囊の後方に位置しています。粗い解剖の後、サキュラーとラグナは付着したままとなりますが、それに続く精緻な解剖により、各末端器官の中に耳石と呼ばれる石のような構造を容易に確認することができます。サキュラーとラグナは、腹側から切除することで分離されます。耳石を除去し、非感覚上皮組織を切り取り、3つの末端器官すべてから感覚上皮組織を回収します。こんにちは、国立ヒトゲノム研究センター（NHGRI）発生ゲノミクス部門のSean Burgess研究室のJean Leonです。今日は、成体ゼブラフィッシュから内耳感覚上皮を精細に摘出する手法をご紹介します。当研究室では、内耳感覚上皮における遺伝子発現を研究するためにこのプロセスを用いています。それでは始めていきましょう。解剖を開始するために、緩衝MS-220.03%で成ゼブラフィッシュを安楽死させます。魚の頭部を切り離し、次に下顎を切り取ってください。次に、頭部を腹側が上になるように解剖パッドの上に置き、解剖顕微鏡下で昆虫ピンを用いて組織を固定します。同じピンセットを用い、微小ピンセットで頭蓋骨腹側の軟組織を除去します。頭蓋カプセルの腹側部分を割り開きます。最後に、魚の頭部を4%パラホルムアルデヒドを含む1×PBSを入れた小型プラスチック容器に入れ、4°Cで一晩固定します。翌日、パラホルムアルデヒドは有害廃棄物と見なされるため、廃棄してください。使用済みのパラホルムアルデヒド溶液は、所属機関の実験室安全規定に従って処分し、固定した魚の頭部を1×PBSで5分間ずつ3回洗浄してください。魚の頭部の固定が完了したので、内耳の肉眼的解剖を開始します。まず、魚の頭部の腹側を上に向けた状態で解剖パッドの上に置きます。昆虫ピンで固定してください。ここからは、残りの作業を解剖顕微鏡下で行います。精密ピンセットを用いて、内耳上の頭蓋骨を除去し、内耳組織である卵形嚢、球囊、および半規管を注意深く取り出します。球囊と半規管は互いに強固に付着しているため一緒に取り出されますが、球囊より前方に位置する卵形嚢は、通常、解剖中に他の終末器官から分離します。最後に、粗解剖の後、内耳組織を1つのXPBSに入れます。次に、内耳感覚上皮の微細解剖に進みます。微細解剖は、清潔なガラススライド上の1滴のXPBS中で行います。2組の精密ピンセットを使用して、卵嚢石（U otolith）を耳嚢（utricle）から取り出します。精密ピンセットと針状のブレードを用いて、上皮部分から神経感覚上皮組織および神経支配を切り離します。互いに付着したままの嚢石（S）と（

gross-fine-dissection-inner-ear-sensory-epithelia-adult-zebrafish

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JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、成人のゼブラフィッシュから臓器を特定し、解剖するための手順を説明します。...

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

この記事では、1〜3日postfertilizationの胚から、接続されている網膜色素上皮がある場合とない場合のゼブラフィッシュ網膜を顕微解剖するアプローチを説明します。...

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

複数の発達段階におけるゼブラフィッシュの心臓の解剖と分離のための明確な、標準化された方法が説明されています。注釈と定量化の手法についても説明します。...

幼虫の心臓の解剖、少年と大人ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュ</em

このビデオの目的は、成人のゼブラフィッシュの内耳器官から健康な無傷の有毛細胞を取得した後、それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的としたパッチクランプ研究のためにそれらを使用するための手順を示すことである。...

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

このビデオでは、成体と幼虫のゼブラフィッシュのレンズを解剖して、皮質レンズの形態とレンズ縫合糸の構造的完全性を分析するために開発されたプロトコルについて説明しています。...

眼の水晶体解剖:ゼブラフィッシュの水晶体の形態を観察する技術

神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、我々は大人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができ、定量的側線再生アッセイを開発しました。アッセイは、1）感丘および2）個々の有毛細胞レベルでの解像度を含んだ。...

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

大規模2次元電子顕微鏡法(EM)、またはナノトミーは、ナノスケール分解能のEMの組織全体への応用です。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生の脳を健康に、および非侵襲的な脳損傷時に調査するために適用されるナノトミーの普遍的な方法について説明します。...

健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

ここでは、ゼブラフィッシュ稚魚から光誘発網膜電図反応の測定を簡素化するプロトコルを提案する.新規円錐状のスポンジ チップ電極は、ビジュアル開発の研究は、ゼブラフィッシュ稚魚網膜電図 ERG...

A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

レーザーアブレーションは、生物系の再生を研究するための広く応用できる技術です。提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ横線で神経間細胞を再生するレーザーアブレーションとその後のタイムラプスイメージングのための標準的なレーザー走査共焦点顕微鏡の使用を記述する。...

ゼブラフィッシュインターニューロマスト細胞における共焦点顕微鏡ベースレーザーアブレーションと再生アッセイ

成体ゼブラフィッシュの機械的脳損傷モデルを用いて、ゼブラフィッシュの高い再生能力を調節する分子機構を調べることが記載されている。この方法は、蛍光免疫染色を用いて再生応答を評価するために、複数の種の小魚の視蓋に刺創損傷を作り出すことを説明している。...

ゼブラフィッシュとメダカを用いた成体視神経筋の刺創損傷モデルによる再生能力の比較解析

この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。...

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

学ぶアダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖法。毛細胞再生メカニズムを研究するための組織分離技術を習得し、脊椎動物の再生生物学理解に貢献します。

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

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