Name: 共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 学ぶ共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ胚の脳の生きたイメージング法。単一細胞分解能で脊椎動物の脳発生を観察し、細胞形態変化のメカニズム解明に活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

第一Siveラボでこのテクニックを開発した博士ジェニファーGutzmanに感謝します。親切にコードするプラスミドCAAX - GFPのmRNAを提供Dana - Farber癌研究所ボストン、マサチューセッツ州でもJBグリーンのおかげで。共焦点イメージングは​​、ホワイトヘッドでWMケック財団生体イメージング施設で行われた。 HSはNIHMH70926によってサポートされています。 EGは、NSFの事前博士フェローシップでサポートされています。

1。インジェクションのmRNAの準備<ol><li>この手順で使用されているmRNAがコードするプラスミドCAAX - EGFP（memGFP）mRNAから転写される。最初Gutzmanら、2008によるとプラスミドを線形化する。 </li><li>その後mMessage mMachineキットを使用してmemGFP mRNAを転写。 </li><li> -801μg/μl、分注し、およびストアに得られたmRNAを希釈℃を</li><li>一つの細胞の段階で胚の幅は、レーンと1％アガロースの射出成形金型を準備します。 </li><li>注射の前日に、女性から男性を分離交尾ケージを設定します。 </li><li>注射の日に、注射の準備をマイクロピペットプラーを使用してキャピラリー針を引き抜きます。 </li></ol> 2。 mRNAを注入<ol><li>注射の日に、氷上に1μg/μlmemGFPのmRNAのアリコートを解凍。 </li><li> 200ng/μlの最終濃度に水でmRNAが1:5に希釈し、氷上に置きます。 </li><li> 200ng/μlで準備memGFPのmRNAの1μlのでキャピラリー針をロードする。 </li><li>ガソリンインジェクターに接続されているマイクロマニピュレータにロードされた針を置きます。 </li><li> 1nlに注入量を調整します。 </li><li>前日から交配のケージに設定野生型の魚で仕切りを引っ張る。 </li><li>とすぐにそれらが配置されるように胚を収集する。オリエントそれら離れてマイクロマニピュレータの側の単一細胞で胚の培地（ウェスター、1995）でカバーアガロースの射出成形金型インチ</li><li>絨毛膜とmRNAは単一のセルに直接堆積されるように、卵黄を介して注入する。実験ごとに約50の胚を注入する。セルが分割されている場合に注入しないでください。 </li><li> 28℃で一晩胚の培地でインキュベートする胚</li></ol> 3。マウントおよびイメージング胚<ol><li>胚をマウントし、イメージに、興味のある時点の前に実体顕微鏡一時間で胚から鉗子で絨毛膜を除去。 </li><li> 4胚まで取り付けるためのスライドを準備します。 <ul><li>直径約1cm穴を内蔵した特別設計の2ミリメートルの厚さのプラスチック製のスライドの下側にカバースリップを密封するために、シリコーン真空グリースを使用してください。 </li><li> 0.7％アガロースでスライドの穴を埋める、と約20分または硬化するまで放置</li><li>アガロースが固化した後、それぞれの胚をマウントするに円筒状の穴を形成するために、200μlのピペットチップを使用して、小さなプラグを取り外します。 </li></ul></li><li>解剖顕微鏡下でアガロースを充填したスライド上に胚を置きます。胚を麻酔tricaine50μlの（ウェスター、1995）を追加します。 </li><li>基本的なカバースリップに対する脳や関心領域とアガロースの円筒形の穴に胚を配置するために鉗子を使用してください。 </li><li>シリコン真空グリースで保護された別のカバースリップとアガロースの胚をカバーする。 </li><li>反転、蛍光灯、レーザー走査型または回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて画像胚を。神経上皮内の単一セルの高解像度の画像を収集するために63x以上で画像。 </li><li>画像は、LSMソフトウェアからのTIFFファイルとしてエクスポートし、Photoshopを使用して分析している。 </li></ol> 4。代表的な結果/成果図1に示すように、中脳と後脳の心室の間に24 HPFのゼブラフィッシュの神経上皮の代表的な共焦点画像です。各セルは、膜結合型GFPで標識されている。 <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> 図1。 memGFP注入24 HPFのゼブラフィッシュ胚の共焦点イメージングを生きる。 GFPによる概説、各セルで24 HPFの胚の（A）神経上皮。地域撮像さは中脳後脳境界を形成し、中脳と後脳の脳室（M、Hはそれぞれ）を分離。

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

このビデオでは、我々は単一細胞のゼブラフィッシュの胚へのmRNAの注入のための方法を示しています。ここでは、各セルにラベルを付けるために細胞膜をターゲットとしたGFPをコードするmRNAを使用してください。我々は、単一セルの分解能で脳の発達をマウントし、イメージする方法を示しています。このテクニックは、私たちは中脳後脳境界（Gutzmanら、2008）の形成に必要な細胞の形状変化、基底くびれ、新しいタイプを検討することができました。他の現象の同様の分析が大幅に脊椎動物の形態形成と基礎細胞生物学の我々の理解を拡大する可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>SeaKem GTG アガロース</td><td >試薬</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ安息香酸エチル (Tricaine)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ</td><td>器具</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm</td></tr><tr><td>シリコン真空グリス</td><td>試薬</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;l ピペットチップ</td><td>器具</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>これらは 24 hpf の胚に適したサイズである。</td></tr><tr><td>mMessage mMachine 転写キット</td><td>試薬</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>SP6 RNA ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 走査型共焦点顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>器具</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>器具</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>器具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

このビデオでは、我々の研究室が開発してゼブラフィッシュの脳（Gutzmanら、2008）曲げると折るために必要な細胞の形状の変更と再配置を分析するために開発した方法を示しています。このような分析は、脊椎動物の脳の三次元構造の開発に必要な基本的な細胞生物学の新たな理解物を得る、と大幅に神経管の形態形成を研究する我々の能力を向上させます。胚ゼブラフィッシュの脳は、神経上皮が膨らま内の心室として、18時間後に受精（HPF）で始まる形をしている。 24 HPFによって、神経管の形態形成の最初のステップは完了です。方法ここで説明を使用して、1細胞段階における胚をコードするmRNAの細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質（memGFP）を注入されています。注射やインキュベーション、胚、現在18〜24 HPF後、アガロースで、反転、マウントされ、共焦点顕微鏡で撮像。特に、ゼブラフィッシュの胚は、その蛍光イメージングのための理想的なシステムとなって透過的です。我々の分析は、中脳後脳境界と後脳に焦点を当てているが、この方法は80〜100μmの深さにゼブラフィッシュで任意の領域の分析のために拡張することができる。

このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。

このビデオでは、...を曲げ、折り畳むために必要な細胞形態の変化と再編成を解析するために、当研究室で開発した手法を実演します。

この手順は、単細胞期のゼブラフィッシュ胚をインジェクションモールドに配置し、細胞が注入装置とは反対方向を向くようにセットして注入することから始まります。次に、針を卵黄経由で細胞内へと進め、mRNAを注入します。翌日、プラスチック製のマウントスライドにarosを満たします。次に、麻酔をかけた胚をarosの穴の中に倒立させて配置し、共焦点顕微鏡で撮影します。こんにちは、ホワイトヘッド生物医学研究センターおよびMIT生物学部にあるHazel Sieve博士の研究室のGrabhamです。本日は、ゼブラフィッシュ胚の1細胞期における注射の手順と、それに続く共焦点顕微鏡を用いた脳のライブイメージングについて解説します。当研究室では、この手法を用いて、単一細胞の解像度で脊椎動物の脳形態形成を研究しています。それでは始めていきましょう。本手順で使用するmRNAは、膜結合型GFPをコードするプラスミドから転写されます。まず、制限酵素を用いてプラスミドを直線化し、次いでM message mRNA kitを用いて直線化プラスミドから膜結合型GFP mRNAを転写します。mRNAの転写後、得られたmRNAを定量し、水で1 µg/µLに希釈して、使用時まで-80 °Cで保存します。注入の前日に交配ケージを準備し、注入当日にオスとメスを分離します。注入用の毛細管針の作製には、Setter instrument社のマイクロピペットプラーを使用してください。1%AGAローズを用いて、注射当日の1細胞期胚の幅に合わせたレーンを持つ注射用モールドを準備し、濃度1 µg/µLのメンブレンGFP mRNA分注液を氷上で解凍する。このmRNAを水で1対5に希釈して最終濃度200 ng/µLにし、氷上で保持する。準備した200 ng/µLのメンブレンGFP mRNAを1 µL、キャピラリーニードルにロードする。ここで、注入時に視認できるように、mRNAに0.05%フェノールレッドを加えます。充填済みの針を、ガス駆動式マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターにセットします。注入量を1ナノリットルに調整してください。次に、前日に交配ケージにセットした野生型魚の仕切りを取り除きます。胚が産み付けられたらすぐに回収してください。AGAローズ注入型に胚培地を満たし、マイクロマニピュレーターから遠い側の面に1細胞期がくるように胚を型内で向きを揃えます。mRNAが単一細胞に直接導入されるように、絨毛膜と卵黄を通して注入します。1回の実験につき約50個の胚に注入してください。ただし、細胞が分裂している場合は注入しないでください。胚への注入後、胚培地を用いて28°Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、注入した胚はマウントおよびイメージングが可能な状態になります。この手順を開始

live-imaging-of-the-zebrafish-embryonic-brain-by-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。...

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

初期胚を形成する形態形成のプロセスを理解するための鍵は、高解像度での画像セルにできることです。ここでは、細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質で全体のゼブラフィッシュの胚では細胞の単一細胞または小さなクラスターを標識するためのテクニックを説明します。...

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

現在のビデオは、開発ゼブラフィッシュの脳内の個々の神経前駆細胞のライブイメージングを実行するためのエレクトロポレーション、共焦点顕微鏡の組み合わせを活用する方法を示しています。...

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。...

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

&gt;jove_content&lt;細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin...

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

インビボイメージングは、神経系の発達の根底にある細胞メカニズムを調査するために使用できる強力なツールです。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムに可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いる手法について説明する。...

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。...

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

ここでは、3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ仔魚の in vivo...

インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

私たちは、高速走査型共焦点顕微鏡法を利用して、発生中のゼブラフィッシュの視蓋でミクログリア細胞のライブイメージングを行い、これらの細胞のin...

ゼブラフィッシュ胚におけるミクログリア動態のライブイメージングとキャラクタリゼーション

ここでは、共焦点顕微鏡を用いて、GCaMPカルシウム指標を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの脳領域における神経活動を調べるための詳細なプロトコルを紹介します。...

インビボ 部分的に拘束されたゼブラフィッシュ幼魚における感覚刺激により誘発される神経活動の共焦点蛍光イメージング

学ぶ共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ胚の脳の生きたイメージング法。単一細胞分解能で脊椎動物の脳発生を観察し、細胞形態変化のメカニズム解明に活用できます。

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

さらに動画を探す