共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる
April 1st, 2009
このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。
この処置は、単細胞ゼブラフィッシュ胚を注入型に注入し、細胞が注射装置から反対側を向くように配置することから始まります。その後、胚にMRNAを注射し、針は卵黄を通って細胞内に入ります。翌日。
プラスチック製の取り付けスライドにはアロスが詰められています。麻酔された胚は、共焦点顕微鏡で画像化された無性胸部の穴に逆さまに置かれます。こんにちは、私はMITのホワイトヘッド生物医学研究所のヘイゼル・シーブ博士の研究室、そしてMITの生物学部のグラバムです。
本日は、ゼブラフィッシュ胚を単細胞段階で注入し、その後共焦点顕微鏡による脳のライブイメージングを行う手順をお見せします。私たちの研究室では、この手法を使って脊椎動物の脳形態形成を単一細胞分解能で研究しています。では、始めましょう。
この手順で用いられるmRNAは、C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A膜結合GFPをコードするプラスミドから転写されます。まずプラスミドを一つでなく分解して線形化し、その後mRNA転写後にMメッセージとマシンキットを使って線形化されたプラスミドから膜GFP mRNAを転写し、得られたmRNAと水を1マイクログラム/マイクロリットルに希釈します。 エロクアで、必要に応じてマイナス80度で保存してください。注射前日には交尾ケージを設置し、注射当日にオスとメスを分けます。セッター機器のマイクロピペットポーラーを使って、毛細管針を抽出して注射してください。
注射当日に胚の1細胞期で胚の幅と同じレーンを持つ1%AGAロズの射出型を準備し、氷上で1マイクログラム/マイクロリットル濃度の膜GFP mRNAを解凍します。mRNAを水で1〜5回希釈し、最終濃度200ナノグラム/マイクロリットルにし、氷で保管します。毛細管針に準備された膜1マイクロリットルのGFP mRNAを200ナノグラム/マイクロリットルで注入します。
ここでは、注射時に見えるようにmRNAに0.05%フェノールレッドを加えます。装填された針をガス駆動のマイクロインジェクターに接続したマイクロマニピュレーターに挿入します。注入量を1ナノリットルに調整してください。
次に、前日に交尾ケージに入った野生タイプの魚の仕切りを引っ張ります。胚は産み終わったらすぐに採取してください。AGAローズの射出成形に胚培地を満たし、マイクロマニピュレーターから離れた側に単一の細胞を配置して胚を型内に配置します。
コリオンと卵黄を通して注入し、mRNAを直接単一細胞に沈着させます。1回の実験で約50個の胚を注入してください。ただし、細胞が分裂した場合は、胚を注入した後に注射せず、胚培地で28度の環境で一晩培養してください。
一晩の培養後、注入された胚はマウントと画像撮影の準備が整います。この処置を始めるには、対象の時刻の1時間前に立体顕微鏡の下で鉗子を使って胚からコリオンを取り出し、最大4個の胚をマウントするためのスライドを準備します。その後、スライドの上部あたりに0.7%のアロスを注ぎ、約20分、またはアロスが固まるまで待ちます。
無骨が固まったら、200マイクロリットルのピペットチップを使ってエアロスに小さな穴を開け、円筒形の穴を開けて各胚を取り付けます。装着前に鉗子でアロスプラグを外してください。胚をエアロ充填スライドの上に解剖顕微鏡で置きます。
麻酔のためにトリカを50マイクロリットル追加してください。胚だ。鉗子を使って、無肋骨の円筒形の穴に逆さまにした胚を、脳や関心のある部位をカバーカバーの下側に押し付けます。
AGA内の胚は、別のカバースリップでシリコーン真空グリースで固定されて浮上しました。胚はこれで画像検査の準備が整っています。ここに示す逆蛍光レーザー走査型共焦点顕微鏡、または63倍以上の回転円盤共焦点顕微鏡画像を用いて胚を画像化し、神経上皮内の単一細胞の高解像度画像を取得します。
画像はLSMソフトウェアからTIFファイルとしてエクスポートされ、Photoshopで解析されます。これは24時間経過したゼブラフィッシュ胚の代表的な共焦点画像であり、中脳と後脳の間の神経上皮です。Mは中脳、心室、Hは後脳室を示します。
各細胞には膜結合型GFPEが標識されています。私たちは、発生中のゼブラフィッシュ脳を単一細胞分解能として解析できる技術を実演しました。この技術により、BA基底収縮と呼ばれる新しい細胞形状変化の研究が可能となりました。
また、他の現象の解析や、椎骨の有機形成やその基礎となる細胞生物学の理解を大幅に深めることも可能です。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験のご成功をお祈りします。
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概要
このビデオは、共焦点顕微鏡を用いて、生きているゼブラフィッシュ胚の脊椎動物脳の発達を単一細胞解像度で分析する方法を示しています。このプロセスには、ゼブラフィッシュ胚への注射と、その後の発達中の脳の固定とイメージングが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- イメージング技術
背景
- ゼブラフィッシュは脊椎動物の発生を研究するためのモデル生物です。
- 共焦点顕微鏡は生きた組織の高解像度イメージングを可能にします。
- 単一細胞分析は細胞の発達と分化に関する洞察を提供します。
- この方法は発生生物学の様々な研究に適用できます。
研究の目的
- ゼブラフィッシュ胚の発達中の脳を視覚化する。
- 単一細胞解像度のイメージング技術を示す。
- 脊椎動物脳の発達に関する理解を深める。
使用された方法
- 単一細胞のゼブラフィッシュ胚へのmRNAの注射。
- イメージング用のプラスチック製マウンティングスライドの使用。
- 高解像度イメージング用の共焦点顕微鏡。
- 最適な向きのために注射モールドでの胚の位置決め。
主要な結果
- ゼブラフィッシュ胚へのmRNAの注射に成功。
- 発達中の脳の高解像度イメージが得られた。
- 生きたイメージング技術の実現可能性のデモンストレーション。
- 初期の発達における細胞挙動への洞察。
結論
- この方法により、ゼブラフィッシュの脳の発達を詳細に観察することができます。
- 共焦点顕微鏡を用いて単一細胞解像度のイメージングが可能です。
- この技術は発達神経科学のさらなる研究に利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Live imaging of the zebrafish embryonic brain enables high-resolution visualization of cellular dynamics during neural tube morphogenesis, providing a disease-relevant system for studying vertebrate brain development. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by allowing direct observation of cell shape changes and rearrangements critical to organogenesis. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking subcellular behaviors to structural outcomes in a transparent, genetically tractable system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of membrane-bound protein dynamics in developing neuroepithelium.
- Operational Value: Supports biological de-risking by linking cytoskeletal mechanisms to tissue-level morphogenetic events.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline morphogenetic benchmarks.
- Operational Value: Promotes assay standardization through reproducible embryo mounting and inversion protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system alignment by capturing conserved mechanisms of vertebrate brain folding applicable to human neural tube defects.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment through quantifiable readouts of cell shape changes such as basal constriction.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing single-cell resolution data that informs target confidence prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time observation of cell behaviors in intact tissues.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized production of fluorescently labeled embryos suitable for time-lapse analysis.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity and spatial tracking of GFP-labeled membranes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved morphogenetic processes across vertebrate species.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurodevelopmental screening due to embryo transparency and external development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in brain morphogenesis pathways.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized injection volumes, mounting orientation, and imaging parameters.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by enabling early detection of phenotypic anomalies in developing tissues.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by linking cellular phenotypes to structural outcomes in a high-fidelity model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques and embryonic staging.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure with 63x or higher objective capabilities.
- Necessitates standardization across teams for embryo handling, anesthesia timing, and mounting consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to other brain regions or developmental stages beyond 18–24 hpf.
- Limited by imaging depth of 80–100 μm, restricting analysis of deeper brain structures.
