S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

この手順は、SLACコントロール株の正常アミノ酸と重同位体リジンおよびアルギニンを含む培地で餌株を培養することから始まります。両菌株の等量を粉砕し、液体窒素原油溶解物によって混合および溶解し、最初に遠心分離機でペレット化し、次いでスフェロビーズに結合することによって清澄化する。その後、細胞ライセートをIgGビーズに結合します。

IgGビーズに結合したタンパク質は、プロテアーゼによってほのめかされ、切断され、沈殿します。これで、サンプルを質量分析法で分析する準備が整いました。こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学生命科学研究所細胞環境生物学科のローンラボのジェシー・チャオです。

今日は、シラックと呼ばれる定量的プロテオミクス分析の手順をご紹介します。アフィニティー精製との組み合わせ。私たちの研究室では、この手順を使用してタンパク質複合体を研究しています。

それでは始めましょう この手順では、餌株には正常なアミノ酸が含まれ、SLAC制御株には重同位体、リジン、アルギニンが含まれています。開始するには、まず、餌の株と制御株のそれぞれを、画面に表示されている値まで別々に1リットル成長させます。次に、培養液を 500 mL の Nalgene 遠心チューブに注ぎます。

ペレットセルの負荷を2, 580 RCFでバランスを取り、培地をデカントし、ペレットを再懸濁します。細胞を50ミリリットルに移しながら、50ミリリットルの冷たいD H2Oを使用して、チューブを遠心分離し、3000 RCFで細胞をペレット化します。この時点で、ペレットを摂氏マイナス80度で凍結できます。

コントロール株培養物と餌株培養物を乾燥ペレット重量で1対1で一致させることを覚えておくことが重要である。各細胞ペレットを10ミリリットルのNP 40緩衝液に再懸濁し、1〜2000のプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えます。2つの細胞培養物を混合するには、一方のチューブを他方のチューブに直接デカントします。

最初に細胞の粉砕を開始するには、事前に冷却したモルタルに液体窒素を注ぎ、完全に蒸発させます。次に、2ミリリットルのセルを乳鉢に加えます。液体窒素を注ぎ、細胞を凍結します。

細胞が細かくなるまで細胞を粉砕します。粉。すべてのセルが粉砕されるまで、このプロセスを繰り返します。細胞を解凍しないように注意してください。

必要に応じて液体窒素を追加します。次に、粉末を氷冷ビーカーに移し、室温で解凍します。エッジが融解し始めたら、融解後に20ミリリットルのNP40バッファーを1〜200PICで追加します。

粗溶解物を40ミリリットルのNalgeneチューブに移し、Sovos SA 600ローターで16, 000 RPMで30分間回転させます。待っている間に、SROの2つのBビーズの300マイクロリットルを取り、NP40バッファーの300マイクロリットルでビーズを3回洗浄します。次に、ビーズを300マイクロリットルのバッファーに再懸濁して、ビーズが1対1のスラリーになるようにします。

次のステップは、細胞ライセートを事前にクリアすることです。これを行うには、最初にスーパーナチンを新しいチューブに移し、Spherosに2つのBビーズを追加します。冷蔵室の回転プラットホームで30分間インキュベートします。

インキュベート中に、300マイクロリットルのIgG SRO6個のビーズを取り、300マイクロリットルのNP40バッファーでビーズを3回洗浄します。次に、ビーズを300マイクロリットルのバッファーに再懸濁して、1対1のスラリーにします。インキュベーション後、SROをペレット化します。

2つはビーズです。上清を新しいチューブに移します。細胞ライセートのアリコートは、後でウェスタンブロッティングのために保存しておくことを忘れないでください。

次に、IgGビーズを追加します。内容物を2本のチューブに分離してより効率的に結合し、冷蔵室の回転プラットホームで2時間インキュベートします。インキュベーション後、ビーズを4°Cのクロマトグラフィーカラムに集めます。

拘束されていない派閥のアリコートを必ず保存してください。ビーズを10ミリリットルで洗います。NP 40バッファー。

次に、ビーズを3ミリリットルで洗います。TEVC バッファー。繰り返しになりますが、ビーズのアリコートを保存することを忘れないでください。

これは、ビーズを溶出するための結合の効率を反映しています。まず、1ミリリットルのTEVCバッファーに5マイクロリットルのA-C-T-E-Vを追加します。ビーズにTAGECバッファーを加えて混合します。

より効率的な混合から内容物を2本の1.5ミリリットルEINORチューブに移し、冷蔵室の回転プラットフォームで一晩インキュベートします。次に、ビーズをスピンダウンし、溶出液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。洗浄後、ビーズを追加の0.5ミリリットルのTEVCバッファーで洗浄します。

8つを1つのチューブに組み合わせます。合計で1.5ミリリットルのELU8が必要です。TEV Elu 8のアリコートを保存して沈殿させます。

アリコートを 25% TCA に調整し、TCA を 100% にします。これを行うには、1.5 ミリリットルの LU 8 をそれぞれ 750 マイクロリットルの 2 つのチューブに分離します。チューブに250マイクロリットルの100%TCAを追加します。

あなたの解決策は乳白色に変わるはずです。次に、氷の上に30分間置きます。インキュベーション後に混合物を定期的にボルテックスします。

冷蔵室の卓上遠心分離機で最高速度で30分間回転します。0.05の通常の塩酸を含む500マイクロリットルの氷冷アセトンで1回洗ってください。その後、最高速度4°Cで5分間回転します。

次に、500マイクロリットルの氷冷、アセトンで一度洗い、摂氏4度で最高速度で5分間回転させます。紡糸後、アセトンと乾燥ペレットを慎重に取り除き、銀染色を行います。SDSサンプルバッファーの1倍の50マイクロリットルにペレットを再懸濁します。

沈殿したタンパク質を質量分析ベースの分析に使用する予定がある場合は、エタノールを使用して沈殿することをお勧めします。これを行うには、まず、20マイクログラムのグリコーゲンを添加し、次に100%エタノールでサンプルを5回希釈し、pH 5.0で2.5モルのストックで50ミリモルの重炭酸ナトリウムに調整します。チューブを反転させて溶液を混合します。

室温で2時間放置します。最後に、内容物を2つのアイノールチューブに分割します。沈殿したタンパク質を遠心分離により10分間、室温で12, 000GSでペレット

精製手順中に保存されたアリコートには、事前にクリアされた細胞溶解物、結合画分、非結合画分、および逃れた画分を含める必要があります。上記のアリコートのタンパク質含有量は、Antit TAP抗体を用いたウェスタンブロッティングまたは銀染色により解析し、実験の結合効率と溶出効率を反映することをお勧めします。この銀染色ゲルで精製されたSCSでは、相互作用で2タップ、パートナーを視覚化し、このウェスタンブロットのタグなしコントロールと比較しました。

SCSの2タップの精製中に採取した種々のファクションを、Antitタップ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析しました。SCS 2タップは、TEVプロテアーゼ切断によりelucian後に低分子量で移動し、溶出後にIgGビーズにS SCS 2タップが残っていなかったことに注目してください。これにより、精製効率が高いことが確認されました。

IgGビーズによるアフィニティー精製によりタンパク質複合体を精製する方法をお見せしました。この手順を実行するときは、精製手順を開始する前に、基本ひずみと制御ひずみを乾燥ペレ重量で一致させることを確認することを忘れないでください。LACは、タンパク質結合パートナーのアンバイアス測定とキュード測定を提供してくれるため、サンプルの損失を最小限に抑えるために、タップ精製の第1段階のみを実施します。

特異的な結合が大量に発生する場合は、コールドスプリングハーバーのマニュアルに記載されているプロトコル全体を実行することをお勧めします。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

おい、さあ、マーク。ああ、行く。