S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定
March 4th, 2009
ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。
この手順は、SLACコントロール株の正常アミノ酸と重同位体リジンおよびアルギニンを含む培地で餌株を培養することから始まります。両菌株の等量を粉砕し、液体窒素原油溶解物によって混合および溶解し、最初に遠心分離機でペレット化し、次いでスフェロビーズに結合することによって清澄化する。その後、細胞ライセートをIgGビーズに結合します。
IgGビーズに結合したタンパク質は、プロテアーゼによってほのめかされ、切断され、沈殿します。これで、サンプルを質量分析法で分析する準備が整いました。こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学生命科学研究所細胞環境生物学科のローンラボのジェシー・チャオです。
今日は、シラックと呼ばれる定量的プロテオミクス分析の手順をご紹介します。アフィニティー精製との組み合わせ。私たちの研究室では、この手順を使用してタンパク質複合体を研究しています。
それでは始めましょう この手順では、餌株には正常なアミノ酸が含まれ、SLAC制御株には重同位体、リジン、アルギニンが含まれています。開始するには、まず、餌の株と制御株のそれぞれを、画面に表示されている値まで別々に1リットル成長させます。次に、培養液を 500 mL の Nalgene 遠心チューブに注ぎます。
ペレットセルの負荷を2, 580 RCFでバランスを取り、培地をデカントし、ペレットを再懸濁します。細胞を50ミリリットルに移しながら、50ミリリットルの冷たいD H2Oを使用して、チューブを遠心分離し、3000 RCFで細胞をペレット化します。この時点で、ペレットを摂氏マイナス80度で凍結できます。
コントロール株培養物と餌株培養物を乾燥ペレット重量で1対1で一致させることを覚えておくことが重要である。各細胞ペレットを10ミリリットルのNP 40緩衝液に再懸濁し、1〜2000のプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えます。2つの細胞培養物を混合するには、一方のチューブを他方のチューブに直接デカントします。
最初に細胞の粉砕を開始するには、事前に冷却したモルタルに液体窒素を注ぎ、完全に蒸発させます。次に、2ミリリットルのセルを乳鉢に加えます。液体窒素を注ぎ、細胞を凍結します。
細胞が細かくなるまで細胞を粉砕します。粉。すべてのセルが粉砕されるまで、このプロセスを繰り返します。細胞を解凍しないように注意してください。
必要に応じて液体窒素を追加します。次に、粉末を氷冷ビーカーに移し、室温で解凍します。エッジが融解し始めたら、融解後に20ミリリットルのNP40バッファーを1〜200PICで追加します。
粗溶解物を40ミリリットルのNalgeneチューブに移し、Sovos SA 600ローターで16, 000 RPMで30分間回転させます。待っている間に、SROの2つのBビーズの300マイクロリットルを取り、NP40バッファーの300マイクロリットルでビーズを3回洗浄します。次に、ビーズを300マイクロリットルのバッファーに再懸濁して、ビーズが1対1のスラリーになるようにします。
次のステップは、細胞ライセートを事前にクリアすることです。これを行うには、最初にスーパーナチンを新しいチューブに移し、Spherosに2つのBビーズを追加します。冷蔵室の回転プラットホームで30分間インキュベートします。
インキュベート中に、300マイクロリットルのIgG SRO6個のビーズを取り、300マイクロリットルのNP40バッファーでビーズを3回洗浄します。次に、ビーズを300マイクロリットルのバッファーに再懸濁して、1対1のスラリーにします。インキュベーション後、SROをペレット化します。
2つはビーズです。上清を新しいチューブに移します。細胞ライセートのアリコートは、後でウェスタンブロッティングのために保存しておくことを忘れないでください。
次に、IgGビーズを追加します。内容物を2本のチューブに分離してより効率的に結合し、冷蔵室の回転プラットホームで2時間インキュベートします。インキュベーション後、ビーズを4°Cのクロマトグラフィーカラムに集めます。
拘束されていない派閥のアリコートを必ず保存してください。ビーズを10ミリリットルで洗います。NP 40バッファー。
次に、ビーズを3ミリリットルで洗います。TEVC バッファー。繰り返しになりますが、ビーズのアリコートを保存することを忘れないでください。
これは、ビーズを溶出するための結合の効率を反映しています。まず、1ミリリットルのTEVCバッファーに5マイクロリットルのA-C-T-E-Vを追加します。ビーズにTAGECバッファーを加えて混合します。
より効率的な混合から内容物を2本の1.5ミリリットルEINORチューブに移し、冷蔵室の回転プラットフォームで一晩インキュベートします。次に、ビーズをスピンダウンし、溶出液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。洗浄後、ビーズを追加の0.5ミリリットルのTEVCバッファーで洗浄します。
8つを1つのチューブに組み合わせます。合計で1.5ミリリットルのELU8が必要です。TEV Elu 8のアリコートを保存して沈殿させます。
アリコートを 25% TCA に調整し、TCA を 100% にします。これを行うには、1.5 ミリリットルの LU 8 をそれぞれ 750 マイクロリットルの 2 つのチューブに分離します。チューブに250マイクロリットルの100%TCAを追加します。
あなたの解決策は乳白色に変わるはずです。次に、氷の上に30分間置きます。インキュベーション後に混合物を定期的にボルテックスします。
冷蔵室の卓上遠心分離機で最高速度で30分間回転します。0.05の通常の塩酸を含む500マイクロリットルの氷冷アセトンで1回洗ってください。その後、最高速度4°Cで5分間回転します。
次に、500マイクロリットルの氷冷、アセトンで一度洗い、摂氏4度で最高速度で5分間回転させます。紡糸後、アセトンと乾燥ペレットを慎重に取り除き、銀染色を行います。SDSサンプルバッファーの1倍の50マイクロリットルにペレットを再懸濁します。
沈殿したタンパク質を質量分析ベースの分析に使用する予定がある場合は、エタノールを使用して沈殿することをお勧めします。これを行うには、まず、20マイクログラムのグリコーゲンを添加し、次に100%エタノールでサンプルを5回希釈し、pH 5.0で2.5モルのストックで50ミリモルの重炭酸ナトリウムに調整します。チューブを反転させて溶液を混合します。
室温で2時間放置します。最後に、内容物を2つのアイノールチューブに分割します。沈殿したタンパク質を遠心分離により10分間、室温で12, 000GSでペレット
化します。精製手順中に保存されたアリコートには、事前にクリアされた細胞溶解物、結合画分、非結合画分、および逃れた画分を含める必要があります。上記のアリコートのタンパク質含有量は、Antit TAP抗体を用いたウェスタンブロッティングまたは銀染色により解析し、実験の結合効率と溶出効率を反映することをお勧めします。この銀染色ゲルで精製されたSCSでは、相互作用で2タップ、パートナーを視覚化し、このウェスタンブロットのタグなしコントロールと比較しました。
SCSの2タップの精製中に採取した種々のファクションを、Antitタップ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析しました。SCS 2タップは、TEVプロテアーゼ切断によりelucian後に低分子量で移動し、溶出後にIgGビーズにS SCS 2タップが残っていなかったことに注目してください。これにより、精製効率が高いことが確認されました。
IgGビーズによるアフィニティー精製によりタンパク質複合体を精製する方法をお見せしました。この手順を実行するときは、精製手順を開始する前に、基本ひずみと制御ひずみを乾燥ペレ重量で一致させることを確認することを忘れないでください。LACは、タンパク質結合パートナーのアンバイアス測定とキュード測定を提供してくれるため、サンプルの損失を最小限に抑えるために、タップ精製の第1段階のみを実施します。
非特異的な結合が大量に発生する場合は、コールドスプリングハーバーのマニュアルに記載されているプロトコル全体を実行することをお勧めします。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
おい、さあ、マーク。ああ、行く。
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概要
この記事では、Saccharomyces cerevisiaeにおけるタンパク質複合体を同定するための定量的プロテオミクス技術を紹介します。この研究では、SILAC法とアフィニティ精製、タンデム質量分析を組み合わせて、ERタンパク質Scs2pの結合パートナーを特定します。
研究の主要構成要素
科学の分野
- プロテオミクス
- 細胞生物学
- 質量分析
背景
- タンパク質相互作用を理解することは細胞機能の解明に不可欠です。
- SILAC（細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識）は定量的プロテオミクスの強力な方法です。
- アフィニティ精製技術はタンパク質複合体の同定の特異性を高めます。
- タンデム質量分析によりタンパク質相互作用の詳細な分析が可能になります。
研究の目的
- 酵母におけるタンパク質複合体を同定する堅牢な方法を開発すること。
- ERタンパク質Scs2pの結合パートナーを調査すること。
- プロテオミクス分析の特異性と感度を向上させること。
使用した方法
- 通常および重同位体アミノ酸を含む培地でベイト株を培養すること。
- 株を混合し、粗抽出物を取得するために裂解すること。
- スフェロスビーズを使用して溶出液をクリアし、IgGビーズに結合させること。
- 質量分析のためのIgGビーズからタンパク質を溶出させること。
主な結果
- Scs2p結合パートナーの成功的な同定。
- プロテオミクスにおけるSILAC法の有効性の実証。
- タンパク質複合体同定における高い特異性の達成。
- 細胞プロセスにおけるScs2pの役割に関する洞察。
結論
- 開発した技術は、酵母におけるタンパク質相互作用の理解を深めます。
- 結果は、より広範なプロテオミクスと細胞生物学の分野に貢献します。
- 将来の応用は他の生物やタンパク質複合体にまで拡張される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative proteomics enables unbiased identification of protein interaction networks, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By distinguishing specific binding partners from contaminants through isotopic labeling, the method enhances predictive confidence in protein complex analysis. This approach addresses a key challenge in studying membrane contact sites and lipid trafficking mechanisms relevant to cellular signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping protein-protein interactions at ER-PM membrane contact sites.
- Operational Value: Reduces false positives through SILAC-based quantification, improving target validation reliability.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying the molecular composition of lipid trafficking complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining the protein composition of ER-PM MCSs.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative interaction data suitable for assay standardization and scalability.
- Scientific Value: Facilitates preparation of disease-relevant models by identifying conserved eukaryotic proteins involved in lipid signaling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into lipid trafficking and signaling, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through reproducible complex identification across experimental replicates.
- Scientific Value: Supports preclinical model development by defining conserved protein complexes in yeast applicable to higher eukaryotes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing quantitative interaction data that informs target prioritization and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying Scs2p interaction partners in lipid trafficking networks.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein interaction profiles with quantitative readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Enables condition comparison through SILAC-based quantification, allowing teams to distinguish specific binding from background noise.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by identifying conserved eukaryotic proteins involved in membrane contact site function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomics platform for studying protein complexes across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized SILAC labeling and affinity purification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative interaction data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction network confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative proteomics, mass spectrometry, and yeast culture techniques.
- Depends on instrumentation for SILAC labeling, affinity purification, and high-resolution LC-MS/MS analysis.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency, lysis protocols, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-yeast model systems or alternative lysis conditions.
- Includes practical limitations related to the dynamic range of detection and the need for high-abundance bait expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:45
Introduction
1:17
Preparation of the Bait and SILAC Control Strain
2:44
Grinding of Cells
4:05
Pre-clearing Cell Lysate
5:51
Eluting From IgG Beads by TEV Protease Cleavage
6:45
Trichloroacetic Acid (TCA) Precipitation
9:00
Sample Analysis by Western Blotting and/ or Silver Staining
8:11
EtOH/ Acetate Precipitation
9:30
Representative Results/ Outcome
10:15
Conclusion
