Name: 焦点のCa 2 +過渡検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: 学ぶ平滑筋のカルシウムイメージング法。マウス膀胱摘出組織を用いて、神経伝達物質の効果を高解像度で解析するプロトコルを解説。共焦点顕微鏡による詳細なシグナル検出手法を紹介します。

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ウェルカムトラストは、財政支援を（JSYとKLBに074128研究フェローシップにVIP賞）を提供。医学研究評議会RJAの学生の身分 Leica_SP2_Stacker、シリーズに&quot;再建&quot;のためにTIFFをインポートするために使用されるアルゴリズムは、トニーコリンズによって開発され、彼の許可を得て使用、ImageJのにライカSP2 TIFFを読み込むためのプラグインは、Leica_tiff_sequenceに基づいています。 （ <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ）StackRegとTurboReg、組織の動きを補正するために使用されるアルゴリズムは、のTh venazら（1998）9に基づいています。 Excel_writer.jarはクルトデボス（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html）によって書かれました。 JNCT0.08JoVE.ijm、粒子の検出アルゴリズムは、KLの脳と詳細以前に5で書かれたアルゴリズムに基づいています。

パート1：のCa 2 +インジケーター（AMオレゴングリーン488 BAPTA - 1）の調製<ol><li>オレゴングリーン488 BAPTA - 1は、AM粉の少量（50μg）をとして500μlのバイアルで提供されます。粉体へのF - 127ソリューション、30秒間静かに揺れ40μlのプルロニックを追加し、その後、460μlのPSSを追加し、30秒間振とうする最終的な解決には、10μMオレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは、4 ×125μlのアリコートを提供します。 -20℃での光とストアへの暴露を避ける</li></ol>パート2：のCa 2 +ローディング<ol><li> （-20℃）冷凍庫からのCa 2 +インジケーター（オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AM）を削除し、室温で解凍することができます。 </li><li>試験管や水浴の場所でPSSの1mlを取る。秒あたりに現れる約1バブルの速度で95％O 2 / 5％CO 2のバブル。バブラーは、栓、またはパラフィルムで、例えば試験管、に保護する必要があります。 </li><li>動物から組織を摘出し、、Sylgardライニングペトリ皿に、慎重に結合組織を取り除く。関係なく、平滑筋臓器のタイプの、PSSは10分ごとに交換する必要があり、組織は、（PSS三回を交換するなど）だけでなく、以下の郭清を洗浄する必要があります。輸精管の場合：ティッシュのシートを生産する器官の長さの方法を切削することを検討してください。膀胱用：ドームの上部（前方）に膀胱頸部（後方）から縦方向に開く。 8 LONG mmおよび1 - - 支配的な筋肉の束の方向に切断排尿筋の背側表面に沿って幅2 mmの4つのストリップ、6を準備します。 </li><li> &quot;事​​前に暖めとバブル&quot;PSSで切除した組織を置きます。 </li><li> 10μMオレゴングリーン488 BAPTA - 1は試験管の午前の125μlを加え、少し振る、手で、ミックスする。 </li><li>箔で覆われ、バブリングと休暇を再開する。時間は、Ca 2を取るのに十分な組織のために引き継ぎます+インジケーターは、組織と平滑筋の層の厚さのサイズによって異なります。例えば：120分（ラットの排尿筋、マウス輸精管）へ70分（マウス排尿筋、ラットのanococcygeus）。 </li></ol>パート3：&quot;Ca 2 +は 、ロードされた&quot;顕微鏡のための組織の準備組織のピニング慎重になることが組織の自発運動（相対的に無傷の組織から平滑筋細胞のイメージングのプロパティ）を最小限に抑え、組織のフラットな作品として撮影するのに適したサイト（の位置を容易にするために必要です。二次元ではなく3つ）で調査した。 <ol><li>少なくとも5分間バブリングPSSの組織をすすいでください。 </li><li>平らなシートを形成するために組織を（わずかに）ストレッチ、Sylgardライニング準備皿にマウントします。 &quot;ピン&quot;として25から50ミクロン径の銀線の代わりに短い長さを使用し、斜めに挿入し、目標を傷つけることがある長い&quot;ピン&quot;を使用することは避けてください。 </li><li> PSSは、皿のSylgardが並ぶエリア（これは、灌流の開始時に、PSSで覆われて大面積を招く場合があります）から逃れることがないように注意しながら、顕微鏡のステージ上に準備皿を置きます。 </li><li> PSSで準備を表面かん流するために、ポンプのスイッチを入れる。時間当たり100mlの速度は、しばしば採用されている。 </li><li>ヒーターユニットに切り替えます。 </li><li>準備の料理（その基盤上に磁石で金属片にそれぞれ貼付）に流入し、流出管及び温度プローブを置きます。流出管の先端の高さは、PSSの深さを決定します。流出が実際に（それは時々最初にしないとして）PSSを除去していることを確認するように注意してください。 </li><li> 、所望の温度に到達するためのヒータユニット上に、例えば33から35℃を温度を設定する</li><li>組織は、少なくとも10分間平衡させる。 </li></ol>パート4：画像へのサイトの選択励起光源への暴露はインジケータが退色しますので、一度に数秒以上使用しないようにしてください。 <ol><li>低消費電力を目的とし（10倍または20倍）平滑筋を表示し、監視するために適切な領域を識別するために、青色光で励起する、落射蛍光使用。運動（最小限でなければなりません）とフィールドでの平滑筋細胞の数：に基づいてサイトを選んでみてください。明るい&quot;構造は&quot;画像の検出アルゴリズムで&quot;偽陽性&quot;の高い数を引き起こすことがありますので、（例えば）散在上皮細胞または線維芽細胞の数が多いサイトにアクセスしないように。 </li><li>より高い電力の目標（40倍）に切り替えます。 </li><li>ステージや平滑筋細胞（の）ので、光軸を回転させる（高速走査軸に、すなわち平行）、水平位置。 </li></ol>パート5：共焦点顕微鏡共焦点顕微鏡は、&quot;設定&quot;する方法の詳細については、各顕微鏡の種類に固有のものですが、重要な考慮事項は次のとおりです。スピード（5 Hzの最小はほとんどのCa 2 +過渡に必要とされる）、フィールドの解像度とサイズ（速度とオフ取引されどち ​​らも）。次のプロトコルのいくつかは、ライカSP2直立共焦点顕微鏡に固有のものです。典型的なプロトコルです：5 Hzの（256 × 256ピクセル、約100 ×100μmである。）で取得した100フレームのシリーズ、または13.5 Hzの（256 × 64ピクセル、約100 ×25μmと。）。走査ヘッドは双方向に移動する（取得速度を最大にする）と、行ごとに1000 Hzで取得するように設定。 <ol><li> 1つの&quot;エアリーディスク&quot;にピンホールを閉じて。 </li><li> AOTFで25〜35％の間レーザー（488 nm）のパワーを設定します。この値は、明るさと光退色との間のトレードオフです。 （後者は長時間録音時に特定の問題である。） </li><li> &quot;治療&quot;あたり6つのサイト - 六つのサイトあたりのシリーズ、および4を取得する。かなりの退色は、実験者はこのから逸脱する可能性がありますが、それは、事前に薬剤（すなわち&quot;コントロール&quot;）とポスト薬剤同じ6つのサイトを監視することを目的とするのが一般的です。 </li><li>それは、&quot;タイムコントロール&quot;が実行されることのCa 2 +イメージングとが不可欠です。 </li></ol>第6部：分析のための準備<ol><li> http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html：からイメージJをダウンロードしてインストールします。プラットフォーム固有のバージョンをダウンロードしてから、http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jarから最新のimageJ.jarファイルをダウンロードし、古いファイルを置き換えることにより、最新のバージョンにアップデートする。アップルMacユーザー：それは徐々に実行される場合は、アップル（http://www.apple.com/macosx/features/java/）から入手可能なJava仮想マシン（JVM）の最新バージョンを使用していることを確認。 </li><li>からExcel_writer.jarダウンロード：http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.htmlをしてプラグイン[ディレクトリ]&gt; jarファイルのディレクトリにインストールします。 </li><li> ; JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class：以下のファイルをPluginsディレクトリにコピーします。プラグインを使用して、これらの各スクリプトをインストール[メニュー]&gt;マクロ&gt;のインストール... ImageJの機能。 </li><li>私たちは、ライカSP2共焦点顕微鏡、ソフトウェア内の単一の表示可能な&quot;映画&quot;として、各系列を生成するためのソフトウェア（ライカLCS）を使用しますが、個々のフレームとして保存されます。シリーズにフレームを再構成するために：（i）は再構築されるすべての&quot;フレーム&quot;は、単一のフォルダ（例：&quot;DataFolder&gt;原告&quot;）になっていることを確認します。 （ⅱ）プラグイン[メニュー]&gt;マクロ&gt; Leica_SP2_Stackerを選択してください。ルートディレクトリ（例えば&#39;DataFolder&#39;）を選択してください。ドロップダウンリスト（たとえば、&#39;TIFFを/&quot;）から目的のフォルダを選択します。出力ディレクトリを選択するか、新しいものを（例えば、&#39;DataFolder&gt;スタック&quot;）を生成します。スクリプトは、個々のフレームからシリーズを再構築します。 </li></ol>パート7：運動を補正画像化されたサイトの動きが良くピンニングと最小化と均一に延伸組織されることがありますが、一部の平滑筋臓器は単独でピニング慎重で廃止することができる自発的な収縮を示す。ここでは、整列またはシリーズ内でのフレームと一致して自由に利用可能なアルゴリズムの使用を説明しています。 <ol><li> &quot;StackReg&quot;（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）と&quot;TurboReg&quot;（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）をダウンロードしてください。 </li><li>プラグインを使用してプラグインディレクトリにそれぞれをインストールする&gt;マクロ&gt;のインストール... </li><li> （&gt;開くをファイル...）処理されるようにスタックをロードしてから、明らかに興味のある分野を示していますフレームに移動します。他のフレームは、この基準のフレームに配置されます。 </li><li>プラグイン&gt;スタック&gt; StackReg。最も効果的であるかを判別するために別の&quot;変換&quot;（すなわち翻訳、リジッドボディ、スケール回転、アフィン）のそれぞれを試してみてください。 （更なる詳細：http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/） </li></ol>パート8：粒子の検出アルゴリズム各&quot;サイトが&quot;イメージングのために、要因は、Ca 2 +トランジェントの検出に影響を与えることが異なります。各サイト（&quot;粒子のパラメータ&quot; - 詳細下記）の特定の特性を測定することにより、検出の処理が促進される。このようにサイトごとに、一つは、&quot;比率のしきい値&quot;と&quot;セルのエッジのしきい値&#39;減算のしきい値&quot;を計算します。 <ol><li>プラグインの[メニュー]&gt;マクロ&gt;のインストール... ...と&quot;JNCT0.08Release.ijm&quot;を選択します。 </li><li>プラグインの[メニュー]&gt;マクロ&gt;負荷スタック（ショートカット：L）。シリーズを選択して、パーティクルのパラメータを計算します。 <ol style="list-style:none;"><li> A.減算のためのしきい値（=バックグラウンド） </li></ol></li><li>あなたが&quot;背景&quot;であると信じるもの以上の矩形ROIを選択してください。 </li><li>尺度（ショートカット：M）。平均値ダウンに注意してください。 <ol style="list-style:none;"><li> B.比率の計算しきい値</li></ol></li><li>長方形を選択します。セル（複数可）の光学的に平坦な領域の周りROI。 </li><li>尺度（ショートカット：M）。平均値と標準偏差を書き留めます。 </li><li>さらに2回繰り返し、ORは&quot;シフト&quot;を押して一度に3つのボックスを描画することができます。 </li><li> 3 /のサイトを複製するから値を平均し、=（1 + SD /平均値）× 32の比率のしきい値を計算し、書き留めておきます。 <ol style="list-style:none"><li> C.セル端のしきい値</li></ol></li><li>画像&gt;スタック&gt; Zプロジェクト...投影タイプを選択します：&quot;平均強度を&quot; </li><li>画像&gt;&gt;しきい値を調整します。 </li><li>黒と白]を選択します。 </li><li> &quot;下&quot;の定義（上側のスライダ）を制限すると、対応する値（スライダーの右側にある）を書き留めておきます。黒の領域で発生するイベントだけがカウントされます。 </li><li> &quot;リセット&quot;をクリックします。 </li><li>スタックを分析（ショートカット：2） </li><li>この段階で一つのシリーズを選択し、&#39;最初のファイルを&quot;IEと&#39;最後のファイルは、&quot;同じでなければなりません。 </li><li> 、&quot;比率のしきい値&quot;と&quot;セルのエッジのしきい値&#39;を減算するためのしきい値&quot;の値を入力します。それらのデフォルト値で他の設定のまま。 </li><li>このアルゴリズムは、処理系が左側に示されているデュアルペインのウィンドウと右上の元を生成します。慎重に目で見えるイベントは、、検出されていないもので偽陽性と機会の数を評価するためにこの通過。 Ca 2 +のより正確な検出+トランジェントを得るためにそれは少し&quot;粒子のパラメータ&quot;のいくつかを調整する必要があります。プロセスは少し&quot;ヒットとミス&quot;を思わ最初の試みでもありますが、人はすぐにパラメータが鍵となるものとして感じを取得します。 </li><li>各シリーズの場合、アルゴリズムは、Excelファイルを生成することを検出したイベントの詳細特性（振幅、面積や位置など）。 &quot;偽陽性&quot; - このExcelファイルから、手で、削除される可能性がある - アルゴリズムの出力は（例えばステップ8.17）という画像ファイルを確認して識別される。 </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

努力が使用される動物の数とそれらの苦しみを最小限に抑えるためになされた、すべての実験は、英国の動物（科学的手続）法、1986年と欧州共同体理事会指令86/09/EECに準拠して実施した。

蛍光のCa 2 +指示薬の選択 （ⅱ）のCa 2の生理的変化に敏感である+濃度、それは（i）は他の指標（例えばみたFluo - 4、カルシウムグリーン）1に比べて明るいですので、オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは、Ca 2 +指示薬として選ば ​​れました（ⅲ）負荷、多くの平滑筋細胞、監視されるカップリング平滑筋細胞を可能にする;に細胞内Ca 2 +濃度[Ca 2 +] iの（VASの例は、2精）同じような大きさ1のK dでしかし、オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは非ratioableのCa 2 +指示薬である、そのように簡単に絶対的に決定するために使用することができます[Ca 2 +] iの。さらに、それはまた+が存在する場合、高濃度でのCa 2のバッファおよび[Ca 2 +] iの高振幅の変化で飽和になる可能性があります。 自発的な収縮の阻害平滑筋臓器の自発的な収縮は、L型Ca 2 +チャネル（：;ジルチアゼム4ニフェジピン3によってなど）を通してのCa 2 +の動きをブロックすることとして、薬理学的に減少させることができる。これらの薬物は非常に全細胞のCa 2の振幅+点滅/放電時間を短くすることに注意してください。 VASの収縮は主にプリン作動性とノルアドレナリン性神経伝達の組み合わせから結果を精。この組織の焦点のCa 2 +過渡は、しかしながら、ノルアドレナリン受容体遮断（例えば、α1アドレナリン受容体、プラゾシン5による）の動きが焦点のCa 2 +過渡電流に影響を与えずに低減することができるようにすると小文字が区別されません。 また、収縮がワートマニン6によりミオシン軽鎖キナーゼなどの阻害を介して&quot;下流&quot;を防止することができる。 結論サブミクロン分解能でのCa 2 +蛍光を監視することで神経伝達物質放出5,7の後の接合効果を研究し、Ca 2 +の放出+内部 ​​貯蔵（例えば&#39;火花&#39;8）からする強力な手法です。のCa 2 +過渡解析ここで概説する方法論を使用しては、費用対効果であり、市販の画像解析のパッケージと比較すると、ImageJ用のカスタム記述のJavaプラグインを通じて、カスタムメイドの分析を行うことができます。

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Pluronic F-127溶液</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>DMSO中20%溶液</td></tr><tr><td>Leica SP2 正立共焦点顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エアテーブル（&amp;#8216;振動分離ワークステーション&amp;rsquo;）</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 エラストマー</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

焦点のca 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

の Ca 2 は、平滑筋の+イメージングは、内部貯蔵からの Ca 2 +の放出のような膜電位の変化、という結果に可能性細胞メカニズムへの洞察を提供し、同時に監視する複数の細胞は、例えば、評価することができます、のカップリング合胞体組織。細胞内のCa 2 +過渡電流は平滑筋では一般的ですが、まだ契約にそれが発生しやすい、その臓器で、ビューの多くの場合幅広い分野にわたって、原因確率論的な発生に起因する問題の正確な測定が困難である。この問題を克服するために、我々は、自動化された形で、そのような事象の頻度、位置と振幅を取得し、解析するイメージングプロトコルと分析の一連のルーチンを開発しました。このアプローチは他のコンテキストに適用されるかもしれないが、私たち自身の仕事は、ローカルプリンのCa 2の検出+サブミクロンの分解能で伝達物質の放出を検索するための過渡状態を含む。 ATPは、それが排尿筋と輸精管の平滑筋上のP2X1受容体に結合する自律神経、から共存伝達物質として放出される。 のCa 2 +プリン神経効果器のCa 2 +過渡（NCTS）で、その結果、平滑筋に入ります。焦点のCa 2 +過渡電気生理学よりも多くの利点を持っている方法で、神経伝達物質の放出の光学的モニタリングを可能にする。離れて大幅に向上空間分解能から、光記録は、同時に多くの識別可能なサイトからの伝達物質の放出の記録を可能にするという利点もあります。さらに、焦点の光学面は維持または細胞内鋭い微小電極の再配置よりも長時間録音のシリーズの間に修正する方が簡単です。 要約すると、 カルシウムのイメージング+蛍光のための方法が概説されている細部組織の準備、およびデータの収集と分析。我々は、例えばCa 2 +過渡電流の解析のためのいくつかのスクリプトの使用を概説する。

高解像度のCaの詳細方法<sup&gt; 2 +</supを含む分離された臓器、内平滑筋の&gt;イメージング：組織、画像取得とデータ解析の準備。

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

平滑筋の$\text{Ca}^{2+}$イメージングは、$\text{Ca}^{2+}$の放出など、膜電位の変化を伴わない可能性のある細胞メカニズムについての知見をもたらします。

まず、カルシウム負荷溶液を調製し、加温してバブリングを行います。尿路を摘出し、切開して平らにピンで固定し、排尿筋のストリップを採取します。この排尿筋ストリップを負荷溶液に加え、インキュベートして洗浄した後、平らにピンで固定します。組織内のカルシウム蛍光がレーザー光によって励起され、放出された光をキャプチャして結果を得ます。個々のフレームからなる動画は、連続するフレームを比較することで解析されます。また、バックグラウンドの減算が行われます。細胞端のしきい値によって、イベントを検出する範囲が決定され、連続する脳の間で比率が算出されます。残りのイベントが定義済みの基準に一致する場合、それらはハイライトされ、ラベルが付けられます。こんにちは、オックスフォード大学薬理学部、Keith Brain教授とTom Kinane教授の研究室のJohn Youngです。私はBrainおよびCanne研究室のRob Amosです。そして私はKeith Brainです。本日、JohnとRobが平滑筋におけるカルシウムイメージング技術を実演します。私たちは、自律神経からの神経伝達物質の放出と、それが平滑筋に及ぼす影響を研究するために、研究室でこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。カルシウムインジケーターのOrgan Green 488-BAPTA-1 AMは、50 µgの粉末を含む500 µLバイアルで提供されています。カルシウムインジケーターを調製するには、粉末に40 µLのOnic F1 27溶液を加え、30秒間静かに振ってください。その後、460 µLの生理食塩水（PSS）を加え、さらに30秒間静かに振ります。最終溶液（10 µM Organ Green 488）により、125 µLの分注液を4本用意します。光への曝露を避け、目的組織を解剖するまで溶液を-20 °Cで保存してください。カルシウム指示薬をフリーザーから取り出し、室温で解凍します。テストチューブに1 mLのPSSを入れ、33 °Cのウォーターバスに浸します。栓を用いてバブラーをテストチューブに固定します（またはパラフィルムを使用しても構いません）。その後、95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスを、秒速約1泡の速度でバブリングさせます。動物から平滑筋組織を摘出します。本手順では、マウスの膀胱を使用します。摘出した臓器を約50 mLのPSSに入れ、洗浄します。組織の洗浄後、周囲の脂肪組織および結合組織を慎重に除去します。尿路膀胱を平滑筋の層状構造に従って解剖し、開きます。膀胱頸部から、尾側端からドーム頂部に向かって縦方向に切開します。頭側端に沿って、主要な筋束の方向に切り出し、背側表面から長さ6〜8 mm、幅1〜2 mmのストリップを4本準備します。摘出した組織と、あらかじめ加温しバブリングしたPSSを、10 µMのOrgan Green 488 Bを含むカルシウムインジケーター溶液125 µLと共に試験管に入れ、手で軽く振って混ぜ合わせます。試験管をウォーターバスに戻します。バブリングを再開し、ウォーターバスをアルミホイルで覆います。十分な量の組織にカルシウムインジケーターが取り込まれるまでにかかる時間は、組織のサイズや平滑筋層の厚さによって異なります。例えば、マウスの排尿筋およびラットのoxsでは70分です。一方、ラットの排尿筋およびマウスのVAs deensでは、120分間インキュベートします。組織にカルシウム指示薬をロードした後、顕微鏡観察の準備を行います。まず、組織をバブル処理したPSSで10分間洗浄します。次に、組織をSガードを敷いたプレパレーションディッシュに固定します。わずかに伸ばして平坦なシート状にします。短い長さのピン（例えば、直径25～50 µmの銀線を2 mmに切ったもの）を用いて、組織を斜めに固定します。対物レンズを傷つける可能性があるため、長さが数ミリメートルを超えるピンの使用は避けてください。組織の不随意な動きを最小限に抑え、イメージングに適した部位を容易に特定するためには、慎重に組織を固定することが重要です。組織を固定した後、プレパレーションディッシュを顕微鏡のステージ上に配置します。PSSがディッシュのシリガードライニング領域から漏れ出さないように注意してください。漏れ出すと、広範囲にPSSが広がってしまう可能性があります。デモンストレーション目的でスーパーフュージョンを開始する際は、以下の手順を明所で実施します。これらの実験は通常、暗所で実施されることに注意してください。ポンプをオンにして、標本を還流させます。PSSでは、100 milliliters per hourの流速がしばしば用いられます。ヒーターユニットの電源を入れ、流入チューブ、流出チューブ、および温度プローブをプレパレーションディッシュに配置し、それぞれ底面のマグネットでメタルストリップに固定します。流出チューブの先端の高さによってPSSの深さが決まります。流出チューブからPSSが適切に除去されていない場合があるため、実際に除去されているか注意深く確認してください。まず、ヒーターユニットの温度を33〜35 °Cの希望温度に設定します。低倍率対物レンズ（10倍または20倍）を用いて、組織を少なくとも10分間平衡化させます。エピ蛍光顕微鏡または青色励起光を用いて平滑筋を観察し、モニターに適した領域を特定します。励起光への曝露によりインジケーターが光退色するため、一度に数秒以上の使用は避けてください。画像検出アルゴリズムにおいて偽陽性が多く発生する可能性があるため、明るい構造物は避けてください。視野内に平滑筋細胞が多く、かつ動きが最小限である部位を選択するようにしてください。イメージングする部位を決定したら、40xなどの高倍率対物レンズに切り替えます。平滑筋細胞が水平になるように、ステージまたは光軸を回転させます。これにより、細胞が高速スキャン軸と平行になります。これで、共焦点顕微鏡による平滑筋細胞のイメージング準備が完了しました。本プロトコルでは、Leica SP2正立共焦点顕微鏡を使用します。ピンホールを1 airy discに設定します。custo opticチューナブルフィルターでのレーザー出力を25～35%の間に設定してください。この値は、輝度と光退色のトレードオフとなります。データ解析の準備として、ImageJをダウンロードしてインストールしてください。プラットフォーム固有のバージョンをダウンロードし、最新のImageJ jarファイルをダウンロードして旧ファイルを置き換えることで、最新バージョンにアップデートします。次に、Excel writer jarファイルをダウンロードし、plugins jarディレクトリにインストールしてください。これらのファイルをpluginsディレクトリにコピーします。pluginsマクロを使用して、これらのスクリプトをそれぞれインストールします。ImageJのインストール機能を使用してください。使用しているLeica SP2共焦点顕微鏡用のソフトウェアはLeicaと呼ばれています。LCSは、各シリーズの個々のフレームを個別のファイルとして保存します。シリーズを再構成するには、再構成するすべてのフレームが単一のフォルダ内にあることを確認してください。例えば、「data folder tiffs」を選択します。次に、[Plugins] > [Macros] メニューから「Leica SP two stacker」マクロを選択します。ルートディレクトリとして、この場合は「data folder」を選択してください。ドロップダウンリストから目的のフォルダーを選択します。この例では、tiffsを選択して出力ディレクトリを指定するか、新しいディレクトリを作成します。例えば、data folder stacksなどが挙げられます。次に、スクリプトが個々のフレームからシリーズを再構成し、動きによるズレを補正します。ここでは、シリーズ内のフレームをアライメントまたはマッチングさせる、無料で利用可能なプラグインであるStacks、Rig、およびTurboRegを使用します。それぞれのファイルをstacksフォルダにコピーしてください。処理するスタックを読み込み、関心領域が明確に示されているフレームに移動します。他のフレームはこの参照フレームに合わせてアライメントされます。その後、プラグインの「Stacks」に移動します。スタック登録。各部位において何が最も効果的であるかを決定するために、さまざまな変換をそれぞれ試してください。カルシウム・トランジェントの検出に影響を与える画像因子は、各部位の特定の特性や粒子パラメータを測定することによって変動します。検出の感度と特異度が高まります。したがって、各部位について、比率の減算しきい値および細胞エッジしきい値を算出します。まず、[plugins]から[macros]、[install]を選択し、jn CTO dot oh eight release dot IJM JMを選択します。次に、[plugins]、[macros]、[load stack]へと進みます。シリーズを選択し、以下の粒子パラメータを算出します。減算（subtracted）の閾値を算出するには、背景測定と思われる箇所に矩形の関心領域（ROI）を選択してください。その平均値を記録します。比率（ratio）の閾値を算出するには、平滑筋細胞または細胞群の光学的に平坦な領域の周囲に矩形の関心領域（ROI）を選択してください。平均値と標準偏差を測定し、記録してください。この工程をさらに2回繰り返すか、Shiftキーを押しながら3つのボックスを同時に描画することも可能です。比率の閾値を計算し、記録してください。標準偏差を平均値に1を加えたもので除し、その結果に32を乗じて算出します。3回の繰り返し実験から得られた値を平均化します。32という係数は、前のフレームからの変化がない場合に整数値32にマッピングされる比率演算アルゴリズムを考慮するために必要です。これにより、比率の増減を検出するための十分なダイナミックレンジが得られます。8ビット画像の場合、[画像調整]の[しきい値]を選択します。[白黒]を選択し、上部スライダーの制限値を定義して、対応する値を記録してください。これはスライダーの右側にあります。黒い領域で発生したイベントのみがカウントされます。リセットをクリックしてください。比率の減算しきい値（subtracted threshold for ratio）および細胞エッジのしきい値（cell edge threshold）が算出されたので、画像スタックの解析を行います。解析するスタックの場所を決定してください。この段階では、シリーズを1つだけ選択します。それが最初のファイルであり、最後のファイルも同様である必要があります。次に、データファイルおよびスタックの出力先を選択します。例えば、「data folder output」などが挙げられます。減算しきい値、比率しきい値、およびセルエッジしきい値の値を入力します。その他の設定はデフォルト値のままにします。アルゴリズムにより2ペインのウィンドウが表示され、左側に処理済みのシリーズが、右側にオリジナルが表示されます。出力フォルダからこのファイルを開き、偽陽性の数および目視で確認できるイベントが検出されなかった事例を評価するために、慎重に内容を確認してください。各シリーズについて、アルゴリズムは検出されたイベントの振幅、面積、位置などの特性を詳細に記したExcelファイルを作成します。アルゴリズムが出力した画像ファイルをレビューして特定した偽陽性は、このExcelファイルから手動で削除することが可能です。ただし、削除を行う際は厳格な基準を設けてください。これは平滑筋におけるカルシウム一過性変化の動画です。この例では、5 Hzで取得した100個の個別のフレームで動画が構成されています。例えば、特定の薬剤がカルシウム一過性変化の頻度に及ぼす影響を調査する場合、1回の実験につきこのような動画を多数取得します。ここでは、平滑筋細胞における多数の自発的なカルシウム・トランジェントが観察されます。ここでは、粒子検出アルゴリズムの結果が示されています。各シリーズについて、アルゴリズムは、振幅、面積、位置などの検出されたイベントの特徴を詳細に記したExcelファイルを生成します。これまで、尿路などの平滑筋器官におけるカルシウム・トランジェントのイメージング手法と、当研究室で開発したアルゴリズムを用いてこれらのカルシウム・トランジェントを分析する方法を実演しました。重要な点は、カルシウムイメージングに向けて組織を十分に準備することです。本日の実演で用いた組織の場合、結紮組織を取り除き、視野を妨げる可能性のある脂肪をすべて除去することが重要です。また、組織を平らにピン留めすることも重要です。それでは、実験の成功をお祈りします。ご視聴ありがとうございました。

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Research

JoVE Journal

Biology

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