焦点のCa ^{2 +過渡検出}

まず、カルシウム負荷溶液を調製し、加温してバブリングを行います。膀胱を摘出し、開いて平らにピンで固定し、排尿筋のストリップを切り出します。この排尿筋ストリップを負荷溶液に加え、インキュベートして洗浄した後、平らにピンで固定します。

組織内のカルシウム蛍光をレーザー光で励起し、放出された光をキャプチャして記録します。個々のフレームからなる動画は、連続するフレームを比較することで解析されます。また、背景光の減算処理が行われます。

細胞縁の閾値によってイベントの検出範囲が決定され、連続する脳間の比率が算出されます。残りのイベントが定義済みの基準に一致する場合、それらは強調表示され、ラベル付けされます。こんにちは。私はオックスフォード大学薬理学部、Keith BrainおよびTom Kinaneの研究室のJohn Youngです。

私はRob Amosです。BrainおよびCanne研究室に所属しています。そして私はKeith Brainです。本日は、JohnとRobが平滑筋におけるカルシウムイメージング技術を実演します。私たちはこの手法を、自律神経からの神経伝達物質の放出と、それが平滑筋に及ぼす影響を研究するために研究室で活用しています。

それでは始めていきましょう。カルシウムインジケーターのOrgan Green 488-BAPTA-1 AMは、50 µgの粉末を含む500 µLバイアルで提供されています。カルシウムインジケーターを調製するには、粉末に40 µLのOnic F1 27溶液を加え、30秒間ゆっくりと振盪します。その後、460 µLの生理食塩水（PSS）を加え、さらに30秒間ゆっくりと振盪します。

最終溶液である10 µMのOrgan Green 488 BAFTAは、125 µLずつの分注液4本分となります。光への曝露を避け、目的の組織を解剖するまで、溶液を-20 °Cで保存してください。

カルシウム指示薬をフリーザーから取り出し、指示薬が解凍されるまで室温で放置します。試験管に1 mLのPSSを入れ、33 °Cのウォーターバスに置きます。バンカーでバブラーを試験管に固定します（またはパラフィルムでも代用可能です）。その後、95%酸素と5%二酸化炭素の混合ガスを、1秒間に約1回の気泡が発生する速度でバブリングします。

動物から平滑筋組織を摘出します。本例では、マウスの膀胱を使用します。組織を約50 mLのPSSに入れ、洗浄します。洗浄後、周囲の脂肪組織および結合組織を慎重に取り除きます。

尿路の平滑筋層に従って、膀胱を切り開きます。膀胱頸部からドームの頂点まで、縦方向に切り開きます。頭側から、主要な筋束の方向に沿って、長さ6〜8 mm、幅1〜2 mmのストリップを4本、背側表面から切り出します。

摘出した組織と、あらかじめ加温しバブリングしたPSSを、125 µLの10 µM Organ Green 488Bカルシウムインジケーターとともに試験管に入れ、手で軽く振って混ぜ合わせます。試験管をウォーターバスに戻します。バブリングを再開し、ウォーターバスをアルミホイルで覆います。

十分な組織にカルシウムインジケーターが取り込まれるまでの時間は、組織のサイズおよび平滑筋層の厚さによって異なります。例えば、マウスの排尿筋およびラットのoxsでは70分です。一方、ラットの排尿筋およびマウスのVAs deensでは、120分間インキュベートします。

組織にカルシウムインジケーターを導入した後、顕微鏡観察の準備を行います。まず、バブルを通したPSSで組織を10分間洗浄します。次に、Sガードを敷いた作製用ディッシュに組織を固定します。

軽く伸ばして平らなシート状にします。短い長さ（例：直径 25 to 50 µm の銀線を 2 mm）のピンを用いて組織を固定し、ピンを斜めに刺します。

対物レンズを傷つける可能性があるため、数ミリメートル以上の長さのピンは使用しないでください。組織の不随意な動きを最小限に抑え、イメージングに適した部位を容易に見つけるためには、慎重に組織をピン留めすることが重要です。組織をピン留めした後、試料皿を顕微鏡ステージ上に配置します。

PSSがディッシュのシリコンガードで囲まれた領域から漏れ出さないよう注意してください。漏れ出した場合、広範囲がPSSで覆われてしまう可能性があります。デモンストレーション目的で超融合（superfusion）を開始する際は、以下の手順を明所で実施します。

これらの実験は通常、暗所で実施されることに留意してください。灌流を行うため、ポンプのスイッチを入れます。PSSでは、100 milliliters per hourの流速がしばしば用いられます。

ヒーターユニットの電源を入れ、流入管、流出管、および温度プローブをプレパレーションディッシュに配置し、それぞれのベースにあるマグネットでメタルストリップに固定します。流出管の先端の高さによってPSSの深さが決まります。流出管からPSSが適切に排出されないことがあるため、実際に排出されているか注意深く確認してください。

まず、ヒーターユニットの温度を設定し、目的の温度である 33 から 35 °C に到達させます。その後、10倍または 20倍の低倍率対物レンズを用いて、組織を少なくとも 10 分間平衡化させます。

エピ蛍光顕微鏡または青色光による励起を用いて平滑筋を観察し、モニタリングに適した領域を特定します。励起光にさらされると、照明によりインジケーターが光退色するため、一度に数秒以上の使用は避けてください。

画像検出アルゴリズムにおいて偽陽性が多く発生する可能性があるため、明るい構造物は避けてください。視野内に平滑筋細胞が多く、かつ動きが最小限である部位を選択するようにしてください。撮影部位を選択したら、40 x などの高倍率対物レンズに切り替えます。

平滑筋細胞が水平（高速スキャン軸と平行）になるように、ステージまたは光軸を回転させます。これで、共焦点顕微鏡による平滑筋細胞のイメージング準備が整いました。

本プロトコルでは、Leica SP2倒立共焦点顕微鏡を使用します。ピンホールを1 airy discに絞ります。カスタマオプションのチューナブルフィルターでのレーザー出力を25～35%に設定します。

この値は、輝度と光退色のトレードオフになります。データ解析の準備として、Image Jをダウンロードし、インストールしてください。プラットフォーム固有のバージョンをダウンロードした後、最新のImageJ jarファイルをダウンロードして古いファイルを置き換え、最新バージョンにアップデートします。次に、Excel writer jarファイルをダウンロードし、plugins jarディレクトリにインストールしてください。

これらのファイルをpluginsディレクトリにコピーします。pluginsマクロを使用して、これらのスクリプトをそれぞれインストールしてください。ImageJのインストール機能を使用します。使用しているLeica SP2共焦点顕微鏡用のソフトウェアはLeicaと呼ばれています。

LCSは各シリーズの個々のフレームを別々のファイルとして保存します。シリーズを再構築するには、再構築するすべてのフレームが単一のフォルダー内にあることを確認してください。

例えば、data folder tiffsを選択します。次に、pluginsメニューのmacrosからLeica SP two stackerマクロを選択します。ルートディレクトリ（この場合はdata folder）を選択してください。

ドロップダウンリストから目的のフォルダーを選択します。この例では、tiffsの出力ディレクトリを選択するか、新しいディレクトリを作成します。例えば、data folder stacksなどが挙げられます。

次に、スクリプトが個々のフレームからシリーズを再構成し、動きによるズレを補正します。ここでは、ダウンロードしたスタック内のシリーズのフレームを整列または照合させる、フリーで利用可能なアルゴリズムであるrigおよびturbo regを使用します。それぞれのファイルをstacksフォルダにコピーしてください。

処理するスタックを読み込み、関心領域が明確に示されているフレームに移動します。他のフレームはこのリファレンスフレームに合わせてアラインメントされます。その後、プラグインの「Stacks」に移動します。

スタック登録を行います。各部位において何が最も効果的かを判断するために、さまざまな変換をそれぞれ試してください。カルシウムトランジェントの検出に影響を与えるイメージング因子は、各部位の特定の特性や粒子パラメータを測定することによって変動します。

検出の感度と特異度が高まります。したがって、各サイトについて、比率の減算しきい値としきい値のセル縁辺しきい値を算出します。まず、plugins、macros、installへと進み、jn CTO dot oh eight release dot IJM JMを選択します。次に、plugins、macros、load stackへと進みます。

シリーズを選択し、以下の粒子パラメータを算出します。「subtracted（減算）」の閾値を算出するには、背景であると考えられる領域に矩形関心領域（ROI）を選択してください。その平均値を記録します。「ratio（比率）」の閾値を算出するには、平滑筋細胞または細胞の光学的に平坦な領域の周囲に矩形関心領域を選択してください。

平均値と標準偏差を測定し、記録してください。この工程をさらに2回繰り返します。または、Shiftキーを押しながら3つのボックスを一度に描画することも可能です。比率の閾値を計算し、記録してください。

標準偏差を平均値に1を加えた値で除し、その結果に32を掛け合わせて算出します。3回のリプリケートから得られた値を平均化しますが、この32という係数は、前のフレームからの変化がない場合に整数値32にマッピングされる比率算出アルゴリズムを考慮するために必要です。これにより、比率の増加および減少を検出するための適切なダイナミックレンジが得られます。

8ビット画像の場合、「イメージ調整」の「しきい値」を選択します。「白黒」を選択してください。上のスライダーを動かして限界値を定義し、対応する値を記録します。

これはスライダーの右側にあります。黒い領域で発生したイベントのみがカウントされます。リセットをクリックしてください。

比率の減算しきい値およびセルエッジしきい値が算出されたので、画像スタックの解析を行います。解析対象となるスタックの場所を特定してください。この段階では、シリーズを1つだけ選択してください。

これが最初のファイルであり、最後のファイルも同様である必要があります。次に、データファイルとスタックの出力先を選択します。例えば、「data folder output」を選択します。

減算しきい値、比率しきい値、および細胞エッジしきい値の値を入力します。その他の設定はデフォルト値のままにしてください。アルゴリズムにより、左側に処理後のシリーズ、右側にオリジナルが表示される2ペインウィンドウが生成されます。

出力フォルダからこのファイルを開き、偽陽性の数および、目視で確認できるイベントが検出されなかった箇所を慎重に評価してください。各シリーズについて、アルゴリズムは検出されたイベントの振幅、面積、位置などの特性を詳細に記したExcelファイルを作成します。アルゴリズムが出力した画像ファイルをレビューして特定した偽陽性は、このExcelファイルから手動で削除できます。ただし、削除にあたっては厳格な基準を設けてください。

これは平滑筋におけるカルシウム・トランジェントの動画です。この例では、動画は5 Hzで取得した100個の個々のフレームで構成されています。例えば、特定の薬剤がカルシウム・トランジェントの頻度に及ぼす影響を調査する場合、1回の実験につきこのような動画を多数取得します。

ここでは、平滑筋細胞における多数の自発的なカルシウム・トランジェントが見られます。粒子検出アルゴリズムによる結果をここに示します。各シリーズについて、アルゴリズムは検出されたイベントの振幅、面積、位置などの特性を詳細に記したExcelファイルを出力します。

以上で、膀胱などの平滑筋組織におけるカルシウム・トランジェントのイメージング手法と、当研究室で開発したアルゴリズムを用いたカルシウム・トランジェントの解析方法について実演しました。重要な点は、カルシウムイメージングに向けて組織を十分に調製することです。本日実演した組織の場合、結合組織を取り除き、視野を遮る可能性のある脂肪をすべて除去することが重要となります。

また、組織を平らなシート状にピンで固定することも重要です。それでは、実験の成功をお祈りしています。ご視聴ありがとうございました。