Name: レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュのレンズ移植法。GFP標識レンズを用いて変異体の眼発生異常が内因性か組織相互作用によるものかを解析する発生生物学の手法です。

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この手順では、ビルジェフリーの研究室で洞窟の魚のために開発された大部分は移植技術に従います。

パート1：胚を準備このプロトコルでは架空ゼブラフィッシュレンズ変異を示すためJJ なxyシンボルを使用します。 <ol><li>ゼブラフィッシュ株は14H light/10h暗サイクル28.5 Cで標準魚ファシリティ条件で維持さ。 </li><li>夕方、場所雄とゼブラフィッシュひずみJJ xyの雌における：AB / TU;互いにからそれらを分離するデバイダ持つタンクにおけるTG（MGFP）。この十字架の子孫はすべて組織におけるGFP導入遺伝子を発現するであろう、およびドナーとして使われます。パラレルで、非トランスジェニック野生型動物間交雑をセットアップする同じ手順を使用。この実験の目的に応じ、一つドナーまたはホストとしてJJ なxy座で野生型動物を交差できます。 </li><li>光が朝でターンオン後1時間以内、メイトへ魚を許可する仕切りを取り外します。 </li><li> 15-30分間が100 × 15ミリメートルシャーレで胚を収集後、それらを掃除、と培地（卵水を）変更。 </li><li>希望時間まで28.5 Cインキュベーターで胚キープ。 </li><li>するとき移植用準備、鋭い鉗子の二対で手動絨毛膜を取り外し、および30分間カルシウム-フリーZFRで0.2％EDTAで胚をインキュベート。 </li></ol>パート2：解剖針の調製<ol><li> ;とドナーレンズを移動とホストに挿入する使わ鈍針、レンズを取り巻く組織をカット絨毛膜を削除、およびアガロースからリリース胚に使われる尖った一つ：移植手順は針の二種類を必要。ここではこれら針を作る方法を紹介します。 </li><li>最初、パスツールピペットの先端はダイヤモンドナイフを使っ断たれるなりません。その後その長の約半分がそれ内側なるようパスツールピペットチップにキャピラリーガラスを挿入。これは容易次ステップでガラスにそれを溶融によってタングステンワイヤを動けなくする行います。 </li><li>その後キャピラリーの開口端に細いタングステン線を挿入。ブンゼンバーナーとともにワイヤーにわたってガラスをメルト。手で針の他端をねじれながら鉗子を使用、金属線とともに着実ガラス終わりをホールド。軟化したガラスは場所にを把持金属周りスパイラルすべき。 </li><li>もし鈍先端針を作っている場合、このは手順の終わりです。シャープ針を作成する、非常細かい先端が作成れるよう金属をオフ燃焼、1から1.5分間ブンゼンバーナーにわたってタングステンワイヤーをホールド。 microscropy.Itによって先端の品質が移植前直ちに数秒間火炎における両方針の滅菌に良いアイデアですチェック。 </li></ol>パート3：試薬の調製<ol><li>カルシウム-フリーゼブラフィッシュリンゲル（ZFR）ソリューションズ（116 mMのNaCl、2.9 mMののKCl、5mMのHEPES、pH7.2を） </li><li>カルシウム-フリーゼブラリンゲルソリューション（液pH7.2）における0.2％EDTA </li><li>カルシウム-フリーZFRにおける1.2％アガロース（低融点） </li><li>カルシウム-フリーZFRの0.2％アガロース（低融点） </li><li>リットルあたり胚培地は（pH7.0の、含ま：10ミリリットルハンクスソリューション＃1、1ミリリットルハンクスソリューション＃2、10ミリリットルハンクスソリューション＃4、10ミリリットルハンクスソリューション＃5、0.35 gの重炭酸ナトリウム、2M塩酸の300 UL、ペニシリン-ストレプトマイシン500,000をゼブラフィッシュブック （オレゴンプレス大学、2000）におけるとしてU）。 </li><li>タングステンワイヤー、金メッキ、0.1ミリメートル直径、アルファAesar </li><li>毛細管、1.0ミリメートル直径、世界プレシジョンインスツルメンツ</li></ol>パート4：移植手続き<ol><li>プラスチック遠心管に、水浴40 Cに予熱カルシウム-フリーZFRで1.2％低融点アガロースを準備。 </li><li>希望ステージ（例えば30 HPF、）で、ゆっくり遠心管にそれらを追放、およびゆっくり遠心管にそれらを追放と約5秒間インキュベート、パスツールピペットで胚を占有。ドナーとホストは別途インキュベートれるべき。 </li><li>ホストとドナーが別個保つ、ピペットとともに、遠沈管から​​1.2％アガロースで胚を占有と100ミリメートルポリスチレンシャーレ内二つの平行行でそれらを手配。ゆっくりと注意深くそれらをペッティングによって、最も胚はアガロースにおける彼ら両側にうそなります。あなたはアガロースが固化前眼が上向きれるよう鈍針を使っこの位置にうそしないもの向きを変更する必要が。 </li><li>固化に1.2％アガロースを待ちます、および、0.2％低融点アガロース溶液でそれをオーバーレイ。 </li><li>シャープ針を使用、目の周りいかなるアガロースを取り外し、および非常注意深く小さなストロークを使っホストとドナー胚からレンズを切り取る。ようそれを引き裂くはなくレンズするちょうど十分近いカットする必ず確認、ならずのでホスト眼の残りからすぎる組織を削除しない。 </li><li>かつてフリー、レンズは培地でフロートします。鈍針を使用、注意深くドナーをプッシュレンズは、単にホストのレンズが正常になる場所の位置の上にして、鈍針で目の中に、押し下げてください。ホストのレンズは破棄されることがあります。 </li><li> 30〜60分間、1.2％アガロースでドナーとホスト胚のままにして、鋭い針を用いてアガロースからそれらを解放し、胚の培地で24ウェルプレートにそれらを転送する。それぞれの胚には、別々の井戸を占有する必要があります。正しくので、ホストがどのドナーに対応するかを明確であることを井戸にラベルを付けることを確認してください。 </li><li> 28.5℃でインキュベートするドナー由来のレンズは、GFP蛍光に基づいて、同じ動物の逃れた側のホストのレンズと区別することができる。セクションはまた、レンズのサイズを測定するために、それが適切に区別するかどうかを判断するために行うことができます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig1.jpg" alt="図1" /> 図。レンズ移植のために使用されて削られた針の1低倍率画像。キャピラリーガラス（B）は、パスツールピペット（A）に挿入され、細いタングステンワイヤ（C）は、キャピラリーの開放端に挿入されます。ワイヤー上のガラスは、ブンゼンバーナーで柔らかくします。あなたの手でパスツールピペットのもう一方の端をねじりながら、鉗子を用いて、金属線で安定したガラスの端を保持する。軟化したガラスは、金属の周りスパイラル、所定の位置に把持すべき。 <img src="/files/ftp_upload/1258/fig2 1258.png" alt="" width="600" height="204" /> 図。レンズ移植のために使用される注射針の二種類の2のヒント。 <img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig3.jpg" alt="図3" /> 図。 3胚は30hpfでレンズ移植を施行した。示すように、ドナー胚（A、B）、移植レンズ（C、D）、およびホスト胚（E、F）の制御側でのホストの目です。示されるように各眼は透過光およびUV照射の両方で表示されます。写真は48 HPFで撮影したもの。 Q01 [9]トランスジェニックラインは、この実験に用いた。

<ol><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289, 631-633 (2000).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+vision+in+the+zebrafish%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of vision in the zebrafish(Danio rerio).</a> Dev Biol. 180, 646-663 (1996).</li>
<li>Schmitt, E., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+morphogenesis+in+the+zebrafish.+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.comp.+Neuro%22%5BJournal%5D)">Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio.</a> J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).</li>
<li>Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+forward+genetics--analysis+of+neuronal+diversity+and+patterning+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina.</a> Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).</li>
<li>Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+to+the+analysis+of+eye+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish.</a> Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+study+neurogenesis+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina.</a> Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutagenesis+yields+eye+morphological+mutants+with+retinal+and+lens+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects.</a> Vision Res. 42, 535-540 (2002).</li>
<li>Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).</li>
</ol>

いくつかのステップは、レンズの移植中に特別な注意が必要です。 <ol><li>針の先鋭化：これは、レンズの移植を実施する前にいくつかの針を準備すると良いでしょう、と針の先端はできるだけ薄くする必要があります。厚い針を癒すために目に障害を引き起こし、ためにより広い直径のより多くの組織を引き裂くだろう。 </li><li>胚の配置：彼らが両側に横たわっているように右移植前に胚を配置する必要があります。配置する際、1.2％アガロースで固化は、非常に迅速にできます。アガロースの硬化を遅くするために、ペトリ皿は、それが40 ° Cの水浴中で浮いせることにより予熱することができます。 </li><li>ホストの目にドナーのレンズを挿入する前に、可能な限りホストの頭の周りなど、多くのアガロースを削除するようにしてください。それは、ドナーのレンズをそのように挿入する方が簡単です。 </li><li>ちょうどレンズ移植後の胚を0.2％アガロースの層で覆われ、1.2％アガロースの層に埋め込まれたままにしておく必要があります。抗生物質で胚のメディアを追加すると、ドナーとホスト胚の両方で創傷治癒を促進する。アガロースから胚をリリースする前に、30〜60...

<table><tbody><tr><td>直径0.1mmタングステン線</td><td>A Johnson Matthey</td><td>45086</td><td></td></tr><tr><td>アガロース（低融点）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-4</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>パステールピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>ピペットポンプ</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>Cardinal Health</td><td>D1906</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

レンズは、眼杯[1,2]の開発において重要な役割を果たしている。モデル生物としてゼブラフィッシュを用いて、レンズの開発についての質問に対処することができます。ゼブラフィッシュは、小型サイズ、高い繁殖力、短いライフサイクル、およびケアの容易さなど、いくつかの有利な特性に起因する遺伝学的研究に有用です。レンズの開発は、ゼブラフィッシュで急速に発生します。 72 HPFにより、ゼブラフィッシュのレンズは、機能的に成熟している[3]。豊富な遺伝と分子資源は、ゼブラフィッシュの研究をサポートするために用意されています。さらに、他の脊椎動物のものとゼブラフィッシュアイの類似性は、人間の欠陥の優れた動物モデルとしての使用（4）〜（7）の基準を提供します。いくつかのゼブラフィッシュの突然変異体は、いくつかのケースでは、レンズティッシュ[8]の完全な変性につながる細胞死、の高いレベルを含む、レンズの異常を示す。 レンズの異常は、本質的な原因または周囲の組織と欠陥の相互作用によるものかどうか判断するために、野生型の目に変異体レンズの移植が行われている。ファイアーポリッシュ金属針を使用して、変異体または野生型レンズは、慎重にドナー動物から解剖し、ホストに転送されます。野生型と変異体の組織を区別するために、トランスジェニック系統をドナーとして使用されます。この行は、レンズを含めて、全ての組織において膜結合型GFPを発現する。この移植法は、ゼブラフィッシュレンズの変異体の研究に不可欠なツールです。

レンズ開発は、他の組織との相互作用を伴います。いくつかのゼブラフィッシュの眼の変異体が異常に小さいレンズの大きさによって特徴付けられる。ここでは、この表現型は、レンズを囲む組織との本質的な原因や欠陥の相互作用によるものかどうかを判断するためにレンズの移植実験を示しています。

水晶体は、視杯の発達において重要な役割を果たします[1,2]。ゼブラフィッシュをモデル生物として用いることで、水晶体の発達に関する疑問...

ゼブラフィッシュの水晶体移植を開始するために、GFP発現トランスジェニック個体（ドナー）と野生型個体（レシピエント）を、カルシウムフリーのゼブラフィッシュリンガー液を入れた別々のペトリ皿で30分間インキュベートします。次に、魚の幼魚を低融点アガロース中で2列に並べて固定します。一方の列（A）をドナー用、もう一方（B）をレシピエント用とします。レシピエントからは水晶体のみを除去し、ドナーからは眼球全体を除去します。ドナーレンズをホストの眼に配置する前に、ドナーレンズ周囲の組織を除去します。移植後、魚をラベル付きの24ウェルプレートに保管します。移植されたレンズは、ホスト内でGFP蛍光を示すはずです。当然ながら、ホストの対側眼は手術されておらず、GFPは発現していません。こんにちは、Yjです。そして私はKaya McCulloughです。私たちはハーバード大学医学部眼科のYma Maki博士の研究室に所属しています。本日は、野生型ゼブラフィッシュ（Danio rerio）における水晶体移植の手順をご紹介します。当研究室では、野生型から変異体へ、あるいはその逆へと水晶体を移植するためにこの手順を用いています。これにより、変異遺伝子が水晶体内で自律的に機能しているか、あるいは非自律的に機能しているかを判断することが可能になります。それでは、始めていきましょう。ゼブラフィッシュ系統は、28.5 °C、14時間明期・10時間暗期の標準的な魚類飼育施設条件下で維持する。計画している実験の前夜に、オスとメスをタンクに入れ、仕切りで互いを隔てておく。これらの魚の遺伝子型は、GFP発現および目的の変異を持つ子孫を生じさせるものである必要がある。並行して、同様の手順を用いて、非トランスジェニックな野生型動物間の交配を1時間以内にセットアップする。朝に点灯した後、魚が交配できるように仕切りを取り除きます。15～30分後、タンクの水をストレーナーに注いで胚を回収し、洗浄ボトルを用いて卵用水を噴射し、100×15 mmのペトリ皿に洗い出します。その後、受精しなかった胚やゴミをピペッティングで取り除き、卵を洗浄します。古い卵水を取り除き、新しい卵水に交換します。水晶体移植の前まで、胚を28.5 °Cのインキュベーターで保存しておくことができます。移植を開始する準備ができたら、手動で卵膜を除去して胚を準備します。金属プローブとピンセットを用いて、脱殻処理を施した胚をカルシウムフリーのZFRに含まれる0.2% EDTA中で30分間インキュベートします。インキュベートしている間に、解剖に必要な針を準備します。移植手順では、水晶体周囲の組織を切り離すための鋭利な針と、アガロース上の胚を移動させるための針が必要です。また、ドナーレンズを移動させてホストに挿入するために、鈍端針（blunt needle）が必要です。まず、ダイヤモンドナイフを使用してパステュールピペットの先端を切り取ります。次に、ガラスキャピラリーをパステュールピペットの先端に挿入し、その長さの約半分が内部に入るようにします。その後、炎を用いて、キャピラリーの開口端に細いタングステン線を慎重に挿入します。ピンセットでガラスを針金の上で加熱して溶かし、ガラス端を金属線でしっかりと保持しながら、針のもう一方の端をひねります。軟化したガラスが金属線を巻き込み、固定されるようにします。これにより、鋭い針を作成するための鈍い針が完成します。タングステン線を炎にかざして1〜1.5分間加熱し、金属を焼き切ります。これにより、非常に微細な先端が形成されます。顕微鏡を用いて先端の品質を確認してください。適切なチップは曲がったり反ったりしておらず、直径50 µm以下の鋭い先端まで滑らかにテーパーがかっている必要があります。2本の針を炎中で数秒間滅菌し、冷却させます。プラスチック製遠心チューブ内で処置を開始する前に、あらかじめウォーターバスで40 °Cに予熱した1.2%低融点 agarose およびカルシウムフリー ZFR を準備します。目的のステージにあるドナー胚をパステールピペットで吸い上げ、agarose の入った遠心チューブ内にゆっくりと排出します。卵を agarose の中で約5秒間インキュベートします。ピペットで胚を取り出し、100 mmポリスチレン製ペトリ皿の上に、ゆっくりと慎重にピペッティングして一列に並べます。ほとんどの胚は、眼が上を向いた状態で横たわります。次に、アガロースが凝固する前に、同様の手順でホスト卵をドナー卵と平行に一列に並べます。アガロースが凝固した後、向きが不適切な胚があれば、鈍針を用いて眼が上を向くように調整してください。0.2%低融点アガロース溶液をオーバーレイします。鋭利な針を用いて、眼の周囲のアガロースを取り除き、ドナー眼全体を非常に慎重に切り出します。切り出された眼は浮上します。次に、眼から水晶体を放出させます。これは、眼組織を針で下から上へ引き抜くことで行います。ホスト個体のみに適用します。鋭利にした針を用いて、小さなストロークで水晶体を取り出します。この際、水晶体を破らないよう、可能な限り水晶体に近づけて切除してください。宿主眼の他の組織を過剰に除去しないように注意してください。レンズが離れると、培地の中で浮遊します。鈍端針を用いて、ドナーレンズを宿主レンズの位置の直上まで慎重に押し上げ、その後、鈍端針で正しい位置まで押し下げます。ホストの水晶体は廃棄しても構いません。ドナーおよびホストの胚を1.2% Arosに30〜60分間静置します。胚培地が創傷治癒を促進します。次に、研いだ金属針を用いて、胚をアガロースから取り出します。胚を胚培養液が入った24ウェルプレートに移します。各胚は個別のウェルに入れてください。レンズの移植完了後に、どのホストがどのドナーに対応しているかが明確になるよう、ウェルに適切にラベルを付けてください。胚を28.5 °Cで目的の時間まで育成させます。表現型の観察については、通常、1〜2日以内にレンズの分化を確認します。ドナー由来の水晶体は、ホストの眼に移植後もGFP発現を維持する必要があります。野生型の環境下で変異体表現型が回復しない場合は、その表現型は自律的（autonomous）であると考えられます。一方、表現型が回復した場合は、非自律的（non-autonomous）であると判断されます。そして、これは根底にある遺伝子の機能に重要な影響を及ぼします。ここでは、ゼブラフィッシュ胚における水晶体の移植方法を説明しました。この手順を行う際は、針の形状作りと、水晶体自体の切り出し方法に細心の注意を払うことが重要です。また、移植完了後に卵が転がる前に、速やかに胚を配置する必要があります。胚をウッドヒーリング内の8つの培地に追加することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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