レンズゼブラフィッシュでの移植とアイ変異体の解析への応用

ゼブラフィッシュの水晶体移植を開始するために、GFP発現トランスジェニック個体（ドナー）と野生型個体（レシピエント）を、カルシウムフリーのゼブラフィッシュリンガー液を入れた別々のペトリ皿で30分間インキュベートします。次に、魚の幼魚を低融点アガロース中で2列に並べて固定します。一方の列（A）をドナー用、もう一方（B）をレシピエント用とします。レシピエントからは水晶体のみを除去し、ドナーからは眼球全体を除去します。

ドナーレンズをホストの眼に配置する前に、ドナーレンズ周囲の組織を除去します。移植後、魚をラベル付きの24ウェルプレートに保管します。移植されたレンズは、ホスト内でGFP蛍光を示すはずです。

当然ながら、ホストの対側眼は手術されておらず、GFPは発現していません。こんにちは、Yjです。そして私はKaya McCulloughです。私たちはハーバード大学医学部眼科のYma Maki博士の研究室に所属しています。本日は、野生型ゼブラフィッシュ（Danio rerio）における水晶体移植の手順をご紹介します。

当研究室では、野生型から変異体へ、あるいはその逆へと水晶体を移植するためにこの手順を用いています。これにより、変異遺伝子が水晶体内で自律的に機能しているか、あるいは非自律的に機能しているかを判断することが可能になります。それでは、始めていきましょう。

ゼブラフィッシュ系統は、28.5 °C、14時間明期・10時間暗期の標準的な魚類飼育施設条件下で維持する。計画している実験の前夜に、オスとメスをタンクに入れ、仕切りで互いを隔てておく。これらの魚の遺伝子型は、GFP発現および目的の変異を持つ子孫を生じさせるものである必要がある。並行して、同様の手順を用いて、非トランスジェニックな野生型動物間の交配を1時間以内にセットアップする。

朝に点灯した後、魚が交配できるように仕切りを取り除きます。15～30分後、タンクの水をストレーナーに注いで胚を回収し、洗浄ボトルを用いて卵用水を噴射し、100×15 mmのペトリ皿に洗い出します。その後、受精しなかった胚やゴミをピペッティングで取り除き、卵を洗浄します。

古い卵水を取り除き、新しい卵水に交換します。水晶体移植の前まで、胚を28.5 °Cのインキュベーターで保存しておくことができます。移植を開始する準備ができたら、手動で卵膜を除去して胚を準備します。

金属プローブとピンセットを用いて、脱殻処理を施した胚をカルシウムフリーのZFRに含まれる0.2% EDTA中で30分間インキュベートします。インキュベートしている間に、解剖に必要な針を準備します。移植手順では、水晶体周囲の組織を切り離すための鋭利な針と、アガロース上の胚を移動させるための針が必要です。

また、ドナーレンズを移動させてホストに挿入するために、鈍端針（blunt needle）が必要です。まず、ダイヤモンドナイフを使用してパステュールピペットの先端を切り取ります。次に、ガラスキャピラリーをパステュールピペットの先端に挿入し、その長さの約半分が内部に入るようにします。その後、炎を用いて、キャピラリーの開口端に細いタングステン線を慎重に挿入します。

ピンセットでガラスを針金の上で加熱して溶かし、ガラス端を金属線でしっかりと保持しながら、針のもう一方の端をひねります。軟化したガラスが金属線を巻き込み、固定されるようにします。これにより、鋭い針を作成するための鈍い針が完成します。

タングステン線を炎にかざして1〜1.5分間加熱し、金属を焼き切ります。これにより、非常に微細な先端が形成されます。顕微鏡を用いて先端の品質を確認してください。

適切なチップは曲がったり反ったりしておらず、直径50 µm以下の鋭い先端まで滑らかにテーパーがかっている必要があります。2本の針を炎中で数秒間滅菌し、冷却させます。プラスチック製遠心チューブ内で処置を開始する前に、あらかじめウォーターバスで40 °Cに予熱した1.2%低融点 agarose およびカルシウムフリー ZFR を準備します。目的のステージにあるドナー胚をパステールピペットで吸い上げ、agarose の入った遠心チューブ内にゆっくりと排出します。卵を agarose の中で約5秒間インキュベートします。

ピペットで胚を取り出し、100 mmポリスチレン製ペトリ皿の上に、ゆっくりと慎重にピペッティングして一列に並べます。ほとんどの胚は、眼が上を向いた状態で横たわります。次に、アガロースが凝固する前に、同様の手順でホスト卵をドナー卵と平行に一列に並べます。アガロースが凝固した後、向きが不適切な胚があれば、鈍針を用いて眼が上を向くように調整してください。

0.2%低融点アガロース溶液をオーバーレイします。鋭利な針を用いて、眼の周囲のアガロースを取り除き、ドナー眼全体を非常に慎重に切り出します。切り出された眼は浮上します。次に、眼から水晶体を放出させます。

これは、眼組織を針で下から上へ引き抜くことで行います。ホスト個体のみに適用します。鋭利にした針を用いて、小さなストロークで水晶体を取り出します。この際、水晶体を破らないよう、可能な限り水晶体に近づけて切除してください。

宿主眼の他の組織を過剰に除去しないように注意してください。レンズが離れると、培地の中で浮遊します。鈍端針を用いて、ドナーレンズを宿主レンズの位置の直上まで慎重に押し上げ、その後、鈍端針で正しい位置まで押し下げます。

ホストの水晶体は廃棄しても構いません。ドナーおよびホストの胚を1.2% Arosに30〜60分間静置します。胚培地が創傷治癒を促進します。

次に、研いだ金属針を用いて、胚をアガロースから取り出します。胚を胚培養液が入った24ウェルプレートに移します。各胚は個別のウェルに入れてください。

レンズの移植完了後に、どのホストがどのドナーに対応しているかが明確になるよう、ウェルに適切にラベルを付けてください。胚を28.5 °Cで目的の時間まで育成させます。表現型の観察については、通常、1〜2日以内にレンズの分化を確認します。

ドナー由来の水晶体は、ホストの眼に移植後もGFP発現を維持する必要があります。野生型の環境下で変異体表現型が回復しない場合は、その表現型は自律的（autonomous）であると考えられます。一方、表現型が回復した場合は、非自律的（non-autonomous）であると判断されます。

そして、これは根底にある遺伝子の機能に重要な影響を及ぼします。ここでは、ゼブラフィッシュ胚における水晶体の移植方法を説明しました。この手順を行う際は、針の形状作りと、水晶体自体の切り出し方法に細心の注意を払うことが重要です。

また、移植完了後に卵が転がる前に、速やかに胚を配置する必要があります。胚をウッドヒーリング内の8つの培地に追加することを忘れないでください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。