Name: 定位空間における非ヒト霊長類の脳を解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ定位空間における非ヒト霊長類の脳解剖法。ステレオタクシックフレームを用いてコロナルスライスを作成し、脳を計測・凍結保存する手法を解説。神経科学や脳機能研究における応用価値を示します。

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著者は、彼の継続的な技術サポートのためにIkiel Ptitoに感謝します。 MPにNSERC助成金。

パート1：組織の前処理<ol><li>組織はよくパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。これは通常、他の臓器を収穫するために使用される標準transcardial灌流によって達成することができます。完全にexsanguinated.Thisが続いされるまで本研究では被験者は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静したペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、0.1MのPBSでtranscardially灌流5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液で。 </li></ol>パート2：固定装置ブロッキング<ol><li>前の定位フレームにヘッドを配置するHorsley-Clarke/interaural面のゼロの座標は、注意が必要です。これは耳の間に理論上の中間点です。この平面を測定するには、耳のバーが同じように装置に装着する必要がある、そして定位マニピュレータのアームで手術用メスの刃を配置し、耳の棒の間に中間点を測定する。これは、研究のニーズに基づいて組織をブロックする場所を決定するために重要です。これが完了すると頭蓋骨は、定位固定装置に固定のために準備する必要があります。 </li><li>定位フレームに頭部を置くために下顎は骨Rongeursとメスで削除する必要があります。さらに皮膚、筋肉、および結合組織は、頭蓋骨を露出させるために削除する必要があります。結合組織が頭蓋骨から削除されると、頭蓋冠を（後頭骨の表形式の部分だけでなく、頭頂葉、広告前頭葉の骨）離れ​​てチッピングすることにより、脳を公開。頭蓋冠の本実験の一部ではすべての準備は削除されました。外耳道は、定位フレームに頭部を置くためにそのままにする必要があるので完全に頭の骨を削除しないように注意してください。残りの硬膜を露出脳から削除する必要があります。頭蓋骨は今定位フレームに配置する準備が整いました。 </li><li>一定位手術を行うというのと同じ方法で、頭がしっかり定位固定装置に固定されているような眼、口蓋、およ​​び耳のバーを調整します。所定前方/後方（/ P）の座標に定位マニピュレータを配置し、脳の外側面にマニピュレータを移動する。徐々に完全にして内側に移動し、再度ブレードを下げ、脳からのブレードを高める、脳内にブレードを下げる。ブレードは、反対半球の外側面に達するまで、これらの2つの手順を繰り返します。これは、最初の冠状ブロックが完成。脳全体がブロックされるまで、後続のコロナのブロックに対して/ Pの軸と繰り返しでマニピュレータの1センチメートルを移動する。 </li></ol>パート3：頭蓋骨から脳を削除する<ol><li>定位フレームからヘッドを取り外して、あなたの手のひらの上で露出脳を開催。軽くcoddling手のひらサイズの脳を配置することにより、脳を保護すると、前頭葉全体で頭蓋骨の脳のこの最小限に抑える動きをして小指を配置してください。脳の軟膜表面の乾燥を防ぐために、PBSの一部が脳全体にガーゼを湿らせた置きます。しっかりと脊柱と一緒に頭蓋骨とチップ離れて、残りの後頭部や側頭骨で頭をホールド。これは、脳の基底部と外側の側面を公開します。最後に、嗅球へのアクセスを許可する任意の残りの前頭骨と鼻の骨を、削除してください。あなたが頭蓋底を削除すると、脳がわずかに動くと前頭葉が源泉の骨のギザギザのエッジに損傷を受けることができるので、それは最後の前頭骨を除去することが重要である。切り取ると、残りの硬膜を除去。慎重に、脳と頭蓋骨から無料の脳の下にメスをスライドさせ、脳の前部を持ち上げ。 </li></ol>パート4：測定<ol><li>前に凍結させることができる便利な測定値の数があります。キャリパーと脳の例については、A / P軸。さらに、特定の密度は、体積変位（表1）で重量を割った後、メスシリンダー中の水の変位による体積を測定し、脳の重量を量ることによって測定することができます。 </li></ol>パート5：脳をブロック終了。 <ol><li>手術用メスの刃が脳内に挿入されたときに、通常、それは完全に脳の完全な背腹範囲に浸透するのに十分な長さがありません。脳が削除され、総測定値を取得すると、組織スライス刃を取ると脳の腹側（図2）に至るまで、脳をブロック終了。 </li><li>ブロックを凍結する前に、それは脳のシンクまで4˚Cで維持傾斜PBS -バッファショ糖溶液（10、20、および30％）で組織をcryoprotectする必要があります。それは、通常、容器の底に沈むためにブロックの30％で10％、20％で2〜3日と追加の3-5日で一晩インキュベーションを取ります。番目の日々の変化E 30％ショ糖溶液をお勧めします。 </li></ol>パート6：代表的な結果脳が頭蓋骨から削除されている回だけ行うことができます総形態的測定値の数があります。これらは、/ Pの長さ、重量、および特定の密度を（表1）が含まれます。我々は一般的に1CM（図1）を測定する6〜7ブロックに脳をブロックする。各ピースを撮影される（図2）と、さらなる研究の必要性に応じて解剖したり、段階的なショ糖溶液中で凍結のために調製することができる。 <table border="1"><tbody><tr><td> 対象と </td><td> / Pの長さ （㎜） </td><td> 重さ （グラム） </td><td> 水置換 （ml）を </td><td> 特定の密度 （g / mlの） </td></tr><tr><td> O2303 - 2 - 1 - 1 </td><td> 64.3 </td><td> 28.1 </td><td> 24 </td><td> 1.171 </td></tr><tr><td> O5180 - 1 </td><td> 71.3 </td><td> 38.7 </td><td> 34 </td><td> 1.138 </td></tr><tr><td> O2708 - 3 - 1 </td><td> 62.8 </td><td> 28.7 </td><td> 26 </td><td> 1.104 </td></tr><tr><td> O9184 - 4 - 2 </td><td> 65.3 </td><td> 29.5 </td><td> 24 </td><td> 1.229 </td></tr><tr><td> N459 - 1 - 14 - 2 </td><td> 68.2 </td><td> 31.6 </td><td> 26 </td><td> 1.215 </td></tr><tr><td> AVERAGE </td><td> 66.38 </td><td> 31.32 </td><td> 26.8 </td><td> 1.171 </td></tr><tr><td> STD DEV </td><td> 3.38 </td><td> 4.33 </td><td> 4.17 </td><td> 0.052 </td></tr></tbody></table> 表1 5月旧Vervetsの右半球の総形態学的測定<img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig1.jpg" alt="図1" /> <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig2.jpg" alt="図1.5" /> 図1。脳をブロックするために使用される冠状面の回路図。これは、外部化された成人のベルベット脳の例です。ブロッキング手順の例。ここに縦の線は、通常、それぞれの半球から7冠状ブロックを生成する、1センチメートルで離間している。 <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig3.jpg" alt="図2" /> 図2。定位空間における脳組織のブロックは、各ブロックは、50μmので撮影した約200のセクションが得られます。冠状面でスライスしたときにこのサンプリング方式と皮質を介して1200以上のセクションは、小脳から取られ、追加の400から500になります。

<ol><li>Gallagher, M., Rapp, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+animal+models+to+study+the+effects+of+aging+on+cognition.+Annu+Rev+Psychol+48%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48.</a> , 339-370 (1997).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
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<li>Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+abeta+vaccine+reduces+central+nervous+system+abeta+levels+in+a+non-human+primate%2C+the+Caribbean+vervet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet.</a> Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).</li>
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</ol>

著者らに開示すべき事項はありません。

セントキッツベルベットモンキー（Chlorocebus aethiops sabeusは ）人間のように皮質と皮質下の脳の発達の類似したパターンと速度と旧世界霊長類です。この種は、不安な動作のような複雑な人間の行動障害、高血圧症8、大脳半球切除術9、パーキンソン病10、Alzhemier病11、およびアルコールの乱用12をモデル化するために使用されています。さらに最近では、この種は自然出生前のエタノール曝露の神経解剖学的効果を研究するために使用されています。妊娠vervetsは、妊娠後期の間に4回、週3-5標準的な飲み物と同等のものを飲むことを許可され、我々は、前頭皮質13の神経細胞の35％の削減があることを報告していた。この研究のための脳は、定位だけ3〜7のブロックは、前頭皮質の立体的な評価を完了するには、切片にする必要があったようにブロックされていました。この特定の技術は、ヒト以外の霊長類の脳に限定されるものではなく、同様に齧歯類の脳に拡張することができます。ラットの体性感覚野は、関心...

<table><tbody><tr><td>メス</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>メス刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>任意の外科用はさみで十分である</td></tr><tr><td>ロンジュール</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>ろ紙</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織切断用ブレード</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定位空間における非ヒト霊長類の脳を解剖

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

ヒト以外の霊長類の使用は、ヒトの発達と老化の理解のための優秀な翻訳モデルを提供<sup&gt; 1月6日</sup&gt;。さらに、ヒト以外の霊長類の使用は最近、自然にそのようなアルコールの乱用などの複雑な精神疾患をモデル化する機会を与えている<sup&gt; 7</sup&gt;。ここでは、ベルベットモンキーの冠状面で脳をブロックするための手法を記述する（<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;）定位空間にそのまま頭蓋骨インチここで説明する方法はブロックと対象とブロックの間を最小限に抑えるの部分のセクションの間にセクションの標準的な平面を提供します。冠状面での組織のブロックの切削することも関心の領域の線引きを容易にします。 50μmの時にスライスするときにベルベットモンキーの単一の半球は、1200以上のセクションをもたらすので、このメソッドは、管理可能なサイズのブロックを提供します。さらに1センチメートルブロックに脳をブロックすることによって、それはcyroprotectionためにショ糖の浸透を容易にし、ブロックが標準的なクライオスタットにスライスすることができます。

ヒト以外の霊長類は脳の正常な処理の理解のための重要な並進種です。霊長類の脳の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することができます。

非ヒト霊長類の使用は、ヒトにおける発達および老化プロセスの理解において優れたトランスレーショナルモデルとなる1-6。...

本手順は、十分に灌流されたサルの頭部から開始します。頭蓋蓋を除去した後、頭部を脳定位固定装置に設置し、マニピュレーターアームを用いて一連の定位冠状断切片を作成します。その後、脳を取り出して測定し、凍結保護処理を行います。こんにちは、モントリオール大学視能訓練学校視覚神経科学研究室のマーク・バーク博士です。私はモントリオール大学視能訓練学部、視覚神経科学研究室のShaheen Zurです。私はモントリオール大学視能訓練学部、視覚神経研究室のディレクター、Mo Pettoです。本日は、非人間類猿類の脳を定位立体座標空間で固定する手順について解説します。当研究室では、正常な発達過程および発達への侵害に対する反応における脳組織のさまざまな側面を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。このプロトコルは、ベルベットモンキーの安楽死、固定、および断頭後から開始します。脳を摘出する前に、脳定位固定装置を準備する必要があります。まず、Horsley Clark Interoral planeのゼロ点、すなわち両耳の間の理論的な中間点の座標を特定します。この平面を測定するには、イヤーバーを装置に均等に装着してください。次に、ステレオタキシス操作アームにメス刃を装着し、イヤーバー間の中心点を測定します。続いて、頭部をステレオタキシスフレームに固定するための準備を行います。骨剪刀とメスを使用して、下顎を除去します。ここから、以降のステップを通じて、残っている頭蓋冠を少しずつ除去します。側頭骨は、頭部を脳定位固定装置に固定する際に外耳道が必要となるため、除去しないよう注意してください。ピンセットと剪刀を用いて、露出した脳から視認できる硬膜を慎重に切り取り除きます。これで頭蓋骨を脳定位固定装置にセットする準備が整いました。脳の定位固定を開始するには、頭部をフレームに固定し、定位手術と同様にアイパレットとイヤーバーを調整します。定位固定装置を、あらかじめ決定した前方、後方、またはAP軸に配置します。脳のブロッキングを開始します。マニピュレーターを脳の左端または右端に配置し、ブレードを下げて最初の切断を行います。ブレードは脳の正中線に対して垂直になり、冠状面で切断します。ブレードを上げ、脳表面から完全に離します。次に、内側に移動して最初の切開線にわずかに重なる位置まで動かし、ブレードを下げます。これを繰り返します。脳の反対端に達するまで、切開を重ねて継続してください。これで最初の冠状断ブロックが完了します。マニピュレーターをAP軸に沿って1cm前方または後方に移動させ、前回の切断と平行に冠状面でもう一連の切断を行います。脳全体がブロックされるまで、この操作を繰り返します。切断作業が完了したので、頭蓋骨から脳を取り出します。まず、固定器具から頭部を取り出してください。脳が頭蓋骨の中で揺れて損傷しないよう、手のひらで軽く包み込むようにして脳を固定してください。脳の剥離面の乾燥を防ぐため、前頭葉に小指を添えます。ガーゼをPBSで湿らせ、脳の上に被せます。頭蓋骨をしっかりと保持して頭部を固定し、残りの後頭骨と側頭骨、および脊柱を削り取ります。これにより、脳の底面と側面が露出します。次に、残りの硬膜を除去します。最後に、鼻骨および前頭骨の残りの部分を除去すると、嗅球へのアクセスが可能になります。前頭骨を除去することが重要です。最後に、頭蓋底を除去する際に脳がわずかに移動するため、前頭骨のギザギザした縁が前頭葉を損傷させる可能性があるためです。残っている硬膜を慎重に取り除き、脳の前方を持ち上げ、メスを脳の下に滑り込ませて脳を頭蓋骨から切り離します。切開刃が腹側まで完全に届かないため、茎の部分を切り裂いたタマネギのように、脳はまとまった状態になります。脳を凍結させる前に、有用な測定項目がいくつかあります。まず、キャリパーを用いて脳のAP軸を測定します。次に、脳の重量を量り、比重を求めます。その後、メスシリンダー内での排水量により体積を測定します。これで、密度（質量÷体積）が求められました。脳全体の測定が完了したので、脳の腹側で固定されている個々の組織ブロックを切り離し、凍結準備を行います。組織切断用ブレードを使用し、脳の腹側から切り込みを入れて各ブロックを切り離してください。ノギスを使用して、内側、外側、および前後方向のAEを測定できます。これで、脳ブロックを凍結保護し、凍結させる準備が整いました。以上で、非人間霊長類の脳を立体定位空間でブロックする方法について説明しました。この手順を行う際は、ステレオタキシスマニピュレーターで内外側へ動かす前に、ブレードを完全に後退させることが重要です。また、脳から骨を削り取る際は、ERで皮質を傷つけないよう注意してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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