gentleMACS Dissociatorを使用してマウスの肺組織からの単細胞懸濁液の標準化の準備

このビデオプロトコルでは、肺組織の解離に続く穏やかな最大を使用して成体マウスの肺組織を解離する方法を見ていきます。コラゲナーゼdおよびDNAasの存在下で、1つの細胞懸濁液を70ミクロンの細胞ストレーナー遠心分離機を使用してろ過し、さらなるアプリケーションのために懸濁します。こんにちは、ドイツのMil BiotechのMelanie Mluです。

今日は、GenX解離を使用してマウス肺組織から単一細胞懸濁液を調製するための再現性のある自動化された手順を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、白血球または内皮細胞を調製するための単一細胞懸濁液を調製します。では、始めましょう。

プロトコルを開始する前に、いくつかの標準的な溶液を準備し、準備を整えておく必要があります。まず、ヘーベスバッファーが必要になります。次に、100ミリグラム/ミリリットルの酵素とヘベスバッファーを含むコラゲナーゼD溶液です。

第三に、ミリリットルあたり20, 000単位を含むダーゼ1溶液。最後に、2つの一般的なバッファリングソリューション。pH 7.2の一般的なPBSバッファーと、AutoMaxリンス溶液とBSAストック溶液に由来するPEBバッファー。

プロトコールは、生後6〜7週齢の雌生検マウスに由来する解剖された肺から始めます。肺に心臓や胸腺、遠心性血管と求心性血管、気管、結合組織などの隣接する臓器がないことを確認してください。PBSを含むシャーレで組織をすすぎ、赤血球を除去します。

通常、この年齢のマウスの肺の重さは110〜150ミリグラムです。高齢の動物や他のマウス系統の肺を関連付ける予定がある場合は、組織と緩衝液の重量を量ります。1本のチューブで最大450ミリグラムの組織を解離できます。

肺組織を、4.9ミリリットルのハイスバッファーを充填した穏やかな最大Cチューブに移します。100マイクロリットルのコラゲナーゼD溶液を、肺組織および緩衝液の最終濃度2ミリグラム/ミリリットルまで添加します。今10マイクロリットルのdase。

150ミリグラム以上の組織に対応する1つのソリューション。20マイクロリットルのDASE 1つの溶液を追加します。Cチューブがしっかりと閉じていることを確認し、逆さまにして穏やかな最大ディスの上に置きます。

組織がローターとステーターの間にあることを確認してください。肺プログラムを選択し、プログラムが終了したらスタートボタンを押して実行します。Cチューブを装置から取り外し、サンプルを30分間インキュベートします。

インキュベーション中の摂氏37度のインキュベーターでは、最大混合チューブローテーターを使用してチューブを回転させるか、5分ごとに手動で回転させる必要があります。インキュベーション後、Cチューブを穏やかな最大アソシエーターに戻し、2番目の肺プログラムを実行します プログラムが実行されている間に、キャップを70マイクロメートルのメッシュセルストレーナーに交換して、ろ過された細胞を収集するための50ミリリットルのチューブを準備します。解離プログラムが終了したら、チューブ内のサンプル材料の分布によっては、チューブを短時間遠心分離してサンプル材料を濃縮することができます。

解離した細胞は、Cチューブのセプタムシールキャップを介してピペッティングすることにより、チューブから除去できます。適切な1000マイクロリットルのピペットチップを使用して、細胞懸濁液を細胞ストレーナーに塗布し、より大きな粒子または凝集体を除去します。溶液が排出されたら、ろ過された細胞をペレット化するために、さらに5ミリリットルの室温およびhees緩衝液を追加して細胞ストレーナーを洗浄します。

50ミリリットルのチューブを300GSで10分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、細胞ペレットを希望の室温で再懸濁します。PEBバッファー。

上清をデカントしないでください。これで、ダウンストリームアプリケーションに進むことができます。この手順を用いてマウス肺組織を解離すると、生存可能な白血球および内皮細胞の割合が高くなります。

得られたシングルセル懸濁液をCD 45 PEでCD1 46 FITCまたはCD31 FITCとして染色し、フローサイトメトリーで分析しました。このプロットは、CD 11 C マイクロビーズ、ミニマックスセパレーター、および 2 つの MS カラムを使用した樹状細胞の濃縮を示しています。大丈夫です。私はちょうど、穏やかな混合解離とCチューブを使用して、標準化された方法でマウス肺組織から単一細胞懸濁液を調製する方法を示しました。

この方法により、効率的で遺伝子組織の解離が可能になります。この手順を行うときは、肺を適切に解剖し、解剖直後に組織を処理することが重要です。調製したシングルセル懸濁液は、その後の実験に使用できます。

例えば、細胞の磁気標識、次いで白血球または内皮細胞の分離などです。さて、これで完了です。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。