Name: マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶマウス脳組織の単細胞懸濁液調製法。gentleMACS Dissociatorを用いて細胞生存性と表面タンパク質を保持し、神経科学・細胞生物学研究で正確な細胞分離と解析を可能にする標準化プロトコルを解説する。

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無菌条件下で動作するように、それは層流フード内のすべての手順を実行することをお勧めします。 1。材料<ul><li>神経組織解離キット（P）（コンポーネント：解決策1,2、3、4、記憶バッファー） </li><li>プレセパレーションフィルター</li><li> （オプション）ミエリンの除去ビーズ</li><li> β-メルカプトエタノール</li><li> gentleMACS Dissociator </li><li> Cチューブ</li><li> MACSmixチューブローテーター</li><li> HBSS（W / O） </li><li> HBSS（W） </li></ul><ol><li>プロトコルを開始する前に以下のソリューションを準備します。 <ol><li>二価カチオンのないハンクスバッファード塩類溶液のCa 2 +又はMg 2 +（HBSS（W / O） </li><li> HBSS、標準、すなわちカルシウム2 +およびMg 2 +（HBSS（W） </li></ol></li><li>その後のアプリケーションへの関心の抗原エピトープに応じて、パパインベースの神経組織解離キット（P）またはトリプシンベースの神経組織解離キット（T）のどちらかを使用してください。 </li><li>神経組織解離キットから次の解決策を準備します。 <ol><li>解決策2：0.067 mMのβ-メルカプトエタノールを加える</li><li>ソリューション4：0.7 mlの記憶バッファー（キットに付属）で粉体を溶解、静かに（ボルテックスしないでください）​​ミックス</li><li>酵素ミックス1：Cチューブと10〜15分間インキュベートピペット1.9mLの溶液2と50μlの溶液1（キットからの両方）で37℃これは、脳組織の400mgを解離するのに十分です。 </li></ol></li></ol> 2。神経組織を解離<ol><li> 1 mlのHBSSを（W / O）を含むチューブで脳組織を秤量</li><li>予熱酵素ミックス1 1950μLを含むCチューブにマウスの脳を転送する。 （注：このプロトコルは≤400 mgのために書かれていますが、ソリューションのボリュームがCチューブあたりの脳組織の1600 mgまで対応するようにスケーリングすることができます） </li><li> gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_01"にCチューブを置きます。 </li><li> 37℃で15分間回転（MACSmixチューブローテーターを用いて、4回転）でインキュベート℃に</li><li> gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_02"にCチューブを置きます。 </li><li>解離のステップの間に静かに解決策3とソリューション4を10μl20μlを混合することによって組織の400 mg当たりの酵素ミックス2の30μlを用意する。 </li><li>セプタムシールキャップを介してCチューブに酵素ミックス2を添加し、ボルテックスすることなく静かに混ぜる。 </li><li> 37℃で10分間回転でCチューブをインキュベートしますインキュベーターでC。 </li><li> gentleMACSのDissociatorと、実行プログラム"m_brain_03"にCチューブを置きます。 </li><li> 37℃で10分間回転でCチューブをインキュベートしますインキュベーターでC。 </li><li>チューブの下部に表示されているサンプルを収集するためにスピンダウンする。 </li></ol> 3。ろ過<ol><li>目的の細胞への通過を許可するフィルタが十分な大きさを選択します。例えば、プルキンエ細胞が30μmのフィルターを通過するには大きすぎるが、プロミニン- 1 +細胞はなります。 </li><li>細胞を除去するsuitable1000μlをピペットを使用するには、セプタムシールキャップを介してCチューブを形成し、15 mlのコレクションチューブにプレセパレーションフィルターに適用します。 （注：より大きなサンプルサイズが50 mlのコレクションチューブを使用するため）。 </li><li> HBSS（w）の10mlでフィルターを洗浄してください。 </li><li>室温で10分間、300 xgでフィルタリングされた細胞を遠心分離します。 </li><li>その後のアプリケーションのための選択のあなたの培地または緩衝液の上澄みを再懸濁します。 </li><li>ミエリンの残骸を削除するには、ミエリンの除去のビーズを使用してください。 </li></ol> 4。代表的な結果：図1-3を参照してください<img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="図1"> 図。 gentleMACS Dissociatorと1脳の解離は、フローサイトメトリー解析で示すように、97％生存細胞をもたらした。 <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="図2"> 図。ニューロスフェア形成の2ライト顕微鏡画像は、磁気細胞選別後MACSでの栽培の7日後に抗プロミニン- 1 MicroBeadsを使用して® NeuroMediumはMACSサプリメントB27 PLUSで補足。細胞は、神経組織解離キット（P）を使用して、CD1マウスの脳（P3）から調製した。 <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="図3.5"> 図。単細胞懸濁液の3ミエリンの破片は、かなりの細胞分離を損なう、とミエリンの除去ビーズによるミエリン破片の除去は、効率の細胞分離を向上させます。抗プロミニン- 1 MicroBeadsを用いてMACS分離のために、P22マウス脳では神経組織解離キット（P）を用いて解離。単一細胞の懸濁液からの細胞を直接分離のために使用された、またはミエリン削除ビーズを使用して枯渇してミエリンに提出された。ミエリンの除去なしとの試料からの分離を比較すると、純度が以前のミエリンの除去と試料のために高いことを示しています。

<ol><li>Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li>
<li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li>
<li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li>
<li>Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
</ol>

著者らは、ミルテニーバイオテク社、ドイツの従業員です。

gentleMACS Dissociatorは閉鎖系での神経組織から単細胞懸濁液の標準化の準備を容易にします。神経組織の解離のキットはimmunostainingsと免疫磁気細胞分離1から5のような、さらにアプリケーションに必要な抗原のエピトープを保持するために最適化されています。このプロトコルでは、97％生存細胞に降伏、gentleMACS Dissociatorと神経組織解離キット（P）を使用してマウスの脳の穏やかな酵素的解離を示す。宿主組織の年齢に応じて、5 × 10 6と1 × 10 7細胞、間に神経組織の収量100 mgの。標的プロミニン- 1 +細胞は、抗プロミニン- 1 MicroBeadsを用いて単離し、その後、文化に取り込まれた。プロトコルは、マウス&gt; P7由来の神経組織で作業するときミエリン除去ビーズの追加使用でさらに効果的であることが示されている。

<table><tbody><tr><td>Cチューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>製品番号 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; スターターキット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>製品番号 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; チューブローテーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>製品番号 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>神経組織解離キット (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>製品番号 130-092-628</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>分離前フィルター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>注文番号 130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>注文番号 130-092-333</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>製品番号 130-092-335</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Myelin Removal Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>注文番号 130-094-544</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 Reach ピペットチップ </td><td>Molecular BioProducts</td><td>注文番号 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;無菌条件下で作業するため、すべての工程をラミナーフローフード内で行うことを推奨します。

1. 材料
Neural Tissue Dissociation Kit (P)（構成品：溶液1、2、3、4、ストレージバッファー）
分離前フィルター（オプション）
Myelin Removal Beads
gentleMACS Dissociator
Cチューブ
MACSmixチューブローテーター
HBSS (w/o)
HBSS (w)

プロトコルを開始する前に、以下の溶液を調製します。
二価陽イオン（Ca2+またはMg2+）を含まないハンクス平衡塩類溶液（HBSS (w/o)）
標準的なHBSS（Ca2+およびMg2+を含む、HBSS (w)）
後続のアプリケーションで目的とする抗原エピトープに応じて、パパインベースのNeural Tissue Dissociation Kit (P)またはトリプシンベースのNeural Tissue Dissociation Kit (T)のいずれかを使用します。

Neural Tissue Dissociation Kitを用いて以下の溶液を調製します。
溶液2：β-メルカプトエタノールを添加し、最終濃度を0.067 mMにする。
溶液4：粉末を0.7 mlのストレージバッファー（キットに付属）に溶解し、緩やかに混合する（ボルテックス不可）。
Enzyme Mix 1：Cチューブに溶液2を1.9 mL、溶液1（いずれもキットのもの）を50 μl分注し、37 °Cで10～15分間インキュベートする。これで400 mgの脳組織を解離させるのに十分な量となる。

2. 神経組織の解離
1 mlのHBSS (w/o)を含むチューブ内で脳組織の重量を量る。
マウスの脳を、予め加温した1950 μLのEnzyme Mix 1が入ったCチューブに移す。（注：本プロトコルは400 mg以下を対象に記載しているが、溶液量はCチューブ1本あたり最大1600 mgの脳組織まで対応できるようスケールアップ可能である）
CチューブをgentleMACS Dissociatorに設置し、プログラム「m_brain_01」を実行する。
MACSmixチューブローテーターを用いて、回転（4 rpm）させながら37 °Cで15分間インキュベートする。
CチューブをgentleMACS Dissociatorに設置し、プログラム「m_brain_02」を実行する。
解離ステップの間に、溶液3を20 μlと溶液4を10 μl緩やかに混合し、組織400 mgあたり30 μlのEnzyme Mix 2を調製する。
セプタム付きキャップを介してEnzyme Mix 2をCチューブに加え、ボルテックスせずに緩やかに混合する。
インキュベーター内で、回転させながら37 °Cで10分間インキュベートする。
CチューブをgentleMACS Dissociatorに設置し、プログラム「m_brain_03」を実行する。
インキュベーター内で、回転させながら37 °Cで10分間インキュベートする。
短時間遠心し、サンプルをチューブ底に回収する。

3. ろ過
目的の細胞が通過できる十分な大きさのフィルターを選択する。例えば、プルキンエ細胞は30 μmのフィルターを通過するには大きすぎるが、Prominin-1陽性細胞は通過する。
適切な1000 μlピペットを用いて、セプタム付きキャップからCチューブ内の細胞を回収し、15 ml回収チューブにセットした分離前フィルターに適用する。（注：サンプル量が多い場合は、50 ml回収チューブを使用すること）
10 mlのHBSS (w)でフィルターを洗浄する。
ろ過した細胞を、室温で300 x g、10分間遠心分離する。
上清を、後続のアプリケーションに適した任意の培地またはバッファーで再懸濁する。
髄鞘の破片を除去するには、Myelin Removal Beadsを使用する。

4. 代表的な結果：図1～3を参照
図1：フローサイトメトリー分析の結果、gentleMACS Dissociatorを用いた脳組織の解離により、細胞生存率97%が得られた。
図2：Anti-Prominin-1 MicroBeadsを用いた磁気細胞分離後、MACS Supplement B27 PLUSを添加したMACS® NeuroMediumで7日間培養した後のニューロスフィア形成の光学顕微鏡写真。細胞はNeural Tissue Dissociation Kit (P)を用い、CD1マウスの脳（P3）から調製した。
図3：単一細胞懸濁液中の髄鞘破片は細胞分離を著しく妨げるため、Myelin Removal Beadsによる髄鞘破片の除去は細胞分離効率を向上させる。Anti-Prominin-1 MicroBeadsを用いたMACS分離において、P22マウスの脳をNeural Tissue Dissociation Kit (P)を用いて解離させた。単一細胞懸濁液から得られた細胞を、そのまま分離に使用したものと、Myelin Removal Beadsを用いて髄鞘除去を行ったものと比較したところ、事前に髄鞘除去を行ったサンプルの方が純度が高いことが示された。&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>神経組織解離キット (T)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>製品番号 130-093-231</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>プロピジウムイオダイド溶液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>製品番号 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

神経系の中で、神経細胞およびグリア細胞の数百種類が記載されている。脳または脊髄内の各特定の細胞型は、細胞表面分子、またはそれを特定して特徴付けることができるような分子決定因子、のレパートリーを持っています。現在のところ、堅固な細胞の同定と分離技術は、同時に特徴的な表面タンパク質の細胞死と破壊を制限しながら、生成される単一セルの準備が必要です。抗原のエピトープを保持し、細胞の損失を制限しながら、トリプシンやパパインベースの解離キットと組み合わせて使用​​されるgentleMACS Dissociatorは、効果的かつ穏やかに脳組織を切り離すことができます。単一の細胞懸濁液の標準化された製剤は、Cチューブと最適化された、プリセットgentleMACSプログラムを使用して実現されます。一度生成された、単細胞懸濁液は、神経前駆細胞を識別する、またはミエリンの除去のビーズを使用してさらに精製した抗プロミニン- 1マイクロビーズのようなモノクローナルコンジュゲートで治療することができます。

特定の組織型から解離し細胞が組織aggitationのための特定のパラメータは、実行可能な、培養可能な細胞の大量を取得する必要があります。ミルテニーgentleMACS Dissociatorは、シンプルで実用的なプロトコルを使用してこのタスクを最適化します。本書ではnerual組織でこの装置の使用は説明されています。

神経系内では、数百種類のニューロンおよびグリア細胞が記載されています。脳または脊髄における各特定の細胞型は、...

神経系内には、数百種類の神経膠細胞（グリア細胞）が報告されています。脳または脊髄における各特定の細胞型は、それらを識別し特性評価することを可能にする細胞表面分子または分子決定因子のレパートリーを有しています。現在、堅牢な細胞同定および分離技術には、細胞死や特性表面タンパク質の破壊を同時に抑制しつつ、単一細胞調製を作成することが求められています。GentleMACS Associatorをトリプシンまたはペプサインベースの解離キットと組み合わせて使用することで、細胞損失を抑えながら、抗原エピトープを保持しつつ脳組織を効果的かつ緩やかに解離させることができます。作成された単一細胞懸濁液は、神経前駆細胞を同定するanti-Prominin-1 microbeadsなどのモノクローナル抗体コンジュゲートを用いて処理したり、myelin removal beadsを用いてさらに精製したりすることが可能です。こんにちは、Sandra PeNATです。私はドイツの baggage Gabert にある Mil Biotech で、神経科学製品のプロジェクトマネージャーを務めています。本日は、genix dis associator を使用して、マウスの脳組織から単一細胞懸濁液を調製する方法をご紹介します。Genix Dis Associatorは、密閉された無菌環境下でさまざまな組織型を解離させることができる装置であり、煩雑な手動による機械的解離の必要性を排除します。それでは、手順を開始しましょう。後続のアプリケーションで目的とする抗原エピトープに応じて、パパインベースの神経組織解離キットまたはトリプシンベースの神経組織解離キットのいずれかを使用してください。本日の実験では、anti prominent one マイクロビーズを用いて主要な陽性細胞を単離するため、neuro tissue dissociation kit P を使用します。Prominent one はペプシンおよびトリプシンのいずれに対しても感受性を持たないため、このような場合には neuro tissue dissociation kit P がより適切な選択肢となります。プロトコルを開始する前に、本キットに使用する試薬および溶液を調製しておく必要があります。カルシウムおよびマグネシウムイオン不含のハンクス平衡塩溶液（HBSS）、カルシウムおよびマグネシウムイオン含みのHBSS、およびβ-メルカプトエタノールをあらかじめ準備しておきます。まず、溶液2、溶液4、続いて酵素ミックス1を調製します。最初に、β-メルカプトエタノールを溶液2に加え、最終濃度を0.067 mMにします。この溶液は4 °Cで保存した場合、最大1ヶ月間安定です。次に、凍結乾燥粉末と「solution.Four」と記載されたバイアルを、0.7 mLの保存バッファーを用いて溶解させ、静かに混ぜ合わせます。ボルテックスミキサーは使用しないでください。次に、溶液2を1900 µL、溶液1を50 µLピペットでCチューブに分注し、酵素ミックス1を調製します。これで400 mgの組織を解離させるのに十分な量になりますので、より多くの組織を解離させる場合は、追加で酵素ミックス1を調製してください。Cチューブ1本につき、最大1600 mgの脳組織を処理することが可能です。Cチューブ内の酵素ミックス1を37°Cで10〜15分間インキュベートします。解離を開始するには、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まないHBSSを1 mL、チューブにピペッティングします。チューブを天秤に乗せ、脳組織を加えてその質量を記録します。このP4マウスの脳の重量は約0.2 gです。成体脳の重量は約0.4 gになりますが、400 mg未満のすべての組織サンプルに対して、本日使用する溶液量は十分です。組織の重量が400 mgを超える場合は、それに合わせてすべての試薬量を増やしてください。1本のCチューブにつき最大1600 mgの組織まで処理可能です。マウス脳を、あらかじめ加熱した1,950 µLの酵素を含む調製済みのCチューブに移します。混合し、キャップをしっかりと密閉してください。次に、Cチューブのキャップを下に向けた状態でGenMax Associatorに設置し、組織がステーターの領域にあることを確認します。「MCO brain O one」プログラムを選択し、実行します。これは、解離において実行する3つのプログラムのうちの最初のものであり、プログラムが終了すると次の工程に進みます。Cチューブを取り出し、緩やかな連続回転条件下で37 °Cで15分間サンプルをインキュベートします。max mixチューブローテーターを使用する場合、装置の運転モードは4 RPMに相当します。最初のインキュベーション後、チューブを解離装置に逆さまに戻し、プログラムM brain O2を実行します。次の結合の間、溶液3を20 µL、溶液4を10 µL加えることで、組織400 mgあたり30 µLの酵素ミックス2を調製します。2回目のアソシエーターサイクルが終了した時点で、30 µLの酵素ミックス2をキャップ中央のセプタム密封開口部からCチューブに直接注入します。無菌性を確保するため、Cチューブをゆっくりと反転させて混合させ、ボルテックスミキサーは使用しないでください。その後、Cチューブを再びMaxMixチューブローテーターに戻し、4 RPMで混合しながら37 °Cで10分間サンプルをインキュベートします。その後、CTUを再度GentleMACS解離装置に戻し、3回目にして最後となるプログラムM brain 03を実行します。3番目のプログラムが完了したら、Cチューブをローテーターに設置し、37 °Cでさらに10分間インキュベートします。次に、サンプルを短時間遠心分離し、細胞をチューブの底に回収します。これで細胞をろ過する準備が整いました。目的の細胞種のサイズに応じてセルストレーナーを選択してください。kinji細胞のように、回収したい細胞の直径が30 µmを超える場合は、その直径の細胞体が通過できる十分な孔径のものを使用する必要があります。陽性細胞を顕著に回収するためには、30 µmフィルターが有効です。Cチューブのキャップにあるセプタム封止開口部に適合する1000 µLピペットチップを用いて、解離させた組織をCチューブから取り出します。細胞懸濁液を、15 mL回収チューブにセットした分離用フィルターに適用してください。サンプル量が多い場合は、50 mLチューブが必要になることがあります。細胞懸濁液をフィルターに通過させます。その後、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含むHBSS溶液を10 mL加えてフィルターを洗浄します。組織量が400 mgを超える場合は、フィルターの洗浄にカルシウムおよびマグネシウムイオン含有HBSSを最大30 mLまで使用してください。次に、回収チューブ内の細胞を室温で300 Gで10分間遠心分離してペレット化し、上清を完全に吸引除去した後、任意のバッファーまたは培地で細胞ペレットを再懸濁します。この時点で、細胞の単離や抗体染色を妨げる可能性があるため、髄鞘デブリを除去することを選択できます。髄鞘デブリを除去するために、髄鞘除去ビーズの使用を推奨します。それ以外の点については、細胞はさらに別のアプリケーションに使用できる状態です。プロピジウムヨード染色に基づくこのドットプロットは、本ビデオで作成したようなマウスの捻挫由来の単一細胞懸濁液に存在する細胞の97%が生存していることを示しています。これらの細胞は、抗プロミネント・マイクロビーズを用いてさらに精製することで神経前駆細胞を得ることができ、B 27 plusを添加したMax Neuro培地で培養すると、これらのドットプロットに示すようにニューロスフェアを形成します。髄鞘除去ビーズで懸濁液を処理することによる利点が観察されます。単一細胞懸濁液から髄鞘を枯渇させた後に Macs 分離を行うことで、プロミネント1を発現する神経前駆細胞を有意に高い割合で得ることができます。Genix解離法とニューラル組織解離キットを用いて、マウス脳組織から単一細胞懸濁液を調製する方法を説明しました。この手順を行う際は、使用するニューラル組織解離キット（TまたはP）に合わせて、すべての溶液を適切に調製することが重要です。NDKアプリケーションノートまたはデータシートをご参照ください。この方法を用いることで、胚組織、組織切片、または全脳を、無菌条件下で効率的かつ標準化された方法で処理することが可能です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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出生後マウス小脳からの幹細胞の単離と神経細胞への分化

このビデオは、自動化された機械的解離と酵素の混合物を組み合わせて酵素消化を助けることにより、マウスの脳海馬から生存率の高い単一細胞懸濁液を得るためのプロトコルを示しています。...

マウス海馬組織からの単一細胞懸濁液の取得

ビデオは、マウスの脳組織からの免疫細胞の単一細胞懸濁液の調製を示しています。これには、脳組織から細胞を放出するための酵素消化と、それに続く密度勾配遠心分離による免疫細胞の密度に基づいて単離され、単一細胞懸濁液を得るためのものが含まれます。...

マウス脳組織からの免疫細胞の単一細胞懸濁液の調製

ここでは、脳室下帯と個々の成体マウスの歯状回から、付着性単層またはニューロスフェアのいずれかとして、神経前駆細胞培養を同時に生成するための詳細なプロトコルを記述します。...

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

成体神経幹細胞(aNSC)の増殖のための培養システムを確立することで、aNSCの検査と治療への応用が可能になります。脳梁下領域(SCZ)は、最近、成体マウスの新規神経芽細胞形成領域として認識されています。ここでは、SCZ-aNSCの単離、拡張、および分化の方法について説明します。...

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

ここでは、成体マウス脳室下ゾーンから単離された拡大神経幹細胞(NSC)における遺伝子導入効率を高めるように設計されたヌクレオフェクションシステムについて説明します。この知見は、この方法が神経幹細胞における遺伝子摂動を大幅に改善し、従来のトランスフェクションプロトコルの有効性を上回り、細胞の生存率を向上させることを示しています。...

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

脳疾患に対する免疫応答を調べるために、免疫細胞の変化を解析するアプローチが一般的です。ここでは、マウスの脳組織と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するための2つの簡単で効果的なプロトコルが提供されています。...

マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

学ぶマウス脳組織の単細胞懸濁液調製法。gentleMACS Dissociatorを用いて細胞生存性と表面タンパク質を保持し、神経科学・細胞生物学研究で正確な細胞分離と解析を可能にする標準化プロトコルを解説する。

マウス神経組織から単細胞懸濁液の生成

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