Name: エラスターゼによるマウス実験的腹部大動脈瘤の作成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-23T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶエラスターゼを用いたマウス実験的腹部大動脈瘤作成法。ポルシン膵エラスターゼの灌流により14日で動脈瘤が形成され、遺伝子改変マウスを用いた血管生物学研究に応用可能です。

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国立衛生研究所から（P50 HL083800 - 03）：この作品はSCCOR助成金&quot;のメカニズム、階層、および治療AAA病の&quot;サポートされていました

<ol><li>マウスは、吸入イソフルラン2.0〜3.0ミリリットル/ Lで麻酔</li><li>腹部を剃毛し、アルコールとbetadineでスクラブされています。 </li><li>マウスは、術野に仰臥位に配置されます。 </li><li>滅菌手袋は、外科医が着用され、そして使用される機器は、ホットビーズ滅菌器で滅菌されています。 </li><li>長い正中腹部切開が行われます。腹部の内容は、腹部大動脈を露出するために滅菌ガーゼと腹部の外に退避されています。 </li><li>腹部大動脈は左腎静脈のレベルから分岐するために絶縁されています。 </li><li>腹部大動脈の枝を露出し、10から0縫合糸で結紮されています。分岐の1.0センチメートル内のすべての大動脈の枝は結紮されています。 </li><li>一時的に6.0絹の合字は、大動脈の近位および遠位部分の周囲に配置されています</li><li>大動脈切開は、30ゲージの針付き分岐で作成されます。 </li><li>熱テーパーポリエチレンチューブ（PE - 10）は大動脈切開を介して導入し、タイで固定されています。 </li><li>生理食塩水バッグを使用すると、100 mmHgにキャリブレーション〜136 cmの高さでハング、大動脈は4.5 U / mLのタイプIブタ膵臓エラスターゼを含む生理食塩水で満たされている。大動脈は、通常、5〜15分のエラスターゼ灌流時の元の直径の150から170パーセントに拡張させる。 </li><li>潅流カテーテルを除去し、大動脈切開は収縮を避けるために、10から0縫合糸で閉じられます。 </li><li>大動脈切開を閉じた後、遠合字は削除されます。 </li><li>修理大動脈切開からほとんど、あるいは全く出血がある場合は、近位合字は削除されます。拡張された大動脈は即座に血液で満たされる。 </li><li>腸を腹部に返され、傷は6から0ナイロン/ポ​​リプロピレン縫合糸で2層に閉じられます。 </li><li> 0.25パーセントBupivicaime滴（切開の大きさの各センチメートルためappx一滴が）傷に配置され、Caprofen（5mg/kg）のいずれかの用量を皮下投与される。 </li><li>マウスは暖かい地域に配置され、通常15分以内に回復される。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1280/fig1280.png" alt="図1" /> 図1。エラスターゼ誘導AAAの代表結果。

<ol><li>Anidjar, S., Salzmann, J. L., Gentric, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-973 (1990).</li>
<li>Pyo, R., Lee, J. K., Shipley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+of+matrix+metalloproteinase-9+%28gelatinase+B%29+suppresses+development+of+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption of matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) suppresses development of experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Clin Invest. 105 (11), 1641-1641 (2000).</li>
<li>Carsten, C. G. 3rd, Calton, W. C., Johanning, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase+is+not+sufficient+to+induce+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1255 (2001).</li>
</ol>

著者らに開示すべき事項はありません。

これまでの研究では、さまざまな商業エラスターゼ製剤を3からAAAの開発における重要なロット間のばらつきを指摘している。従って、それはAAASを誘導する準備の能力を文書化するために、適切な対照群を持っているだけでなく、生産ロットを監視することが重要です。 興味深いことに、このモデルではAAAの開発に対する感受性は、3を使用したマウス系統に依存しています。現在のビデオで使用されているマウスは、概説のプロトコルを使用してAAAの一貫した開発を持っているC57BL / 6系統のものである。エラスターゼの濃度及び/または培養時間は、他の菌株に対応するために調整されることがあります。 マウスにおけるエラスターゼとAAAの創造の手法が技術的に困難ですが、それはAAAの形成と発展の基盤となる分子機構を研究するための重要なテクニックです。実践と技術的な変更は私たちのラボの90％以上の成功率をもたらしました。我々は、ビデオとそれに付随するテキストはこのテクニックを使用する実験室のための学習曲線を減らす助...

<table><tbody><tr><td>タイプ I 豚膵臓エラスターゼ</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1250</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ (PE-10)</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>CHANGE-A-TIP</td><td></td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>18010-00 (FST)</td><td>電気メス</td></tr><tr><td>LEICA MZ6</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>実体顕微鏡</td></tr><tr><td>LEICA DFC290HD</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>USBカメラ</td></tr><tr><td>Image Pro Express ver. 6.0</td><td></td><td>Media Cybernetics Inc.</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

エラスターゼによるマウス実験的腹部大動脈瘤の作成

Creation of Murine Experimental Abdominal Aortic Aneurysms with Elastase 

腹部大動脈の大動脈セグメントにブタ膵臓エラスターゼの過渡腔内注入は、最初にAnidjarらによってラットで説明されて以来、腹部大動脈瘤（AAA）の最も広く使用されている動物モデルである。その開発は1理論的根拠をベースにしたエラスチンの破砕性質にAAASで観察。このラットモデルは、マウスの大動脈大動脈領域でAAASを生成するように変更されています。2モデルは、多数のトランスジェニックやノックアウトマウスの進展に伴い、AAAの病理に広範な洞察を追加する機能を持っている。また、AAAのために潜在的な治療薬をテストするために実行可能なプラットフォームです。このビデオでは、我々は我々の研究室で使用されるエラスターゼ注入AAAの手順を示しています。 マウスは、イソフルラン2.5％を使用して麻酔し、そして開腹術を無菌条件下で行われる。腹部aortaisは営業実体顕微鏡（ライカ）の支援により単離した。近位と遠位大動脈周囲に一時的な合字を配置した後、大動脈切開は30ゲージの針の先端との分岐で作成されます。 PE - 10ポリエチレン管の熱テーパーセグメントは、大動脈切開を介して導入して保護されています。大動脈内腔は、その後、生理食塩水を含むI型ブタ膵臓エラスターゼ（;シグマケミカル社4.5 U / mL）を、100 mmHgで5-15分のために灌流される。灌流カテーテルを除去した後、大動脈切開は、内腔の狭窄なしに修復されます。

このビデオでは、腹部大動脈の大動脈セグメントにブタ膵臓エラスターゼの過渡腔内注入を介してマウスでは腹部大動脈瘤（AAA）を誘導する方法を示しています。モデルは、多数のトランスジェニックやノックアウトマウスの進展に伴い、AAAの病理に広範な洞察を追加する機能を持っています。

ブタ膵エラスターゼの腹部大動脈腎下セグメントへの一過性管内注入は、...の最も広く用いられている動物モデルである。

腹部大動脈瘤を作製するために用いられるこの外科的手順は、腹部正中切開から始まります。腹腔内臓器を側方に寄せ、大動脈のすべての分枝を結紮します。大動脈の近位端と遠位端をそれぞれ結紮します。針で心臓を穿刺し、熱収縮させたポリエチレンチューブを通してエラスターゼを大量に注入します。注入が完了したら、AORの自己切断部を閉じます。結紮糸を取り除くと、大動脈に血液が充満するため、その後腹腔を閉じます。その後、マウスを回復させると、14日間で動脈瘤が完全に拡張します。こんにちは、スタンフォード大学心血管医学科、胎児細胞研究室のJulian Asmaです。今日は、エラスターゼを用いた新規実験的腹部大動脈瘤の誘発手順について説明します。当研究室では、腹部動脈のPEを研究するためにこの手順を用いています。それでは、開始しましょう。実験を始めるには、例えばC 57 black sixマウスなど、目的のマウスを選択し、吸入イソフルランで意識を失うまで麻酔をかけます。マウスの系統によって、動脈瘤の成長速度が異なることに注意してください。麻酔をかけたマウスをチャンバーから出し、十分に照明が整った準備台に移動させます。尾骨の端から脚の付け根にかけて、腹部の被毛を剃毛します。除毛クリームを使用して、残った被毛を除去します。除毛部位からすべての被毛が取り除かれるまで、70% alcoholで素肌を擦ります。次に、Betadineで皮膚を最低3回擦り、その都度alcoholで拭き取ります。その後、マウスを麻酔状態で維持するため、手術野に仰向けに配置します。手術中、導入時に使用したものと同じ流量でイソフルーランを投与するチューブを鼻に装着します。エラスターゼは氷上に保持し、シリンジに抽出します。その後、シリンジを固定して手術野の横に配置し、カテーテルを装着します。カテーテルの先端を無菌状態に保つことが重要であり、そのためには先端を滅菌バイアルに入れます。マウスを切開する前に、無菌操作が行われることを確認してください。まず、滅菌手袋を着用することから始めます。手術器具、はさみ、持針器、およびピンセットは、手術前に滅菌する必要があります。準備状況を十分に確認し、手術中のその他の潜在的な汚染源を解消するようにしてください。処置中に無菌操作が損なわれた場合は、ホットビーズ滅菌器で器具を再滅菌してください。すべての準備が整ったら、腹腔内で腹部正中線に沿って長く切開し、手術を開始します。腹腔内の臓器を腹腔内の空いたスペースに移動させるか、滅菌ガーゼを用いて腹腔外へ牽引し、腹部大動脈を露出させます。次に、ピンセットを用いて、左腎静脈の高さから分枝部まで、腹部大動脈を慎重に剥離・単離します。示されている例では、大動脈を結紮する部位よりも上方に単一の分枝があるため、結紮する必要はありません。遠位および近位の大動脈結紮部位の間に大動脈分枝がある場合は、分枝の分岐点から1cm以内の箇所を結紮してください。大動脈の近位および遠位部分には、血流を止めるために6.0シルク糸を用いて一時的に結紮を行います。次に、分枝部で自切（オートトミー）を行います。まず、30ゲージの針で分枝部を穿刺します。加熱して先端を細くしたポリエチレンチューブをAOR自切部から挿入し、結び目で固定します。ピンセットを使用して、チューブを大動脈に注意深く、ゆっくりと挿入します。100 millilitersの圧力をかけ、内皮層を剥離させないように注意してください。136 centimetersの高さに吊るした生理食塩水バッグから、エラスターゼを含む水銀を大動脈に灌流させました。チューブ内に気泡が入っていないことを確認してください。気泡があると圧力が正確に測定されません。生理食塩水には、1 mLあたり4.5単位のブタ膵臓エラスターゼ type 1が含まれています。大動脈への充填には5〜15分かかるはずです。灌流中、大動脈は通常、元の直径の約140%まで拡張します。完了後、灌流装置を取り外し、狭窄を避けるため、大動脈切開部を10-0縫合糸で閉鎖します。切開部の閉鎖後、遠位結紮も解除する必要があります。修復した切開部からの出血がほとんど、または全くない場合は、近位側の結紮糸を除去します。出血がある場合は、大動脈の近位側と遠位側に一時的な6.0 soak結紮糸を追加し、さらに縫合を1箇所加えて大動脈切開部を完全に閉鎖します。近位側の結紮糸を除去すると、拡張した大動脈にすぐに血液が充満します。大動脈への処置が完了したら、腸管を腹腔内に戻します。腸管を牽引していた場合、腸管は大きな塊として滑り込むため、その配置について心配する必要はありません。すべての臓器を元の位置に戻した後、6-0ナイロンおよびポリプロピレン縫合糸を用いて、外部の創傷を2層にわたって縫合し、閉鎖します。次に、切開部位1cmあたり0.25% ICANを1滴など、マウスに局所麻酔剤を投与します。また、抗炎症薬であるCarinを5mg/kgの用量で皮下注射します。これで手術は完了です。マウスを暖かい場所に置き、意識が回復するまで静置してください。通常、15分以内に回復します。マウスが意識を取り戻したら、個別のケージに戻し、回復するまで定期的に観察します。処置後、大動脈は通常、元の直径の約140〜160%まで拡張します。この初期の拡張は、7日目まで安定した状態で観察されます。7日目から14日目の間に、急速な二次的拡張が起こります。14日目には、腎下大動脈に動脈瘤が観察されます。マウスにおけるエラスターゼを用いた腹部大動脈瘤の誘導方法について説明しました。この処置を行う際は、ata内部に血栓を形成させないことが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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Biology

生物学

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本プロトコールは、マウスの腹部内大動脈の外側へのエラスターゼの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルのための標準化された外科的方法を記載する。...

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アドベンチアル塩化カルシウムとエラスターゼ浸潤によるマウス腹部大動脈瘤モデル

このプロトコルは、エラスターゼを腎下大動脈に直接適用し、飲料水を通じてβ-アミノプロピオニトリルを投与することの組み合わせにより、マウスの進行性腹部大動脈瘤をモデル化するための系統的な外科的アプローチを説明しています。...

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本プロトコルは、マウスモデルにおける頸動脈瘤を1回の外科手術による誘発のための標準化された外科的方法を説明しています。...

頸動脈瘤形成のマウスモデル

このプロトコルは、エラスチン感作と血管周囲エラスターゼの適用を用いてC57BL/6マウスにおける腹部大動脈瘤(AAA)を繰り返しかつ信頼性の高い誘導方法として提供し、免疫増細成分を含むAAAモデルとして提供します。...

エラスチン感作および血管周囲エラスターゼを用いたマウス腹部大動脈瘤モデルの信頼性の高い作成

血管新生は、既存の血管か​​らの血管の出芽は、自然および病理学的プロセスの両方に関連付けられています。ここでは、血管新生増強と阻害剤が直接文化の大動脈輪に追加できる大動脈リングアッセイを示す。発芽しneovessel伸長は6-12日の期間にわたって大動脈リングを調べることによって決定することができます。...

大動脈リングアッセイ

マウスの横大動脈狭窄（TAC）は、心肥大や心不全の開発の基礎となるメカニズムを研究するために一般的に使用される実験的なモデルです。ここで、我々は、マウスの心肥大の再現性の学位を作成するために大動脈を収縮する手順を説明します。...

マウスの横大動脈狭窄

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マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

学ぶエラスターゼを用いたマウス実験的腹部大動脈瘤作成法。ポルシン膵エラスターゼの灌流により14日で動脈瘤が形成され、遺伝子改変マウスを用いた血管生物学研究に応用可能です。

エラスターゼによるマウス実験的腹部大動脈瘤の作成

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