Name: 人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶ ヒト膵島の精製と培養法。フィコール勾配遠心分離による自動化手法で高品質な膵島を単離し、組織培養フラスコで移植まで維持する技術を解説。糖尿病治療への応用に有用です。

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イリノイ大学シカゴ校から設立だけでなく、膵島細胞リソースセンターNIHの助成金（RFA - RR 05から003）、クリストファー財団、Efroymson財団、およびテラブス財団によってサポート。

1。膵島の精製<ol><li>膵島精製の手順を開始するには、、COBE袋をロードする緑のチューブを除くすべてのチューブをクランプし、0に外1500速度を設定し、スーパー。 </li><li>フード内でポンプと勾配のビーカーを設置し、緑のチューブにコレクションチューブを接続する。 </li><li>今フィコール1.100のロードが開始することができます：&quot;スピン&quot;プッシュは、フロントビーカーにフィコール1.100の110 mlを追加し、COBE袋をロードするためにポンプを起動します。フィコールがロードされると、、スーパーを押してポンプを停止し、ポンプヘッドをアンクランプし、100超アウト速度を設定します。 </li><li>フィコールをビーカーに達すると、すべての空気がポンプヘッドにチューブ、再クランプから追放されている場合。 3,000〜スピン速度、および超アウト速度を0に設定します。 </li><li>今はフロントビーカーに重い勾配を注いでグラデーションをロードするための準備。少しの空気を除去する2つのビーカーの間にクランプを解除してください。その後戻ってビーカーの中に光のグラデーションを注ぐ。 </li><li>マグネチックスターラーの電源を入れ、、COBEのマシン上で&quot;スピン&quot;を押して2つのビーカーを接続するチューブからクランプを削除し、視覚的に重いと光のグラデーションが混合されていることを確認します。 </li><li>勾配は、混合開始後は、遠心機の電源を入れます。 1分間待ってから、混合勾配をロードするためにポンプの電源を入れます。 </li><li>組織は、ローディングチューブを入力して空気を可能にするのに十分低い勾配は、フロントビーカーに低い実行させ、ではなく、ロードするには、その後ビーカーを接続するチューブをreclampと組織をロードする。 </li><li>組織の残りの部分を追加していきます。その後、洗浄溶液の50mlで組織を保持していたチューブを洗浄し、フロントビーカーを洗浄するためにそれを使用。 </li><li>組織の最後は袋に入ると、同時に、ポンプを停止し、ポンプヘッドでアンクランプ、および袋上記のチューブをクランプする。 5分間遠心し続けます。 </li><li>遠心分離を継続しながら、ボンネットに12のコレクションチューブを持参し、そのキャップを緩めます。黄色のチューブにコレクションチューブを取り付け、コニカルチューブ1内に滅菌したコレクションの先端を配置。その後、黄色のチューブをアンクランプし、緑のチューブをクランプする。 </li><li>スピンが終了すると、徐々に100にSuperoutを上げる。チューブ1の150mlを収集する。その後、チューブ2-12（200〜230ミリリットルから）に30 mlを収集する。 </li><li>収集が完了すると、COBEの&quot;STOP&quot;を押してください。今精製が終了したことを、小島が評価され、培養することができる。 </li></ol> 2。サンプリングと文化<ol><li>精製された島の分画を収集した後、12のコレクションチューブの各々からサンプルを削除し、ジチゾンで染色。染色は、層の低純度の小島で高純度の小島対層が含まれているであるかが表示されます。 </li><li>一緒にそれぞれ高及び低純度の組織とプールを収集する。 </li><li>スピンと2回洗浄する。回目の洗浄後、最後の洗浄のメディアで250mlにそれぞれのボリュームをもたらす。 </li><li>評価するためにプールされたフラクションは低いからプールされた画分と1つの1 mlの試料の高さから2つの1 mlのサンプルを取ることから始めます。洗浄溶液9 mlを入れたコニカルチューブに各1ミリリットルサンプルを転送します。 </li><li>その後、各15 mlチューブから数えて皿に​​1 mlを入れる。顕微鏡下で細胞を調べて、カウント。 </li><li> （小数における島の総EIN /純度）/（フラスコあたり30,000 EIN）：細胞をカウントした後に文化、以下の式を使用して、小島をするために必要なフラスコ数を計算する。例えば、90％の純度を持つ100,000小島は、4フラスコで培養されています。 </li><li> 37˚C、5％CO 2インキュベーター内でT175フラスコと文化に島を転送する。 </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

人間の膵島分離の技術において著しい進歩にもかかわらず、膵島の収量は非常に変化し、予測不能のまま。消化された膵組織の精製は、移植のための成功した酵素消化後に十分な島の質量を回復することが重要です。高純度ヒト膵島の優れた回復がこのメソッドを使用して実証されたためUIC精製法が推奨されます。また、消化された組織の最大50 mlをこのように分離に使用される合計時間を短縮することによってヒト膵島の虚血に関連する負傷を最小限に抑える、精製のために実行する単一のCOBEにロードすることができます。

<table><tbody><tr><td>遠心分離機</td><td>装置</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Cobe 2991 セルプロセッサー</td><td>装置</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>膵島精製</td></tr><tr><td>MZ6倒立顕微鏡 TLBD4.1</td><td>装置</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>2 mmグリッド付き細胞培養ディッシュ</td><td>装置</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>膵島計数</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>装置</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>COBEバッグ</td><td>使い捨て器具</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>T175培養フラスコ</td><td>使い捨て器具</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>ウィスコンシン大学（UW）溶液</td><td>試薬</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>試薬</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>M199培地（洗浄液）</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>最終洗浄用／培養用培地</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>ジチゾン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

人間の膵島単離：パートii：ヒト膵島の精製と​​文化

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

1型糖尿病の管理は、年間1,000億ドルで、個人と社会の両方に、厄介です。グルコースモニタリングと新しいインスリン製剤の普及にもかかわらず、多くの個人はまだ壊滅的な二次的合併症を開発する。膵島移植は、糖尿病患者における正常血糖コントロールの近くに復元することができます<sup&gt; 1</sup&gt;、集中的なインスリン療法に関連付けられている重篤な低血糖エピソードのリスクなし。十分な膵島質量を提供することに成功した膵島移植のために重要です。しかし、ドナーの特性、臓器の調達と保存には、分離結果に影響を及ぼす<sup&gt; 2</sup&gt;。イリノイ大学シカゴ校（UIC）で我々は改善された精製勾配で成功した分離プロトコルを開発<sup&gt; 3</sup&gt;。プログラムは、2004年1月に始まり、300以上のアイソレーションは、2008年11月までに実施された。膵臓は冷たい保存液（UW、ウィスコンシン州またはHTKの大学、ヒスチジン - トリプトファンケトグルタル酸）に送られ、<sup&gt; 4月7日</sup&gt;膵島分離のためのUICにおける細胞分離の研究室へ。膵島は、もともとRicordiの記載された方法を改変したものですUIC方法を、用いて単離された<em&gt;ら</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;。第I部で説明したように：膵組織の消化やコレクション、人間の膵臓は、トリミングカニューレ、灌流、および消化した。コレクションとUW液のインキュベーションの少なくとも30分後、組織は浄化のために（COBE 2991年、COBE、レイクウッド、CO）細胞分離装置にロードされています<sup&gt; 3</sup&gt;。以下の精製、膵島の収量（膵島同等、IEQとして表される）、組織のボリューム、および純度は、標準的な方法にしたがって決定された<sup&gt; 9</sup&gt;。隔離された島はCMRL -​​ 1066 1.5パーセントヒトアルブミン、0.1％インスリン - トランスフェリン - セレン（ITS）、シプロフロキサシン、1M HEPES 5 mlの1mlの添加培地（Mediatech、ハーンドン、バ​​ージニア州）、および14.5 mlの培養した37 T175フラスコに7.5％重炭酸ナトリウム° C一晩培養膵島を移植または研究のために使用される前に。

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。修正された自動化された方法を使用して：このビデオでは、我々は人間の膵島の分離（ヒト膵島の精製と​​文化部II）の手順をステップバイステップで説明します。

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

1型糖尿病の管理は、個人にとっても社会にとっても負担が大きく、年間1,000億ドル以上の費用がかかっています。...の広範な利用にもかかわらず、

このビデオでは、あらかじめ分離・消化された膵臓組織を用いて、フィコール密度勾配精製を行います。これにより、最終的に移植まで組織培養フラスコで培養可能な、精製された膵島画分を得ることができます。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校外科部のヒト膵島プログラム研究室のAmerican Chiefです。こんにちは、Barbara Barberoです。私もヒト膵島プログラムに所属しています。本日は、ヒト膵島分離の手順について解説します。当施設では、臨床的に利用可能な高品質なヒト膵島を回収するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。アイレット精製手順を開始するために、COBEバッグをロードし、緑色のチューブ以外のすべてのチューブをクランプします。フード内で、速度を1500に、super outを0に設定します。ポンプと勾配ビーカーを準備し、回収チューブを緑色のチューブに接続します。これでFI callのロードを開始できるため、spinを押してください。次に、110 millilitersのfiを添加します。フロントビーカーに呼び出し、ポンプを始動させてCOBEバッグに充填します。FI呼出が充填されたら、super outを押してください。ポンプを停止し、ポンプヘッドのクランプを外して、スーパーアウト速度を100に設定します。FIコールがビーカーに到達し、チューブ内からすべての空気が排出されたら、ポンプヘッドを再クランプし、回転速度を3000に、スーパーアウト速度を0に設定します。次に、高密度のグラジエントを前方のビーカーに少量注ぎ、グラジエントをロードする準備をします。2つのビーカー間のクランプを緩めて空気を抜きます。次に、ライトグラジエントを後ろのビーカーに注ぎます。マグネチックスターラーをオンにします。COBE装置のspinボタンを押します。2つのビーカーを接続しているチューブからクランプを取り外し、重い勾配と軽い勾配が混合していることを確認します。勾配の混合が始まったら、遠心機を起動します。1分間待機した後、ポンプを起動して混合勾配を負荷し、組織をロードします。勾配を前面のビーカーで低くしますが、ロードチューブに空気が混入しない程度の高さに留めてください。その後、ビーカーを接続しているチューブをクランプし、組織をロードします。残りの組織をすべて加え続けます。次に、組織が入っていたチューブを50 millilitersの洗浄液で洗浄します。そして、組織がすべてバッグに入りきる際に、その液を用いて前方のビーカーを洗浄します。ポンプヘッドにあるUNCクランプでポンプを停止させると同時に、バッグより上部のチューブをクランプします。さらに5分間遠心分離を継続します。遠心分離を行っている間に、12本の回収チューブをフードへ移動させ、キャップを緩めておきます。回収

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

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ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。このビデオでは、我々は段階的に説明し、人間の膵島を分離するための手順：変更された自動化法を用いて（パートI消化および膵組織のコレクション）。...

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学ぶ ヒト膵島の精製と培養法。フィコール勾配遠心分離による自動化手法で高品質な膵島を単離し、組織培養フラスコで移植まで維持する技術を解説。糖尿病治療への応用に有用です。

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

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