Name: ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa 2 + の (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶハチの嗅覚学習におけるキノコ体神経細胞のカルシウムイメージング法。生体内でCa²⁺信号を記録し、学習と記憶の神経メカニズムを解明する手法を紹介します。

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蜂の準備とバックフィル<ol><li>固定化のため氷の上でハイブとチルでミツバチの飼料収穫機をキャッチ。 </li><li>プレキシグラス録音室3でマウントします。低融点のハードワックスとレコーディング室の壁に目と胸部を修正。 </li><li>一般的に電気生理学のために使用されるガラスキャピラリーを引いて、CAの先端径を得るために先端に壊れる。 10μmの。染料ペーストとキャピラリーの先端をカバーしています。染料ペーストは、フラ-2デキストランおよびリジン修正可能なテトラメチルローダミンデキストランの10:1混合物で構成されています。 </li><li>染色手順のために特徴点またはn -エイコサンとアンテナを固定する。脳上記のキューティクルの一部を削除し、キノコ体へのアクセスを許可する側に腺と気管を押してください。 </li><li>ソーマやキノコ体の神経細胞の軸索領域のいずれかに毛細血管を注入する。これは、フリーハンドを行ったり、マイクロマニピュレータを使用することができます。その後、頭部カプセルでキューティクル部分を復元し、アンテナを緩めます。 </li><li> 20℃で少なくとも4時間または一晩加湿場合にそれらを格納する前に、30％ショ糖溶液と蜂を養う℃に</li></ol>生体内撮像<ol><li>腹部に押し付けると、録音室にクリップやテープで固定されているスポンジの小片で蜂などの動きを妨げる。 </li><li>食道の汲み上げに起因する脳の動きを防ぐために、唇上記のキューティクルに小さな切開を切断し、食道の4を損なうことなく、緊張下に置くために慎重に食道とその周囲の固体構造を引き出します。二成分シリコーンをカバー。 </li><li>針で穴を確認し、M17の記録のためのワイヤ電極を挿入する。 </li><li>キューティクル部分、気管、脳、上記の腺を削除します。一枚の紙で頭部カプセル内heamolymphを吸う。 </li><li>二成分シリコーンを頭のカプセルを埋める。脳が完全に覆われていることが重要です。 </li><li>場所を顕微鏡ステージ上に蜂と液滴に顕微鏡のディップの目標を浸すために、シリコンの表面に水滴を置く。ステンドニューロンに焦点を当てる。 </li></ol>信号の匂いの刺激と記録 嗅覚：我々は、コンピュータ制御された、カスタム構築された刺激装置またはGaliziaとフェッター3で前述したように&quot;嗅覚&quot;を使用。悪臭は、アンテナに向け一定の空気流中に希釈されています。あらゆる刺激は、0.2ミリリットル臭い飽和空気の3S臭のパルスで構成されています。刺激のプロトコルは、録音ソフトウェアTILLVisionに設定することができます。 顕微鏡とイメージングセットアップ：我々はツァイス蛍光顕微鏡を使用する。画像は25 °顕微鏡に搭載されたTILLフォトニクスイメージング装置を用いて5 Hzのサンプリングレートを持つCで記録されている。カルシウムの信号はX60、0.9 Wオリンパス成虫CCDカメラ（640x480ピクセル、160x120ピクセルのチップ上でビニング4X）とディップ目的によって記録されます。フラ-2は、レシオメトリックな測定のための340および380nmの波長の単色光で励起される。蛍光は、410nmのダイクロイックミラーと440nmロングパスフィルタを介して検出されます。記録のためのパラメータは、レコーディングソフトウェアで設定されます。各測定には2つの波長に対して10秒と露光時間をそれぞれ準備の染色強度に調整することができます続きます。 M17の記録：唇（M17）の伸筋が学習に関連する行動反応を監視するために細胞外記録され、PER 5、6、すなわち。口の部分に近い筋肉に銅線を注入する。目に接地電極を注入する。筋肉の電位は、カスタムビルドプリアンプで増幅デジタル化してコンピュータに保存されます。刺激の発症は、嗅覚によってトリガされます。 データ解析<ol><li>実験中：カルシウム信号の録音は、コンピュータに供給され、格納されています。レコーディングソフトウェアのTILLVisionは波長（340nm/380nm）とdeltaF（ベースラインの減算）の計算の間の比率の計算のように、信号の最初の検査が可能になります。 </li><li>画像処理は、IDLでカスタム作成されたプログラムで実行されます。のCa 2の比を計算する+各ピクセルの340nmと380nmの測定値からの信号を。刺激前のフレームにわたって平均化することにより、バックグラウンド蛍光（F）を決定し、レシオメトリック信号（deltaF）から差し引きます。 </li><li>対象領域（ROI）を定義するには：刺激中にフレームの平均とローパスフィルタ（3X3px）を適用する計算。偽色のスケールにグレースケールに変換します。偽色の画像でのアクティビティのスポットとしてニューロン構造の活動を決定し、ROIとして定義する。 </li><li>いかなるフィルタリングまたは修正することなくすべてのフレームにわたってROI内のピクセルを平均化することにより活性領域の時間的なダイナミクスを計算する。 </li></ol>一緒にフラ-2デキストランで我々は解決不能色素ローダミンデキストラン（&quot;ミニルビー&quot;）でニューロンを埋める。両方の色素は同じ分子量を有し、それらは神経細胞に共存する必要があります。広視野イメージングは​​非常に限られた空間分解能を可能にする、従ってそれは、走査型共焦点顕微鏡を用いて実験した後に染色した構造を調べることをお勧めします。 <ol><li>生理学的測定の後、脳を解剖し、凝視する。 </li><li> PBSおよびエタノールとメチルsalycilateで明確に段階的に脱水にすすいでください。 </li><li>共焦点顕微鏡のためのメチルsalycilateで脳を埋め込みます。 </li><li>私たちは、ライカTCS SP2顕微鏡を使用してください。励起波長は543nmです。 </li><li>我々は、空気や油浸対物レンズで脳をスキャンし、画像データで染色した構造を比較する。 </li></ol>代表的な結果： 染色と準備が成功した場合、偽色のスケールに信号は、キノコ体α葉外因性ニューロンで、例えば、図1のようになります。 行動反応は（PER）刺激（図2）の前に刺激マイナススパイク​​の周波数の間にスパイク頻度として計算することができます。 ステンド構造は、共焦点顕微鏡（図3）を用いてより詳細に検討されることがあります。 <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="図1" /> 図1：代表的なカルシウムイメージングの信号（ヘプタナール刺激）。 ：蜂の脳の画像化された地域。 B：380nm励起波長におけるX20ディップ客観を通して見た、キノコ体のα-葉は紫色で概説されている生の蛍光画像。染料は、外因性神経細胞を染色するためにα-ローブの腹外側縁に注入した。 C：3つの第2の刺激の間の平均信号、deltaF（380分の340）に由来する偽色の画像、α-葉紫、黒に記載されている選択されたROIに記載されている。 D：匂いの刺激、C. Eに示すように関心領域から平均的な信号に応答してカルシウムシグナルの時空間ダイナミクス：ROIにそれぞれショ糖の刺激IPSI -と対側のアンテナへの応答におけるカルシウムシグナルの時空間ダイナミクスが示されたC.で<img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> 図2：代表M17応答。嗅覚コンディショニング後蜂は匂いが報酬なしで提示される口吻を拡張します。赤い線は臭いの刺激を示している。挿入図：ミツバチのPER。 <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> 図3：代表画像スタック。イメージング実験後に脳を解剖した。図1からニューロンは紫で概説X20の油浸対物レンズ、α-ローブに共焦点顕微鏡を用いてスキャンされます。

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

このプレゼンテーションでは、ミツバチの in vivoカルシウムシグナルに調査するためにすべてのステップを経ています。我々は、キノコ体の神経細胞にこの手法を適用し、が、画像は、染色技術を確立することができるため、すべてのニューロンに行われることがあります。我々は、ミツバチの嗅覚路における神経細胞に焦点を当てている。実験はすべて暗室で行われる。セットは、最大蜂の光学的認識の範囲外にあると染料を励起しない長波長の光で照らされている。それはシリコンで例の空気の泡のために、任意の蛍光アーチファクトを回避することが重要です。 このシステムの大きな利点の一つは、空間分解能と時間分解能を持つニューロンの活動に関する情報をサンプリングする可能性があります。ニューロンの例学習関連の可塑性を調査するときに、同時に、我々は蜂に関連する動作を観察することがあります。しかし、空間分解能と時間分解能が制限されています。 生体内のカルシウムイメージングで使用して、実験時間は限られている。細胞外電気生理学的手法で、レコーディングは数時間または...

<table><tbody><tr><td>低融点ハードワックス Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 デキストランカリウム塩, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>遮光保存すること。</td></tr><tr><td>テトラメチルローダミンデキストラン 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>遮光保存すること。</td></tr><tr><td>n-エイコサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Sil 接着剤</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>イメージングセットアップ</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のca 2 + の

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

生体とセミのカルシウムイメージングのためのin vivoでの準備でカットナーとGaliziaは、触角葉1の臭気誘発活性を測定するために、十年以上前に、Joergesによって私たちの研究室で開発されています。その時から、それが継続的に洗練されており、ミツバチの脳の異なるneuropilesに適用される。ここで、我々は現在、デキストラン結合のカルシウム感受性色素（フラ-2）を使用して、キノコ体の神経細胞で活性を測定するために実験室で使用されている準備について説明します。我々は、逆行軸索や細胞体の領域に色素を注入することによりキノコ体の神経細胞を染色。我々は、それがコンディショニングのPERを使用してハチを訓練することは可能である準備を達成するために、侵襲性を減らすことに焦点を当てる。我々は、PER（M17）2を制御する筋肉からの電気myogramsを記録することによって、行動反応を監視し、定量化することができます。 生理学的実験の後に画像形成された構造は、ニューロンの識別に対処するための走査型共焦点顕微鏡を用いてより詳細に検討されています。

ミツバチは、食欲の嗅覚学習のパラダイム（PER -コンディショニング）で条件付けることができます。刺激として匂いを使用して、我々は、同時にカルシウムイメージングがキノコ体ニューロンの匂い誘発活性を測定するために使用されている間に記録されている動作にする方法を確立<em&gt; in vivoで</em&gt;。

ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa 2 + の

カルシウムイメージングのためのin vivoおよびsemi-in vivoの調製法は、10年以上前に当研究室のJoerges、Küttner、Galiziaによって、...するために開発されました。

この手順は、まずハチを記録チャンバーに固定することから始まります。脳内の特定の構造を染色するため、頭 capsule からクチクラの一部を取り除きます。染色されたニューロンのカルシウム信号を、広視野イメージング装置を用いてin vivoで記録します。イメージング中、ミツバチに臭気刺激を与えたり、触角にショ糖を投与したりすることができます。このようにして、特定の臭気に反応して吻を伸展させるようミツバチを条件付けすることが可能です。吻伸展反応は、M 17 筋からの筋電図記録を用いてモニタリングします。イメージング実験の後、共焦点顕微鏡を用いて染色された構造を詳細に調査するため、脳を解剖します。こんにちは、Mansel研究室のMelanieです。こんにちは、同じくMansel研究室のAnyaです。本日は、ミツバチのキノコ体におけるin vivoカルシウムイメージングの手順について解説します。当研究室では、ミツバチの脳における嗅覚コーディングおよび学習に関連した可塑性を研究するために、この手法を用いています。それでは始めていきましょう。まず、巣門で採餌中のミツバチを捕獲し、氷上で冷却して不動化させます。次に、そのハチをプレキシガラス製の記録チャンバーに固定します。低融点ハードワックスを用いて、複眼と胸部を壁面に固定してください。ガラスキャピラリーの先端を破断させ、直径10 µmにします。キャピラリーの先端を、URA 2デキストリンと定着性ロジンデキストリンを10:1の割合で混合したペーストで覆います。準備したキャピラリーを染色に使用します。染色の手順を開始するため、まず、触角を小根で固定します。外骨格の一部を取り除き、腺と気管を側面に寄せて頭カプセル上方の脳を露出させ、キノコ体へのアクセスを可能にします。紙片を用いて、頭カプセル内の血リンパを吸収します。キノコ体ニューロンを染色するには、キャピラリーをニューロンの細胞体または樹状突起領域のいずれかに注入します。次に、頭殻上の角質片を復原させ、触角を緩めます。最後に、30% sucrose溶液をミツバチに与え、濡れたキッチンタオルで覆った発泡スチロール箱に入れ、20 °Cで少なくとも4時間または一晩保存します。Bの調製が完了しましたので、in vivoイメージングを開始します。まず、記録室に取り付けられたスポンジをミツバチの腹部に押し当て、個体が動かないように固定します。次に、食道のポンプ作用によって脳が動くのを防ぐため、ミツバチの触角をアイオーンで固定します。上唇の上のクチクラに小さな切開を入れ、食道とその周囲の硬組織を慎重に引き出し、2液性シリコーンで覆います。次に、針を用いて、上唇のprotractor muscleから心電図を記録するための電極線を挿入するための穴を開けます。脳の上部にあるクチクラ片、気管、および腺を除去します。M 17から電気図を記録するため、紙片を用いて頭 capsule 内の血リンパを吸収します。口器に近い筋肉に銅線を挿入し、眼に接地電極を挿入します。次に、頭部カプセルに2液混合型シリコーンを満たします。脳が完全に覆われていることを確認してください。ミツバチを顕微鏡ステージの上に置き、シリコーンの表面に水滴を1滴滴下します。顕微鏡の浸液対物レンズを液滴に浸し、ステージ上のニューロンに焦点を合わせます。in vivoイメージングの準備が完了したので、次に臭気刺激と信号記録について説明します。ミツバチに臭気刺激を与えるために、コンピューター制御のカスタムメイド嗅覚計を使用して、一定の気流中に臭気物質を希釈して供給します。触覚への嗅覚刺激は、臭気飽和空気を3秒間のパルスで提示することで行います。カルシウムイメージングには、ZES蛍光顕微鏡に搭載したTil Photonicsイメージングセットアップを使用し、室温でサンプリングレート5 Hzで画像を記録します。カルシウム信号は、OlympusのX 60 0.9 Wディップ対物レンズとAngo CCDカメラを用いて記録し、各測定時間は10秒間とします。筋電位はGrassアンプで増幅され、A/Dコンバーターを用いて記録およびデジタル化されます。M 17からの記録は、学習に関連する行動反応をモニタリングするために使用されます。信号の記録が完了したため、形態学的解析および再構築へと移ります。逆行標識に使用された2種類の染料は、いずれも同じ分子量であるためです。これらはニューロン内で共局在しています。広視野イメージングでは空間分解能に制限があるため、共焦点走査顕微鏡を用いて染色された構造を観察します。実験後、まず脳を摘出し、4%ホルムアルデヒド中で4°Cにて一晩固定します。翌日、PBSで洗浄し、次いでエタノールを用いて脱水処理を行います。50%、70%、90%、99%の各濃度で10分ずつ、その後100%で10分間を2回行います。脳を溝付きオブジェクトスライドに載せ、サリチル酸メチルを滴下してカバーガラスを被せ、共焦点走査顕微鏡のステージに設置します。空気対物レンズを使用し、デジタルズーム1.1〜1.2倍、光学切片厚4 µmで脳をスキャンします。ここでは、触角への臭気刺激に対するキノコ体外在性ニューロンの応答を、60倍の対物レンズで記録し、擬似カラーで可視化した様子を示しています。左側の赤い正方形は、臭気刺激の持続時間を表しています。実験後、脳を解剖し、共焦点顕微鏡を用いて20倍の倍率で染色構造をより詳細に観察します。以上で、嗅覚学習中のミツバチにおけるキノコ体ニューロンのイメージング方法を説明しました。この手順を行う際は、光感受性染料を用いる実験は暗所で行う必要があることに注意してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。それでは。

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