ハニービーの嗅覚学習中のキノコ体の神経細胞のイメージング- 生体内のCa 2 + の

この手順は、ミツバチを記録チャンバーに固定することから始まります。キューティクルの一部がヘッドカプセルから取り出され、脳内の選択された構造を染色します。染色されたニューロンのカルシウムシグナルは、広視野イメージングセットアップを使用してin vivoで記録されます。

イメージング中、ミツバチは匂いやアンテナへのショ糖の送達で刺激される可能性があります。このようにして、ミツバチは、臭いに応答してテングを伸ばすように条件付けることができます。吻の伸展反応は、M 17 筋肉からの筋電図記録を使用して監視されます。

イメージング実験の後、脳を解剖し、共焦点顕微鏡を使用して染色された構造を詳しく調べます。こんにちは、rdo Manselの研究室のMelanieです。こんにちは、私もマンセルラボのアーニャです。

今日は、in vivoカルシウムイメージングの手順とミツバチの茸の本体を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、ミツバチの脳における嗅覚コーディングと関連する可塑性の学習を研究しています。それでは始めましょう。

巣箱の入り口でミツバチの採餌者を捕まえることから始め、次に氷の上で冷やして固定します。次に、ミツバチをプレキシガラスの記録チャンバーに取り付けます。低融点の硬質ワックスを使用して、目と胸部を壁に固定します。

すべてが先端でガラスキャピラリーを破砕し、直径10ミクロンになります。毛細血管の先端を、URA、2つのデキストリン、および固定可能なロダンデキストリンの10対1の混合物からなるdペーストで覆います。調製したキャピラリーは染色に使用します。

染色手順を開始するには、まずコアンでアンテナを固定します。キューティクラの一部を取り除き、腺と気管を横に押して、キノコの体にアクセスできるようにして、脳の上のヘッドカプセルを開きます。紙を使って、ヘッドカプセル内の血リンパ液を吸収します。

キノコ体のニューロンを染色するには、ニューロンの体細胞または樹状突起領域のいずれかに毛細血管を注入します。次に、ヘッドカプセルのキューティクルピースを元に戻し、アンテナを緩めます。最後に、ミツバチに30%ショ糖溶液を与え、濡れたキッチンタオルで覆われた発泡スチロールの箱に少なくとも4時間または摂氏20度で一晩保管します。

Bの調製が完了したら、in vivoイメージングを開始することができます。まず、ミツバチが移動しないように、記録チャンバーに取り付けられているスポンジを使用して、腹部に押し付けます。次に、食道のポンピングによって脳が動くのを防ぐために、ミツバチのアンテナをイオアンで固定します。

唇の上のキューティクルに小さな切開を切り、食道とその周囲の固い構造を慎重に引き出し、それらを2つの成分シリコーンで覆います。次に、陰唇の分度器筋からの電位を記録するために使用されるワイヤー電極を挿入するための穴を針で開けます。脳の上のキューティクル片、気管、腺を取り除きます。

紙を使ってヘッドカプセル内の血液を吸収し、M 17の電位図を記録します。口の部分に近い筋肉に銅線を注入します。接地電極を目に注入します。

次に、ヘッドカプセルに2液型シリコーンを充填します。脳が完全に覆われていることを確認してください。ミツバチを顕微鏡ステージに置き、シリコーンの表面に一滴の水を置きます。

顕微鏡のディップ対物レンズを液滴に浸し、ステージニューロンに焦点を合わせます。in vivoイメージングの準備が完了したので、匂い刺激と信号記録について記述できるようになりました。ミツバチに匂いの刺激を届けるために、コンピューター制御の特注の嗅覚計を使用して、匂い物質を一定の気流に希釈します。

アンテナに向けられる臭気刺激は、臭気飽和空気の3秒間のパルスで構成されています。カルシウムイメージングでは、zes蛍光顕微鏡に搭載したtilフォトニクスイメージング装置を用いて、室温で5ヘルツのサンプリングレートで画像を記録します。カルシウム信号は、Ango CCDカメラを搭載したX 60 0.9 Wオリンパスのディップ対物レンズを通じて記録され、各測定は10秒間続きます。

筋電位はグラスアンプで増幅され、アナログデジタルコンバーターで記録およびデジタル化されます。M17からの記録は、信号の記録が完了した状態で学習に関連する行動応答を監視するために使用され、今後は形態素解析と再構成に進むことができます。なぜなら、バックフィル中に使用される両方の染料は同じ分子量を持っているからです。

それらはニューロンに同じ位置にあります。広視野イメージングは空間分解能に限界があるため、共焦点走査型顕微鏡を使用して染色された構造を調査します。実験後、まず脳を解剖し、翌日4°Cの4%ホルムアルデヒドで一晩固定し、PBSですすぎ、エタノールステップで50%70%90%99%で10分間、10分間で10分間100%で脳をサリチル酸メチルカバーを一滴垂らした溝付き物体スライドに脳を置きます。 それを滑らせてから、共焦点走査型顕微鏡の顕微鏡ステージに置きます。

空気対物レンズと4マイクロメートルの光学セクションで1.1〜1.2のデジタルズームを使用して脳をスキャンします。ここでは、60倍の対物レンズを通じて記録され、偽色で視覚化されたアンテナの匂い刺激に対するキノコ体の外因性ニューロンの応答が見られます。左側の赤い四角は、匂い刺激の持続性を表しています。

実験後、脳を解剖し、20倍の倍率で共焦点顕微鏡を使用して染色構造をより詳細に調査します。そこで、嗅覚学習中にミツバチのキノコ体のニューロンを画像化する方法を紹介しました。この手順を実行するときは、感光性色素を含む実験は暗闇で行わなければならないことを覚えておくことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。バイバイ。