ヒトCD40活性化B細胞の生成

こんにちは。私はアレクサンダー・シク・ファン・ハーゲンです。ケルン大学病院の免疫学および輸送免疫学研究室に所属しています。このビデオでは、末梢血単核細胞からヒトCD40活性化B細胞を生成する方法について説明します。

当研究室の主な関心事の一つは、B細胞の抗体非依存的な機能の研究です。抗体産生細胞としての役割にとどまらず、B細胞は生理的条件下および自己免疫疾患の両方において、抗原提示細胞として重要な役割を担っています。活性化後、特にCD40を介して活性化された場合、B細胞は強力な抗原提示能および免疫刺激能を獲得することがあります。

CD 40。活性化B細胞は、樹状細胞と比較していくつかの利点があります。これらは、がん患者からであっても、少量の末梢血から比較的低コストで容易に増殖させることが可能です。

それでは、博士課程の学生であるTanya Leicと技術者のLERが、末梢血からヒトCD 40活性化B細胞を生成する方法をステップバイステップで紹介します。こんにちは、Tanya Liviです。私は博士課程の学生で、ここではヒトCD 40活性化B細胞の生成方法について実演します。

この手順は当研究室で最適化されました。主な工程は、まずフィーダー細胞の調製です。そのため、ヒトCD 40リガンドを導入したNIH 3T3細胞を用い、これに78 Grayの放射線を照射して6ウェルプレートに播種します。

次に、精製したPBMCから、ヒトCD 40活性化B細胞の培養を開始します。これらの細胞をヒトインターロイキン4およびシクロスポリンAで処理した後、6ウェルプレートのフェタセル上に播種します。この手順を7日目に行い、その後は細胞培養の14日目まで3〜4日ごとに繰り返します。高純度のヒトCD 40活性化B細胞を得るため、CD 40活性化B細胞の作製は、精製した直後または適切に解凍したヒトPBMCを用いて開始します。

まず、PBMCを2回洗浄します。そのためには、細胞を50 mLのPBSに再懸濁してください。PBMCを1300 RPM（260 ×gに相当）で7分間遠心分離します。この後、上清を除去し、細胞を再び50 mLのPBSに懸濁し、1100 RPM（190 ×gに相当）で再度7分間遠心分離します。さらに上清を除去し、細胞数を算出して再懸濁を行います。

PBMCを20 mLのPBSに懸濁し、ボルテックスで細胞を十分に混合した後、細胞数を計測します。CD40B培養に必要な量のPBMCを、1200 RPM（220 ×g）で5分間遠心分離して回収します。6ウェルプレートを使用する場合、1ウェルあたり4 × 10⁶個、プレート全体で24 × 10⁶個の細胞が必要です。

次に、PBMCをCD 40 B培養培地を用いて1×10⁶ cells/mLに再懸濁します。刺激のために、新鮮なヒトIL-4を50 units/mLの濃度で、またT細胞の増殖を抑制するためにシクロスポリンAを0.63 µg/mLの濃度で細胞懸濁液に添加します。これで、PBMC懸濁液をCD 40リガンドで刺激する準備が整いました。

我々の知る限り、現在、機能的なGMPグレードのSOMAL CD 40リガンドは入手できません。そのため、NIH 3T3細胞株は培養内で数ヶ月間生存可能であることから、細胞の生存、分化、および増殖を刺激するために、ヒトCD 40リガンドを導入したNIH 3T3細胞を使用します。CD 40リガンドの発現消失については、定期的に確認して除外する必要があります。

CD 40 ligandをトランスフェクトしたNIH 3T3は、接着性細胞株であり、0.7 mg/mLのG 4 1 8を添加した選択培地を用いて、37 °C、5% CO2の条件下で培養します。この接着性線維芽細胞株は、完全にコンフルエントになってはいけないため、週に2回継代する必要があります。接着細胞を継代するには、培地を吸引し、10 mLのPBSで1回洗浄した後、緩やかにスウィベルさせます。再び培地を吸引し、75 cm²フラスコに4 mLのトリプシンEDTAを加えます。

フラスコをインキュベーター内で37°C、5〜10分間インキュベートします。その後、フラスコを取り出します。軽く叩くことで、細胞をプラスチック面から剥離させます。

次に、10 mLの野生型培地を加え、緩やかに回転させて撹拌し、細胞を50 mLチューブに移します。NA83T3細胞を1200 RPM（125Gに相当）で5分間遠心分離します。沈殿した細胞を10 mLの野生型培地で慎重に再懸濁します。

N IH 33 サブカルチャーの細胞数を測定し、1.5 × 10⁶ 個のフィーダー細胞を 10 mL の野生型培地で再懸濁します。これらを 75 cm² フラスコに移し、ネオマイシン耐性遺伝子を持つ形質導入細胞を選択するため、G 4 1 8 を 0.7 mg/mL の濃度で添加します。最後に、CD 40 B 刺激のため、フィーダー細胞を 37 °C、5% CO2 の条件下でインキュベートします。

残りのNI 8 3 3細胞を、増殖を停止させるため78 Gyで致死照射します。照射したフィーダー細胞を、細胞密度 0.1 × 10⁶ cells/mL となるようにwire type mediumで希釈し、6ウェルプレートに1ウェルあたり2 mLずつ分注します。CD40リガンドによるBリンパ球の刺激にフィーダー細胞として使用する前に、37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートし、6ウェルプレート上の細胞を再び接着させます。

顕微鏡下で、前日に播種したフィーダー細胞が接着しているか確認します。フィーダー細胞が接着していれば、各ウェルからSUP natinを除去し、速やかに2回洗浄します。まず、各ウェルを2 mLのPBSで洗浄し、次にさらに2 mLで洗浄します。

PBMC懸濁液の刺激に使用するCD40B洗浄培地。フィーダー細胞に対し、細胞密度1×10⁶ cells/mLとなるように直前に調製する。その際、細胞懸濁液を各4 mLずつ緩やかに移送する。

7日目に、プレートを37°C、5% CO2条件下でインキュベートします。CD40 B細胞は、7日目に活性化されたB細胞の最初の継代後、3〜4日ごとに継代培養することが可能です。

6穴プレートから、リサスペンションにより凝集した細胞を緩やかに回収し、10 mLのピペットで懸濁させます。CD40 B細胞を50 mLチューブに回収します。CD40 B cellsを、1200 RPM（220 ×gに相当）で7分間遠心分離します。

培地をCD 40 B細胞洗浄用培地と交換し、CD 40活性化B細胞の細胞数を測定します。CD 40 B細胞をCD 40 B細胞培養培地で1×10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁します。

次に、刺激のために、50 units/mL濃度の新鮮なヒトIL-4および0.63 µg/mL濃度のシクロスポリンAを細胞懸濁液に添加します。前日に調製した放射線照射フィーダー細胞を使用します。もちろん、放射線照射フィーダー細胞については、使用直前に顕微鏡下で接着状態を再度確認する必要があります。

細胞が付着している場合は、以前と同様に、まず1回PBSで、次にCD 40 B洗浄用培地で、フィダー細胞を迅速に2回洗浄します。その後、1 × 10⁶ cells/mLに調整したCD 40 B懸濁液を、6ウェルプレートの各ウェルに4 mLずつ注意深く分注します。この継代操作を3〜4日ごとに週2回同様に繰り返し、培養14日目に高純度のヒトCD 40活性化B細胞の細胞クラスターを得ます。

現時点で、CD 40 B細胞は、CD 80、CD 86、CD 83、MHC分子などの共刺激分子、およびいわゆるリンパ節ホーミング三者集団であるCD 62リガンド、CCR7、LFA-1を発現しています。これらは、生成過程においてフローサイトメトリーにより確認することが可能です。トラブルシューティングについては、本プロトコルのテキスト版をご参照ください。将来的には、CD 40活性化B細胞ががん免疫療法の重要なツールとなることが期待されます。

実験の成功をお祈りいたします。