Name: ヒトCD40活性化B細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: 学ぶヒトCD40活性化B細胞の生成法。末梢血単核球からCD40リガンドとインターロイキン-4で刺激し、抗体非依存的なB細胞機能と抗原提示能を研究するための細胞培養技術を習得できます。

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パートプレート結合フィーダー細胞として使用されるNIH/3T3細胞を発現するCD40リガンドの準備を示しています：PBMCからヒトCD40活性化B細胞を生成するためのプロトコルは2つの部分に分かれています。パートBは、実際のCD40 - Bの文化を説明します。 フィーダー細胞のA.準備（tCD40L NIH/3T3） tCD40L NIH/3T3は完全にコンフルエントになることはありません接着マウス繊維芽細胞株、です。細胞は、そのため1週間に2回分かれています。以上の6週間以上の培養が推奨されていません。 <ol><li>滅菌ピペットを用いて初代培養から古い培地を除去し、1 × PBS 10 mLで細胞を洗浄。洗浄後PBSを吸引除去する。 </li><li> 37℃で5-10分は75 cm 2のフラスコに4 mLのトリプシン/ EDTAを追加℃に細胞を分離するために穏やかなタッピングを使用してください。 </li><li>野生型の培地10mLを加え、穏やかに回転さ。 </li><li>滅菌ピペットで50mLのチューブに細胞懸濁液を移し、5分間、225 × gで細胞をスピンダウン。 </li><li>上清を除去し、野生型の培地10mLにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液のアリコートの細胞数をカウントし、適切な数の細胞を3つの50 mLの試験管を準備します。 <ol><li>継代のための1.5 × 10 6細胞</li><li> 0.2 × 10 6細胞/ウェルCD40 - B細胞の培養に用いる照射</li><li>フリーズして残り（必要に応じて）。 </li></ol></li><li> 5分で225 × gで細胞をスピンダウン。 </li><li>上清を取り除く。 <ol><li>継代培養のために：再懸濁し、1.5 × 10 6細胞を75センチメートル2細胞培養フラスコ（細胞密度1.5 × 10 5細胞/ mL）10 mLの野生型媒体において、[0.7 mg / mLの] G - 418を追加し、で細胞をインキュベート37℃、5％CO 2とC。週2回のセルを分割する。 </li><li> CD40 - B細胞の培養には：1つの6ウェルプレート用1.2 × 10 6細胞を必要とする。 0.1 × 10 6細胞/ mLの密度で野生型の培地で細胞を再懸濁し、78 Gyの時にそれらを照射する。よくそれぞれ、37でそれらをインキュベート° C、5％のCO 2に細胞懸濁液のプレートを2mL。 tCD40L NIH/3T3細胞が接着のときB細胞の刺激のために、この準備のプレートを使用する（少なくとも4時間：顕微鏡による遵守を確認するには、B細胞の刺激を開始するために24時間以上待機しません）。 （bに進みます。） </li></ol></li></ol> B. CD 40 - Bの細胞培養 CD40刺激（0日）のための末梢血単核細胞のI.の準備： ご注意：あなたは、フィーダー細胞が接着していることを確かめる続行する前に。常に使用直前に増殖培地にインターロイキン-4およびシクロスポリンの新鮮なソリューションを追加します。 <ol><li>新鮮あるいは適切に融解したPBMCを、取る。再懸濁し、それらを洗浄し、他の細胞を除去するために7分間で190 × gで7分と二度目の256 × gで初めてスピンダウンするの1X PBS 50mLのに二回末梢血単核細胞。上清を捨て、PBS 20mLに細胞を懸濁します。細胞懸濁液の一定量の細胞数を決定します。 </li><li> 5分で225 xgで細胞の必要量をスピンダウン。 6ウェルプレート4の場合は× 10 6細胞/ウェルので、プレート当たり24 × 10 6細胞、必要とされています。 </li><li>上清を除去し、新鮮なT -細胞の伸長を防止するための成長因子としてのインターロイキン-4および0.63μg/ mLのシクロスポリンの50 U / mLで補ったCD40 - B培地で1 × 10 6細胞/ mLでPBMCを再懸濁します。 （与えられた濃度は1枚のMLの培地を参照してください！）。 </li><li> 6ウェルプレートtCD40L NIH/3T3細胞をプレインキュベートから上清を取り除く。 </li><li>ウェルあたり最初とCD40 - B洗浄培地2mlで2番目のステップで2mLのPBSで接着tCD40L NIH/3T3細胞を洗浄。 </li><li>穏やかに6ウェルプレートの各ウェルにPBMC懸濁液を4mL（1 × 10 6細胞/ mL）を追加します。 </li><li> 37細胞をインキュベート° C、5％のCO 2。 </li><li> 7日目に、細胞を（3.2に進みます。）reculture。 </li></ol> II。 CD40 - B細胞（7日目、その後3〜4日ごと）のRecultivati​​on： <ol><li> 50 mlチューブに10 mLのピペットとプール一緒に再懸濁することにより6 - ウェルプレートからCD40 - B細胞の収穫クラスター。 </li><li> 7分で225 × gでスピンダウンし、完全にCD40 - Bの洗浄媒体を使用して上清を交換してください。アリコートの細胞の量をカウントしながら、5分間、225 xgで細胞をスピンダウン。 1 × 10 6細胞/ mLの濃度でCD40 - B培地で再懸濁し、CD40 - B細胞。 </li><li>培地に50 U / mLおよび0.63μg/ mLのシクロスポリンの濃度のインターロイキン-4の新鮮なソリューションを追加。 </li><li> 6ウェルプレートtCD40L NIH/3T3細胞をプレインキュベートから上清を取り除く。 </li><li>よく最初とCD40 - B洗浄培地2mlで2番目のステップのあたり2mLのPBSで付着細胞を洗浄する。 </li><l私は&gt;静かに6ウェルプレートの各ウェルにCD40 - B懸濁液を4mL（1 × 10 6細胞/ mL）を追加します。 </li><li> 37プレートをインキュベート℃、5％のCO 2。 </li><li>継代培養細胞は、再び3〜4日ごとに14日間の合計の後に高純度のヒトCD40活性化B細胞で終わるために。 </li></ol> C.トラブルシューティング - 何かのCD40 - B細胞は増殖しないのですか？ <ol><li>あなたは、フィーダー細胞のCD40リガンド発現について確認しましたか？ </li><li>プレートに結合刺激のために使用されるフ​​ィーダー細胞は、24時間以上経過すべきではない？ </li><li>マイコプラズマ可能で汚染されていますか？ </li><li>補充のために使用されるインターロイキン- 4ソリューションは、新鮮に解凍し、適切な生物学的活性を有していた？ </li><li>シクロスポリン正しい濃度で添加されたのはいつですか？ </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="図1" /> 図1：してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">こちらをクリックして</a>図1の拡大版のために。 <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="図2" /> 図2：してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">こちらをクリックして</a>図2の拡大バージョンのために。

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

メディアのA.の準備： <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> フィーダー細胞の野生型媒体 </td><td colspan="2"> フィーダー細胞を選択培地 </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> DMEM -ハムの/ F12 </td><td></td><td> DMEM -ハムの/ F12 </td><td></td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 365μg/ mLの</td><td> L -グルタミン</td><td> 365μg/ mLの</td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mMの</td><td> HEPES </td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td></tr><tr><td></td><td></td><td> G - 418 </td><td> 0.7 mg / mLの</td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40 - Bの洗浄媒体 </td><td colspan="2"> CD40 - B培地 </td></tr><tr><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td><td> 試薬 </td><td> 濃度 </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L -グルタミン</td><td> 584μg/ mLの</td><td> L -グルタミン</td><td> 584μg/ mLの</td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 mMの</td><td> HEPES </td><td> 25 mMの</td></tr></tbody><tbody><tr><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td><td>ゲンタマイシン</td><td> 15μg/ mLの</td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RHトランスフェリン</td><td> 50μg/ mlの</td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> RHインスリン</td><td> 5μg/ mLの</td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB - Humanserum </td><td> 10パーセント</td></tr></tbody></table> B.その他の試薬： <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> オーダーNo </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / HamのF12 </td><td> PAA </td><td>猫番号：E15 - 813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td>インビトロジェンGIBCO ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td>ダルベッコPBS（10倍） </td><td> PAA </td><td>猫なしH15 - 011 </td></tr><tr><td> AB -ヒト血清</td><td>インビトロジェン</td><td>猫なし34005100 </td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン人間</td><td>シグマ</td><td>猫なしT0665 </td></tr><tr><td>ヒトインスリン</td><td>シグマ</td><td>猫なしI2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td>デルタの選択</td><td>アートなし7395800 </td></tr><tr><td>組み換えヒトインターロイキン-4 </td><td> Immunotools </td><td>猫なし11130045 </td></tr><tr><td>シクロスポリン</td><td>ノバルティス</td><td>猫なしNDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>ロンザ</td><td>猫なしDE14 - 802C </td></tr><tr><td> HEPESバッファー</td><td> PAA </td><td>猫なしS11 - 001 </td></tr><tr><td> G - 418硫酸</td><td> PAA </td><td>猫なしP02 - 012 </td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA（10倍） </td><td>インビトロジェンGIBCO ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C.その他の用品： <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> オーダーNo </td></tr><tr></tr><tr><td>滅菌ピペットチップ</td><td>ザルスタット</td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td> NUNC </td><td>猫なし140675 </td></tr><tr><td> 50mLのコニカルチューブ</td><td> BDファルコン™ </td><td>猫なし352070 </td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>ザルスタット</td><td>猫なし83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

ヒトcd40活性化b細胞の生成

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40活性化B細胞（CD40 - B細胞）癌免疫療法1-3免疫刺激抗原提示細胞（APC）の代替源として同定されている。樹状細胞（DC）、最も特徴的なAPCに比べて、CD40 - B細胞は、いくつかの異なる生物学的および技術的な性質を持っている。樹状細胞と同様に、B細胞はMHCと共刺激分子（図1b）の発現増加を示す、インターロイキン4およびCD40リガンド（CD40L）による刺激の後、強い遊走能と効率的にT細胞に存在する抗原提示を示す。しかし、未成熟または成熟DCとは対照的に、CD40 - B細胞はCD62L、CCR7/CXCR4から成る完全なリンパ節ホーミングトライアドを表現し、二次リンパ器官へのホーミングに必要な白血球機能抗原-1（LFA1、CD11a/CD18）、 （図1A）3。 CD40 - B細胞は、さらに高純度のCD40 - B健康なドナーからの細胞（患者あたり&gt; 10 9細胞）だけでなく、癌の非常に大量にin vitroで拡張することができる末梢血中の非常に少量から困難なしで生成することができます。患者（Fig.1c、D）1,4。 このプロトコルでは、ヒトPBMCから完全に活性化されたCD40 - B細胞を取得する方法を示します。細胞培養のための重要な分子は、CD40リガンド、インターロイキン-4（IL - 4）とシクロス​​ポリン（CSA）、3〜4日の文化のサイクルで補充されている。です。実験の目的のためにCD40刺激は、組換えヒトCD40リガンドを発現NIH/3T3細胞（tCD40L NIH/3T3）5によって提供されます。非トランスフェクト細胞の混入を避けるために、トランスフェクタントでヒトCD40リガンドの発現は、（図2）定期的にチェックする必要があります。 14日後にCD40 - B細胞の培養は、65日間にわたって95％以上の純粋なB細胞とCD40 - B細胞の増殖から構成されて関数1、4のいずれかを失うことなく頻繁に可能です。 CD40 - B細胞は、効率的に、プロセスを占有し、T細胞に存在する抗原6。彼らだけでなく、素数ナイーブを行うだけでなく、7,8メモリーT細胞を展開します。 CD40活性化B細胞はB細胞の活性化、分化と機能を研究するために使用することができます。また、彼らは腫瘍9に対する治療または予防接種のための有望なツールを表しています。

このビデオでは、提示<em&gt;生体外で</emヒトCD40活性化B細胞（CD40 - B）CD40リガンドとインターロイキン-4で刺激による末梢血単核細胞（PBMC）からの&gt;生成と展開。

ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40活性化B細胞（CD40-B細胞）は、がん治療における免疫刺激性抗原提示細胞（APC）の代替ソースとして同定されています...

こんにちは。私はアレクサンダー・シク・ファン・ハーゲンです。ケルン大学病院の免疫学および輸送免疫学研究室に所属しています。このビデオでは、末梢血単核細胞からヒトCD40活性化B細胞を生成する方法について説明します。当研究室の主な関心事の一つは、B細胞の抗体非依存的な機能の研究です。抗体産生細胞としての役割にとどまらず、B細胞は生理的条件下および自己免疫疾患の両方において、抗原提示細胞として重要な役割を担っています。活性化後、特にCD40を介して活性化された場合、B細胞は強力な抗原提示能および免疫刺激能を獲得することがあります。CD 40。活性化B細胞は、樹状細胞と比較していくつかの利点があります。これらは、がん患者からであっても、少量の末梢血から比較的低コストで容易に増殖させることが可能です。それでは、博士課程の学生であるTanya Leicと技術者のLERが、末梢血からヒトCD 40活性化B細胞を生成する方法をステップバイステップで紹介します。こんにちは、Tanya Liviです。私は博士課程の学生で、ここではヒトCD 40活性化B細胞の生成方法について実演します。この手順は当研究室で最適化されました。主な工程は、まずフィーダー細胞の調製です。そのため、ヒトCD 40リガンドを導入したNIH 3T3細胞を用い、これに78 Grayの放射線を照射して6ウェルプレートに播種します。次に、精製したPBMCから、ヒトCD 40活性化B細胞の培養を開始します。これらの細胞をヒトインターロイキン4およびシクロスポリンAで処理した後、6ウェルプレートのフェタセル上に播種します。この手順を7日目に行い、その後は細胞培養の14日目まで3〜4日ごとに繰り返します。高純度のヒトCD 40活性化B細胞を得るため、CD 40活性化B細胞の作製は、精製した直後または適切に解凍したヒトPBMCを用いて開始します。まず、PBMCを2回洗浄します。そのためには、細胞を50 mLのPBSに再懸濁してください。PBMCを1300 RPM（260 ×gに相当）で7分間遠心分離します。この後、上清を除去し、細胞を再び50 mLのPBSに懸濁し、1100 RPM（190 ×gに相当）で再度7分間遠心分離します。さらに上清を除去し、細胞数を算出して再懸濁を行います。PBMCを20 mLのPBSに懸濁し、ボルテックスで細胞を十分に混合した後、細胞数を計測します。CD40B培養に必要な量のPBMCを、1200 RPM（220 ×g）で5分間遠心分離して回収します。6ウェルプレートを使用する場合、1ウェルあたり4 × 10⁶個、プレート全体で24 × 10⁶個の細胞が必要です。次に、PBMCをCD 40 B培養培地を用いて1×10⁶ cells/mLに再懸濁します。刺激のために、新鮮なヒトIL-4を50 units/mLの濃度で、またT細胞の増殖を抑制するためにシクロスポリンAを0.63 µg/mLの濃度で細胞懸濁液に添加します。これで、PBMC懸濁液をCD 40リガンドで刺激する準備が整いました。我々の知る限り、現在、機能的なGMPグレードのSOMAL CD 40リガンドは入手できません。そのため、NIH 3T3細胞株は培養内で数ヶ月間生存可能であることから、細胞の生存、分化、および増殖を刺激するために、ヒトCD 40リガンドを導入したNIH 3T3細胞を使用します。CD 40リガンドの発現消失については、定期的に確認して除外する必要があります。CD 40 ligandをトランスフェクトしたNIH 3T3は、接着性細胞株であり、0.7 mg/mLのG 4 1 8を添加した選択培地を用いて、37 °C、5% CO2の条件下で培養します。この接着性線維芽細胞株は、完全にコンフルエントになってはいけないため、週に2回継代する必要があります。接着細胞を継代するには、培地を吸引し、10 mLのPBSで1回洗浄した後、緩やかにスウィベルさせます。再び培地を吸引し、75 cm²フラスコに4 mLのトリプシンEDTAを加えます。フラスコをインキュベーター内で37°C、5〜10分間インキュベートします。その後、フラスコを取り出します。軽く叩くことで、細胞をプラスチック面から剥離させます。次に、10 mLの野生型培地を加え、緩やかに回転させて撹拌し、細胞を50 mLチューブに移します。NA83T3細胞を1200 RPM（125Gに相当）で5分間遠心分離します。沈殿した細胞を10 mLの野生型培地で慎重に再懸濁します。N IH 33 サブカルチャーの細胞数を測定し、1.5 × 10⁶ 個のフィーダー細胞を 10 mL の野生型培地で再懸濁します。これらを 75 cm² フラスコに移し、ネオマイシン耐性遺伝子を持つ形質導入細胞を選択するため、G 4 1 8 を 0.7 mg/mL の濃度で添加します。最後に、CD 40 B 刺激のため、フィーダー細胞を 37 °C、5% CO2 の条件下でインキュベートします。残りのNI 8 3 3細胞を、増殖を停止させるため78 Gyで致死照射します。照射したフィーダー細胞を、細胞密度 0.1 × 10⁶ cells/mL となるようにwire type mediumで希釈し、6ウェルプレートに1ウェルあたり2 mLずつ分注します。CD40リガンドによるBリンパ球の刺激にフィーダー細胞として使用する前に、37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートし、6ウェルプレート上の細胞を再び接着させます。顕微鏡下で、前日に播種したフィーダー細胞が接着しているか確認します。フィーダー細胞が接着していれば、各ウェルからSUP natinを除去し、速やかに2回洗浄します。まず、各ウェルを2 mLのPBSで洗浄し、次にさらに2 mLで洗浄します。PBMC懸濁液の刺激に使用するCD40B洗浄培地。フィーダー細胞に対し、細胞密度1×10⁶ cells/mLとなるように直前に調製する。その際、細胞懸濁液を各4 mLずつ緩やかに移送する。7日目に、プレートを37°C、5% CO2条件下でインキュベートします。CD40 B細胞は、7日目に活性化されたB細胞の最初の継代後、3〜4日ごとに継代培養することが可能です。6穴プレートから、リサスペンションにより凝集した細胞を緩やかに回収し、10 mLのピペットで懸濁させます。CD40 B細胞を50 mLチューブに回収します。CD40 B cellsを、1200 RPM（220 ×gに相当）で7分間遠心分離します。培地をCD 40 B細胞洗浄用培地と交換し、CD 40活性化B細胞の細胞数を測定します。CD 40 B細胞をCD 40 B細胞培養培地で1×10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁します。次に、刺激のために、50 units/mL濃度の新鮮なヒトIL-4および0.63 µg/mL濃度のシクロスポリンAを細胞懸濁液に添加します。前日に調製した放射線照射フィーダー細胞を使用します。もちろん、放射線照射フィーダー細胞については、使用直前に顕微鏡下で接着状態を再度確認する必要があります。細胞が付着している場合は、以前と同様に、まず1回PBSで、次にCD 40 B洗浄用培地で、フィダー細胞を迅速に2回洗浄します。その後、1 × 10⁶ cells/mLに調整したCD 40 B懸濁液を、6ウェルプレートの各ウェルに4 mLずつ注意深く分注します。この継代操作を3〜4日ごとに週2回同様に繰り返し、培養14日目に高純度のヒトCD 40活性化B細胞の細胞クラスターを得ます。現時点で、CD 40 B細胞は、CD 80、CD 86、CD 83、MHC分子などの共刺激分子、およびいわゆるリンパ節ホーミング三者集団であるCD 62リガンド、CCR7、LFA-1を発現しています。これらは、生成過程においてフローサイトメトリーにより確認することが可能です。トラブルシューティングについては、本プロトコルのテキスト版をご参照ください。将来的には、CD 40活性化B細胞ががん免疫療法の重要なツールとなることが期待されます。実験の成功をお祈りいたします。

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まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

通常記憶 B 細胞の長命の形質細胞への分化モデル

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。...

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

学ぶヒトCD40活性化B細胞の生成法。末梢血単核球からCD40リガンドとインターロイキン-4で刺激し、抗体非依存的なB細胞機能と抗原提示能を研究するための細胞培養技術を習得できます。

ヒトCD40活性化B細胞の生成

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